一种腐植酸降解菌株及其筛选与应用方法
【专利摘要】本发明公开了一种腐植酸降解菌株，该菌株分离自某自来水厂生物活性炭滤池。为一株食酸菌（Acidovoraxsp.），菌株保藏号为：CGMCC?No.6564，2012年9月20日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏。所述的一种腐殖酸降解菌株，其特征是将其应用于含腐植酸的微污染水的处理中。处理方法为：挑取此菌落，扩大培养后制成菌悬液，调节OD600为0.6，按体积比为1%的比例接种于腐植酸微污染水中，其对腐植酸初始浓度为15mg/L的微污染水COD的去除率为33.8%，UV254的去除率为48.1%。研究腐植酸初始浓度、pH、温度这三个因素对该菌降解性能的影响后发现腐植酸初始浓度为20mg/L，反应温度为35℃时，能更好地发挥其对腐植酸的降解性能；微污染水呈酸性有利于该菌生长，促进其对腐植酸的降解。
【专利说明】一种腐植酸降解菌株及其筛选与应用方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种腐植酸降解菌株的筛选与应用方法，所述菌株可应用于含腐植酸的微污染水的处理，属于利用微生物对污水治理的【技术领域】。
【背景技术】
[0002]天然有机物(natrual organic matter)是一类在天然水源中普遍存在的有机物质，主要包括腐殖质、氨基酸、碳水化合物等。其中腐植质在地面水源中含量很高，是饮用水处理中主要的去除对象。腐殖质在水中的形态主要分为腐植酸和富里酸。腐植酸(humicacid)是一类结构复杂的大分子有机物质，它含有多种官能团，如酚羟基、羧基、酮型羰基等。在一般水源水中含量为10mg/L左右，占水中有机物质比例的50%-90%。腐植酸极易在水厂加氯过程中形成消毒副产物和三卤甲烷，在某些地域引起大骨节病，此外，腐植酸类物质的存在会使水中微污染物产生化学性质发生变化。腐殖酸类物质也会刺激病原微生物的生长。故其在水中的存在是饮用水处理中的重大难题。
[0003]目前，关于腐植酸的去除方法主要是物理和化学方法。利用自然界存在的微生物对腐植酸等难降解有机物进行生物降解，具有其它方法不可替代的优势。大量的资料调研结果表明，微生物对有机污染物的降解对环境造成的负面影响小。因此针对腐植酸这种目标污染物，筛选获得高效降解的微生物，并研究影响其降解性能的因素，具有十分重要的意义。
【发明内容】
[0004]本发明的目的在于:[I]提供一种腐植酸降解菌株；[2]为所述腐植酸降解菌提供一种筛选方法；[3]提供所述腐植酸降解菌的应用方法。
[0005]本发明所提供的腐植酸降解菌，自某自来水厂生物活性炭滤池中采集的生物活性炭上分离筛选得到。该菌株为一株食酸菌sp.),菌株保藏号为:CGMCCN0.6564,2012年9月20日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏。
[0006]所述的腐殖酸降解菌，其特征在于该菌株在驯化培养基上，30°C下培养7天，菌落凸起，光滑有光泽，呈米色。扫描电子显微镜下观察其形态为杆状。
[0007]本发明提供的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤:
(O从采集得到的生物活性炭上分离出生长形态不同的细菌；
(2)对分离得到的细菌通过含不同浓度腐植酸的驯化培养基1-1II进行梯度培养驯
化；
驯化培养基1:牛肉膏0.lg，蛋白胨0.2g，氯化钠0.lg，腐植酸0.005g，琼脂20g，pH 7.0,蒸馏水IOOOmL ;驯化培养基I1:牛肉膏0.0lg,蛋白胨0.02g,氯化钠0.0lg,腐植酸0.0lOg,琼脂20g, pH 7.0,蒸馏水IOOOmL ;驯化培养基II1:腐植酸0.015g,琼脂20g, pH7.0，蒸馏水1000mL。将分离得到的细菌由驯化培养基I _ III的梯度转接培养，使细菌得到驯化进而适应腐植酸存在的贫营养环境。以细菌在驯化培养基III上的生长情况作为初筛依据，筛选得到5种生长速度快、菌苔大而密集的菌株，依次编号为F1、F2、F3、F4、F5。
[0008](3)将上述5株细菌投加入腐植酸微污染水中，以CODs^UV254为评价指标，评价菌对腐植酸的降解性能，进一步筛选出具有较好降解效果的腐植酸降解菌。[0009]本发明提供的应用方法是将所述菌株应用于含腐植酸的微污染水的处理；处理方法为:挑取此菌落，扩大培养后制成菌悬液，调节0D600 (光学密度600)为0.6，按体积比为1%的比例接种于腐植酸微污染水中，测定COD、UV254 ;本发明中的腐植酸降解菌对腐植酸初始浓度为15mg/L的微污染水COD的去除率为33.8%，UV254的去除率为48.1% ;本发明中的腐植酸降解菌在腐植酸初始浓度为20mg/L，反应温度为35°C时，微污染水呈酸性时能更好地降解腐植酸。
【专利附图】
【附图说明】
[0010]图1为初筛得到的5株细菌对水样COD的去除率。
[0011]图2为初筛得到的5株细菌对水样UV254的去除率。
[0012]图3为腐植酸降解菌的SEM扫描电镜图。
[0013]图4为腐植酸初始浓度对腐植酸降解菌降解性能的影响。
[0014]图5为不同pH对腐植酸降解菌降解性能的影响。
[0015]图6为不同温度对腐植酸降解菌降解性能的影响。
【具体实施方式】
[0016]现将本发明的具体实施例叙述如下。
[0017]—、一种腐植酸降解菌株的筛选方法
(一)材料准备
1、菌源和菌采集环境
(1)菌源上海市某自来水厂生物活性炭滤池；
(2)采集环境生物活性炭滤池底标高0.75 m，承托层厚0.55 mm，活性炭层厚1.5 m，炭层顶标高为1.30 m，设滤层淹没水深1.00 m，滤池内设计水位2.30 m。池底采用大阻力配水系统，水冲洗强度8~12 L/m2.s,滤料膨胀率控制在33%。目前活性炭单层滤料厚度1500mm ,滤速9.6 m/h,接触时间为9.4 min。
[0018]2、腐植酸微污染水配制
腐植酸上海巨枫化学科技有限公司，嘉善巨枫化工厂生产。批号:100301 ;水分5%;灼烧残渣5% ;氯化物0.05% ;硫酸盐0.05%。
[0019]腐植酸储备液:称取Ig腐植酸，用Imol/LNaOH溶解，自来水稀释定容至IOOOmL,调整pH为7.0，避光保存。
[0020]腐植酸微污染水:取15mL腐植酸储备液，自来水稀释并定容至1000mL。
[0021]3、培养基
富集培养基:牛肉膏5g，蛋白胨10g，氯化钠5g，pH 7.0,蒸馏水1000mL。
[0022]驯化培养基1:牛肉膏0.lg，蛋白胨0.2g，氯化钠0.lg，腐植酸0.005g，琼脂20g, pH 7.0,蒸馏水 IOOOmL0
[0023]驯化培养基I1:牛肉膏0.0lg,蛋白胨0.02g,氯化钠0.0lg,腐植酸0.0lOg,琼脂20g, pH 7.0，蒸馏水 IOOOmL0
[0024]驯化培养基II1:腐植酸0.015g,琼脂20g，pH 7.0,蒸馏水lOOOmL。 [0025]以上培养基分别于121°C高压灭菌20min后备用。
[0026]4、实验仪器和设备
恒温振荡器；
光照生物培养箱；
蒸汽灭菌锅；
超声波清洗机；
光学显微镜；
超净工作台；
便携式pH计；
循环水式真空泵；
UV-4802双光束紫外可见分光光度计；
PCR反应扩增仪(加拿大BBI公司)；
3730测序列分析仪(美国ABI公司)；
Sff-CJ-1D洁净工作台(江苏苏洁净化设备厂)；
DK-8D型电热恒温水槽(上海森信实验仪器有限公司)；
DYY-8型稳压稳流电泳仪(上海琪特分析仪器有限公司)；
YXJ-2离心机(湘仪离心机仪器有限公司)；
H6-1微型电泳槽(上海精益有机玻璃制品仪器厂)；
凝胶成像系统(Gene Genius公司)；
U-3010紫外-可见分光光度计(Hitachi公司)；
移液器(范围 IOO-1OOOml，20-200ml，0.5-lOml)(加拿大 BBI 公司)；
(二)腐植酸降解菌的分离与筛选 1、菌的分离
取生物活性炭样品5 g，置于装有IOOmL无菌水的250mL无菌锥形瓶中，用均质器震荡30 min,使生物活性炭上的生物膜脱落进入水中，形成混合菌液。
[0027]将上述混合菌液进行浓度梯度稀释，取ImL经稀释后的菌液加到40mL已凝固的营养琼脂培养基上，用涂布棒快速涂布均匀，于30°C培养2d，挑取生长形态不同的菌落进行纯化，并编号。
[0028]2、菌悬液的配制
将细菌富集培养液离心集菌，用生理盐水洗菌3次，加入无菌水调整菌悬液光密度值0D600为0.6，待筛选时备用。
[0029]3、菌的筛选
通过将细菌由驯化培养基1-1II的梯度转接培养，使细菌得到驯化从而适应腐植酸存在的贫营养环境。以细菌在驯化培养基III上的生长情况作为初筛依据，具体方法如下:将分离得到的菌接种在驯化培养基I上，培养ld，挑取培养基I上长出的菌转接入驯化培养基II中，培养3d，挑取II上的菌转接入III培养基，培养7d，观察菌在III培养基上的生长情况，从中筛选出生长速度快、菌斑大的5株细菌，分别编号为Fl，F2，F3，F4，F5。[0030]将上述5株细菌制成菌悬液，按1%的体积比投加入腐植酸微污染水中，以COD.UV254为评价指标，评价菌对腐植酸的降解性能，从中筛选出具有较好降解效果的腐殖酸降解菌。
[0031](三)腐植酸降解菌的鉴定
1、菌株形态观察
菌落凸起，光滑有光泽，呈米色。
[0032]将扩大培养的腐植酸降解菌菌悬液进行固定、脱水等预处理后，冷冻干燥48h，得到粉末，经过喷金加工后，于JSM-6700F高分辨扫描电子显微镜下放大10000倍观察细菌形态。
[0033]2、鉴定
对筛选得到的腐植酸降解菌进行16S rDNA基因测序，将得到的基因序列登陆NCBI(National Center of Biotechnology Information)数据库，结果显不其与 --/orararsp.MN33.2的同源性为99%。根据如附图3所示的形态及鉴定得到的序列特征，该菌为杆状食酸菌 dii/oraraz sp.)。
[0034]二、腐植酸降解菌的应用
将所述的腐植酸降解菌扩大培养，将其富集培养液离心集菌，用生理盐水洗菌3次，加入无菌水调整菌悬液光密度值0D600为0.6，以1%的比例投加到含腐植酸的微污染水中。
[0035]将腐植酸降解菌接种于富集培养基中，30°C培养24h，制成菌悬液，以1%的接种量接入腐植酸浓度为15mg/L的腐植酸微污染水中评价其对腐植酸的降解效果。如图1和2所示，反应时间为24h后，其对腐植酸初始浓度为15mg/L的微污染水COD的去除率为33.8%，UV254的去除率为48.1%。
[0036]三、腐植酸降解菌降解性能的影响因素
取腐植酸初始浓度、PH和温度作为影响腐植酸降解菌降解效果的主要因素，以COD为指标，评价这些因素的影响。
[0037]1、腐植酸初始浓度
将腐植酸降解菌菌悬液以1.0%的比例投加到不同浓度的腐植酸微污染水中，腐植酸浓度分别为5mg/L、10mg/L、15mg/L、20mg/L，水样pH均为7.0，于20°C反应24h和48h，测定COD。
[0038]2、pH
设置水样pH分别为3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0，将腐植酸降解菌菌悬液以1.0%的比例投加到腐植酸浓度为15mg/L的腐植酸微污染水中，于20V反应24h和48h，测定C0D。
[0039]3、温度
设置反应温度分别为20°C、25°C、30°C、35°C、40°C，将腐植酸降解菌菌悬液以1.0%的比例投加到pH为7.0且腐植酸浓度为15mg/L的腐植酸微污染水中，反应24h和48h，测定C0D。
[0040]研究腐植酸初始浓度、pH、温度这三个因素对腐植酸降解菌降解性能的影响结果如图4-6所示，当腐植酸初始浓度为20mg/L，反应温度为35°C时，该菌更能发挥其对腐植酸的降解性能；微污染水呈酸性有利于这种食酸菌的生长，促进其对腐植酸的降解。
[0041]本发明分离、筛选出的菌株，为一株食酸菌Uciifowraz sp.)，其具有降解腐植酸的功能。这能拓宽人们对食酸菌在其功能方面应用研究思路，并为降解腐植酸提供有用的菌源和技术，具有较强的实 际应用价值。
【权利要求】
1.一种腐植酸降解菌株，其特征在于该菌株是从上海市某自来水厂生物活性炭滤池的生物活性炭上分离获得；该菌株为一株食酸菌sp.)，菌株保藏号为:CGMCCN0.6564,2012年9月20日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏。
2.如权利要求1所述的一种腐殖酸降解菌株，其特征在于该菌株在驯化培养基上，30°C下培养7天，菌落凸起，光滑有光泽，呈米色；扫描电子显微镜下观察其形态为杆状。
3.一种腐植酸降解菌株的筛选方法，其特征在于包括以下步骤: 从采集得到的生物活性炭上分离出生长形态不同的细菌； 对分离得到的细菌通过含不同浓度腐植酸的驯化培养基1-1II进行梯度培养驯化； 驯化培养基1:牛肉膏0.lg，蛋白胨0.2g，氯化钠0.lg，腐植酸0.005g，琼脂20g，pH 7.0,蒸馏水IOOOmL ;驯化培养基I1:牛肉膏0.0lg,蛋白胨0.02g,氯化钠0.0lg,腐植酸0.0lOg,琼脂20g, pH 7.0,蒸馏水IOOOmL ;驯化培养基II1:腐植酸0.015g,琼脂20g, pH7.0，蒸馏水IOOOmL ;将分离得到的细菌由驯化培养基1-1II的梯度转接培养，使细菌得到驯化进而适应腐植酸存在的贫营养环境；以细菌在驯化培养基III上的生长情况作为初筛依据，筛选出5株生长速度快、菌斑大的细菌，依次编号为？1、？2、？3、？4、？5 ； 将上述5种菌株投加入腐植酸微污染水中，以CODs^UV254为评价指标，评价菌对腐植酸的降解性能，进一步筛选出具有较好降解效果的腐植酸降解菌。
4.一种腐植酸降解菌株的应用方法，其特征在于所述菌株应用于含腐植酸的微污染水的处理中；处理方法为:挑取此菌落，扩大培养后制成菌悬液，调节0D600为0.6，按体积比为1%的比例接种于腐植酸微污染水中，测定C0D、UV254 ;本发明中的腐植酸降解菌对腐植酸初始浓度为15mg/L的微污染水COD的去除率为33.8%，UV254的去除率为48.1% ;本发明中的腐植酸降解菌在腐植酸初 始浓度为20mg/L，反应温度为35°C时，微污染水呈酸性时能更好地降解腐植酸。
【文档编号】C12N1/20GK103468598SQ201210440327
【公开日】2013年12月25日 申请日期:2012年11月7日 优先权日:2012年11月7日
【发明者】沈海桦, 丁国际, 万哲希, 陈斯芝, 张晶 申请人:上海大学