预防和治疗水禽h9亚型禽流感的疫苗及其制备方法和应用的制作方法

预防和治疗水禽h9亚型禽流感的疫苗及其制备方法和应用的制作方法
【专利摘要】本发明提供了一种预防和治疗水禽H9亚型禽流感的疫苗及其制备方法，该疫苗包括免疫量的H9亚型禽流感病毒灭活全病毒和佐剂，该疫苗通过将H9亚型禽流感病毒灭活，加入佐剂，乳化得到，该疫苗产生的抗体滴度高，且产生速度快，表明具有良好的免疫原性地，最重要的是可用于水禽H9亚型禽流感感染的预防和治疗。
【专利说明】预防和治疗水禽H9亚型禽流感的疫苗及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种预防水禽H9亚型禽流感病毒感染的疫苗及其制备方法，属于兽医疫苗领域。
【背景技术】
[0002]禽流感(Al)是由正粘病毒科A型流感病毒引起禽类及其他鸟类的一种感染和/或疾病综合征，其中的H9亚型禽流感病毒从1994年在我国首次被分离鉴定以来，已在我国多数养禽地区有流行，并且常与其他病原体并发和继发感染，给我国的养禽业造成了巨大的经济损失。该病毒主要侵害陆生禽类，在水禽通常造成无症状感染，并在偶然情况下可以传播给人，引起轻微症状。然而，最近几年，H9亚型禽流感感染水禽并导致发病的报道逐渐增多，并且水禽作为禽流感病毒的储存宿主，在感染禽流感病毒以后，允许禽流感病毒在体内存在较长时间并复制，进而将病毒传播给临近的陆生禽类(包括鸡、鹌鹑等)和哺乳动物(如猪、人等)，引起其发病。因此控制水禽H9亚型禽流感病毒的感染具有重要意义。
[0003]目前，对于家禽H9亚型禽流感感染的预防主要是使用H9亚型禽流感病毒制备的全病毒油乳剂灭活疫苗，但是已经商品化的疫苗所用的疫苗株全部是从鸡中分离得到，但这些疫苗用于水禽后，存在着抗体产生速度慢、抗体效价不高等缺点。如CN101843900A中公开的H9亚型禽流感灭活疫苗，可以用于预防鸡H9亚型禽流感病毒的感染，但不能用于鸭H9亚型禽流感感染的预防。因此寻找到一株对水禽具有较高的适应性、能够诱导水禽产生高效价抗体的疫苗株就成为了预防水禽H9亚型禽流感病毒感染的关键。而且H9亚型禽流感病毒的主要抗原基因——HA基因变异非常快，导致已有的疫苗株与当前的流行株的抗原性产生了较大的差异。因此，一直以来也没有筛选获得合适的病毒株作为疫苗株制备预防水禽禽流感的疫苗。

【发明内容】

[0004]发明人从发病鸭场中获得的H9亚型禽流感病毒，所述H9亚型禽流感病毒具有特别高的免疫原性，使用所述H9亚型禽流感病毒作为抗原制备的油乳剂灭活疫苗，不仅具有良好的免疫原性，还具有抗体滴度高，且产生速度快的特点，可有效用于水禽(如鸭、鹅)H9亚型禽流感感染的预防。
[0005]本发明提供了一种H9亚型禽流感病毒，所述病毒HA基因编码的氨基酸序列包含如图1所示的具有131-K、224-M、253-1和377-E4个氨基酸取代位点。
[0006]优选地，所述H9亚型禽流感病毒还包含127-S、129-Y、147-T、152-S、188-W和216-D6个保守的氨基酸位点。
[0007]优选地,本发明提供了 一种H9亚型禽流感病毒(Avian Inf luenzavirus) Dl株,分类命名为禽流感病毒H9亚型Dl株，拉丁文学名为Aviarius Influenza,保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC)，地址为中国武汉?武汉大学，保藏日期为2012年6月14日，保藏号为CCTCC NO:V201226 ;本发明还提供了一种H9亚型禽流感病毒YZG4株，分类命名为禽流感病毒H9亚型YZG4株,拉丁文学名为Aviarius Influenza,保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC)，地址为中国武汉?武汉大学，保藏日期为2012年6月14日，保藏号为 CCTCC NO:V201227o
[0008]本发明提供了一种DNA序列，所述序列实质上编码含有SEQ.N0.2的氨基酸序列；所述SEQ.N0.2为禽流感毒Dl株HA蛋白11-570位的氨基酸序列。
[0009]本发明提供了一种DNA序列，所述序列实质上含有SEQ.N0.1的核酸序列；所述SEQ.N0.1为禽流感毒Dl株HA基因34-1713位的核酸序列。
[0010]本发明中的术语“实质上含有”是指本发明的基因或多肽在保持其功能的范围内，序列号I的核酸序列，序列号2的氨基酸序列可以发生置换、插入或缺失等变异。
[0011]本发明提供了一种HA抗原蛋白，所述HA抗原蛋白包含如图1所示的具有131-K、224-M、253-1 和 377-E4 个氨基酸取代抗原位点和 127-S、129-Υ、147-T、152-S、188-W 和216-D6个保守的氨基酸抗原位点的H9亚型禽流感病毒HA共有序列。
[0012]因此，本发明的第二方面在于提供一种用于预防和治疗H9亚型禽流感的疫苗，所述疫苗包括病毒HA基因编码的氨基酸序列包含如图1所示的具有131-K、224-M、253-1和377-E4个氨基酸取代位点和127-S、129-Υ、147-T、152-S、188-ff和216-D6个保守的氨基酸位点的全病毒抗原和佐剂。
[0013]优选的，所述的H9亚型禽流感病毒为Dl株，所述灭活全病毒含量为灭活前107.67~l(f67EID5Q/0.1rnl ;所述佐剂为油佐剂。
[0014]本发明所述的H9亚型禽流感灭活疫苗中，所述抗原为H9亚型禽流感病毒接种易感鸡胚后所收获的胚液灭活而成。
[0015]所述抗原为用保藏号为CCTCC NO:V201226的H9亚型禽流感病毒接种易感鸡胚后得到的胚液，然后用94~96体积的胚液灭活得到的。所述胚液中H9亚型禽流感病毒含量为 IO7.67 ~108 67EID5Q/0.1ml。
[0016]优选地，所述的H9亚型禽流感病毒为YZG4株；所述佐剂为油佐剂。
[0017]同时，本发明的第三方面在于提供一种疫苗组合物，所述疫苗组合物包括免疫量的H9亚型禽流感病毒灭活全病毒，还包括免疫量的其它抗原，其它抗原选自新城疫病毒抗原、鸭痕病毒抗原、鸭巴氏杆菌抗原、鸭黄病毒抗原以及鸭疫里默氏杆菌抗原的一种或几种。
[0018]优选地，所述附加抗原为鸭瘟病毒灭活全病毒。
[0019]优选地，所述H9亚型禽流感病毒为Dl株，所述鸭瘟病毒为AV1221株，所述鸭瘟病毒AV1221株保藏号为CGMCC N0.2268 ;所述佐剂为油佐剂。
[0020]优选地，所述的H9亚型禽流感病毒Dl株灭活全病毒含量为灭活前IO7 67~10867EID50/0.1ml ;所述鸭瘟病毒AV1221株灭活全病毒含量为灭活前IO47~105 8ELD5(i/0.2ml ;所述H9亚型禽流感病毒Dl株灭活全病毒与所述鸭瘟病毒AV1221株灭活全病毒体积比为24~48体积份:48~72体积份；所述佐剂为油佐剂。
[0021]本发明所述的疫苗组合物中，所述的H9亚型禽流感病毒液灭活抗原为H9亚型禽流感病毒接种易感鸡胚后所收获的胚液灭活而成；所述的鸭瘟病毒液灭活抗原为鸭瘟病毒接种易感鸭胚后所收获的胚液灭活而成。所述疫苗组合物中，H9亚型禽流感病毒液灭活抗原体积比为9.6~19.2%，鸭瘟病毒液灭活抗原体积比为19.2~28.8%。最优选的，所述H9亚型禽流感病毒接种鸡胚后所收获的胚液中，H9亚型禽流感病毒的病毒含量为IO7 67~108_67EID5(i/0.1ml ;所述鸭瘟病毒接种易感鸭胚后所收获的胚液中，鸭瘟病毒的病毒含量为IO47 ~105_8ELD5(i/0.2ml。
[0022]更优选地，本发明所述的H9亚型禽流感灭活疫苗以及鸭瘟、禽流感(H9亚型)二联灭活疫苗中，还含有佐剂。优选地，所述佐剂为注射用白油、司本-80、硬脂酸铝和吐温-80。
[0023]本发明的再一目的是提供一种制备所述H9亚型禽流感灭活全病毒疫苗的方法，所述方法包括:将所述H9亚型禽流感病毒灭活，加入佐剂，乳化得到所述H9亚型禽流感灭活全病毒的疫苗。
[0024]此外，本发明还提供了上述H9亚型禽流感灭活疫苗的制备方法，包括以下步骤，将保藏号为CCTCC NO:V201226的H9亚型禽流感病毒，或HA蛋白至少具有131_K、224_M、253-1和377-E等4个变异的氨基酸位点的H9亚型禽流感病毒，灭活后加入佐剂，即可获得H9亚型禽流感灭活疫苗。
[0025]疫苗还可以包括其他抗原，如新城疫病毒抗原、鸭瘟病毒抗原、鸭巴氏杆菌抗原、鸭黄病毒抗原以及鸭疫里默氏杆菌抗原等。
[0026]本发明的再一目的是提供一种制备包含所述鸭瘟灭活全病毒和H9亚型禽流感灭活全病毒疫苗组合物的方法，所述方法包括:将所述H9亚型禽流感病毒Dl株和所述鸭瘟病毒AV1221株分别灭活，按所述比例混合，加入佐剂，乳化得到所述鸭瘟灭活全病毒和H9亚型禽流感灭活全病毒的疫苗组合物。
[0027]优选地，本发明所述的H9亚型禽流感灭活疫苗的制备方法中，所述步骤为:将下述油相和水相按照(1.5~3): I的体积比混合制成乳剂；所述水相按照如下方法制备:将94~98体积份的保藏号为CCTCC NO:V201226的H9亚型禽流感病毒的病毒液灭活后，加入无菌吐温-802~6体积份，混匀后得到水相；所述油相按下述方法制备:按注射用白油92~96容量份、司本-804~8容量份和硬脂酸招I~2重量份的比例配制油相；所述体积份:重量份=ml: go所述的鸭痕、禽流感(H9亚型)二联灭活疫苗的制备方法中,所述步骤为:将下述油相和水相按照(1.5~3): I的体积比混合制成乳剂；所述水相按照如下方法制备:将24~48体积份的保藏号为CCTCCNO:V201226的H9亚型禽流感病毒的病毒液和48~72体积份的保藏号为CGMCC N0.2268的鸭瘟病毒液分别灭活后混合，加入无菌吐温-802~6体积份，混匀后得到水相；所述油相按下述方法制备:按注射用白油92~96容量份、司本-804~8容量份和硬脂酸铝I~2重量份的比例配制油相；所述体积份:重量份=ml: g。
[0028]由上可见，本发明提供了一种H9亚型禽流感病毒和一株H9亚型禽流感病毒Dl株在制备预防或治疗水禽H9亚型禽流感病毒感染的疫苗中应用，另外还提供了上述病毒作为抗原制备的H9亚型禽流感灭活疫苗和鸭瘟、禽流感(H9亚型)二联灭活疫苗及制备方法。
[0029]本发明进一步提供了所述预防和治疗H9亚型禽流感的疫苗在预防和治疗H9亚型禽流感方面的应用。
[0030]优选地，本发明所述的应用为治疗水禽禽流感的应用。[0031]本发明进一步提供了所述预防和治疗鸭瘟和H9亚型禽流感的疫苗组合物在预防和治疗鸭瘟以及H9亚型禽流感方面的应用。
[0032]技术效果
[0033]1.在养殖鸭场中获得的所述H9亚型禽流感病毒毒株，具有良好的免疫原性，之前，H9亚型禽流感病毒通常是通过在鸡场中分离鸡的H9亚型禽流感病毒，并在鸡胚中培养病毒。因此，在本发明之前，一直也没有获得在水禽中，如鸭、鹅等预防或治疗H9亚型禽流感的合格疫苗。而本发明则使用2009年从发病鸭场分离的H9亚型禽流感病毒，并制备了油乳剂灭活疫苗，所述疫苗可以很好地用于水禽亚型禽流感感染的预防和治疗。
[0034]2.本发明制备的H9亚型禽流感灭活疫苗，使用0.5ml的使用剂量免疫鸭后，在免后7天，血清中H9亚型HI抗体滴度的几何平均值即可达到7.81og2 (I: 223)以上，抗体滴度高，且产生速度快，表明所述毒株具有良好的免疫原性。
[0035]3.本发明制备的鸭瘟、禽流感(H9亚型)二联灭活疫苗，使用0.5ml的剂量免疫鸭后，在免后7天，血清中H9亚型HI抗体滴度的几何平均值即可达到7.81og2 (I: 223)以上，抗体滴度高，且产生速度快，在免后10天，即可对鸭瘟强毒NJ株的攻毒产生80 %的保护，免后14天可产生完全保护，抗体产生速度快。
[0036]4.本发明的水禽用禽流感(H9亚型)灭活疫苗，抗体产生速度快，抗体效价高，安全性好，保存、运输(2~8°C )和使用方便，免疫效果稳定。
[0037]5.本发明的鸭瘟、禽流感(H9亚型)二联灭活疫苗，抗体产生速度快，免疫保护效果好，安全性好，保存 、运输(2~8°C )和使用方便，免疫效果稳定。
【专利附图】

【附图说明】
[0038]图1是Dl株和YZG4株的HA基因氨基酸序列与现有技术中SS株和SD696株的HA基因氨基酸序列比较分析图。
【具体实施方式】
[0039]下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
[0040]实施例1、鸭源禽流感病毒(H9亚型)Dl株和禽流感病毒(H9亚型)YZG4株HA基因的核苷酸序列的测定
[0041]一、禽流感病毒(H9亚型)Dl株和YZG4株基因组RNA的提取和反转录
[0042]使用TIANGEN公司的病毒RNA提取试剂盒分别抽提禽流感病毒(H9亚型)Dl株(保藏号CCTCC NO:V201226)和禽流感病毒(H9亚型)YZG4株(保藏号CCTCC NO:V201227)的病毒RNA,按照ReverseTranscriptase XL(AMV)反转录酶的使用说明，反转录病毒RNA,得到互补DNA(cDNA)。
[0043]二、禽流感病毒H9亚型Dl株和YZG4株HA基因的PCR扩增
[0044]以步骤一中得到的两株病毒的cDNA为模版，按照rTaq酶的使用说明，PCR扩增禽流感病毒(H9亚型)Dl株和YZG4株的HA基因。PCR所用上游引物序列为:5 ’ -AGCAAAAGCAGGGGAATTTCACAA-3，，下游引物序列为 5 ’ -AGTAGAAACAAGGGTGTTTTTGCTAAT-3’，PCR过程完成后，将PCR产物进行核苷酸序列测定。
[0045]三、禽流感病毒(H9亚型)Dl株和YZG4株HA基因核苷酸序列分析及氨基酸序列的推导
[0046]根据测序结果，禽流感病毒(H9亚型)Dl株HA基因34~1713位核苷酸序列为:SEQ ID NO:1 ;禽流感病毒(H9亚型)Dl株HA基因的氨基酸序列为:SEQ ID NO:2。
[0047]从美国国立生物技术信息中心(National Center forBiotechnologylnformation, NCBI)的GenBank中下载我国现有技术下所生产的鸡用H9亚型禽流感灭活疫苗疫苗株A/chicken/Shandong/6/96 (GenBank登录号:AAY52514,以下简称 SD696 株)和 A/Chicken/Guangdong/SS/94 (GenBank 登录号:DQ874395，以下简称 SS 株)的HA基因序列，并与禽流感病毒(H9亚型)Dl株和YZG4株的HA基因的序列进行比较，发现Dl株与我国现有技术所使用的疫苗株SD696株、SS株相比，在HA蛋白中包含以下几个位点的突变:71-队87-0、93-1(、131-1(、224-]\1、253-1、3774、3811?和 505K，YZG4 株与我国现有技术下所使用的疫苗株SD696株、SS株相比，在HA蛋白中包含以下几个位点的突变:50_E、68-A、93-D、120-K、131-K、162-V、200-A、206-1、224-M、253-1、377-E、381-N 和 505Q,如图1所示。Dl株和YZG4株的HA基因的序列共同具有131-K、224-M、253-1和377-E4个氨基酸取代位点，本研究发现，具有A基因的序列共同具有131-K、224-M、253-1和377-E4个氨基酸取代位点的毒株对水禽禽流感均均有良好的免疫原性。
[0048]实施例2、利用鸭源禽流感病毒(H9亚型)Dl株制备禽流感疫苗
[0049]2.1禽流感病毒(H9亚型)Dl株生产用种毒种子批的建立
[0050]对分离到的鸭源禽流感病毒(H9亚型)Dl株在SPF鸡胚中进行了纯化，通过对纯化后病毒的免疫原性、毒力等 特性的研究，选择鸭源禽流感病毒(H9亚型)Dl株鸡胚毒作为制苗用种毒。
[0051]选择分离到的禽流感病毒(H9亚型)YZG4株同时具备较强的毒力，因此可以作为制苗用种毒和效检用毒株。病毒含量为10 7 83ELD5Q/0.1ml，能够被H9亚型禽流感病毒抗血清中和。将病毒用灭菌生理盐水稀释至107ELD5(i/0.1ml，通过静脉注射Iml/羽，同时滴鼻点眼0.2ml/羽的剂量对5只3月龄健康易感麻鸭(血清中H9HI滴度≥1: 4)攻毒，攻毒后观察10日，麻鸭应不出现任何发病症状。同时在攻毒后第2日时采集所有鸭喉头拭子，用10日龄SPF鸡胚分离病毒，应至少4/5的麻鸭病毒分离阳性。
[0052]实施例3、禽流感H9亚型Dl株灭活疫苗的制备及效力检验和安全试验
[0053]本步骤使用禽流感病毒(H9亚型)Dl株和SPF鸡胚生产了 I批生产种子，这些种子经易感鸡胚繁殖、收获鸡胚液病毒、0.2%甲醛溶液灭活后，与矿物油佐剂乳化配制了禽流感(H9亚型)灭活疫苗。使用成鸭测定，疫苗最小免疫剂量为0.25ml，确定使用剂量为0.5ml/羽。单剂量、单剂量重复和超剂量安全试验结果为:疫苗不引起成鸭和雏鸭的全身不良反应和明显的局部反应。疫苗的免疫攻毒试验结果表明，疫苗在不同品种、年龄(10日龄~12月龄)的鸭上，使用不同的免疫途径，均能诱导产生80%以上保护。疫苗一次免疫成鸭后，不同时间诱导产生的HI抗体滴度(GMT)分别是:7天为1: 223，14天为1: 1024，21天为1: 1351，抗体水平较高，免后21天使用强毒株YZG4株攻毒，可提供>80%的保护。以禽流感病毒(H9亚型)YZG4株制备的H9亚型禽流感灭活疫苗免疫成鸭，免疫后21天诱导产生的HI抗体滴度(GMT)为1: 1134，使用强毒株YZG4株进行攻毒，免疫鸭可得到80%以上的保护。而使用专利CN101843900的方法制备的H9亚型禽流感灭活疫苗免疫成鸭，在一次免疫后7天诱导产生的HI抗体滴度(GMT)为1: 71，14天为1: 278，21天为I: 339，抗体水平均低于禽流感病毒(H9亚型)Dl株所制备的灭活疫苗免疫成鸭后的抗体水平，并且在免疫后21天使用强毒株YZG4株进行攻毒,免疫鸭仅有60%得到保护。
[0054]3.1疫苗制备
[0055]3.1.1生产种子制备与检验
[0056]取禽流感病毒(H9亚型)Dl株E7代(传代第7代)基础毒种，使用灭菌生理盐水进行稀释，经尿囊腔接种SPF鸡胚，0.1ml/胚，37°C培养观察96小时。无菌收集24小时~96小时死亡鸡胚的尿囊液，将HA效价> I: 256的鸡胚尿囊液混合作为生产种子。对生产种子进行毒价测定、病毒含量测定、特异性鉴定和纯净性检验。
[0057]使用禽流感病毒(H9亚型)Dl株E7代基础毒种制备了 I批生产种子，检验结果为无细菌、霉菌、支原体和外源病毒污染，能够被H9亚型禽流感病毒阳性血清中和。制备的生产种子的HA效价为I: 512，病毒含量为IO8 34EID5tlA).lml。
[0058]3.1.2制苗用毒液的制备
[0059]使用灭菌生理盐水将步骤3.1.1的生产种子进行5000倍稀释，经尿囊腔接种10~11日龄易感鸡胚，0.1ml/胚，37°C培养观察96小时，收集24小时以后死亡胚及活胚，无菌收集鸡胚液，作为制苗用毒液。
[0060]使用上述生产 种子制备了 I批病毒液，批号是A1001，约200ml，这批病毒液的HA效价是I: 256，病毒含量是10L67EID5Q/0.lml。
[0061]3.1.3病毒灭活及检验
[0062]向步骤3.1.2项制备的病毒液中，加入10%甲醛溶液，使甲醛溶液的终浓度为0.2% (体积百分含量)，充分混匀后，37°C灭活18小时，期间每隔2~4小时振摇一次。灭活完成后，取样做灭活检验。使用10日龄SPF鸡胚10枚，经尿囊腔接种0.2ml原液，37°C培养观察5天，并照此方法，取胚液盲传一代，鸡胚液应均无血凝性判为灭活完全。结果灭活后的病毒液在SPF鸡胚上连传2代，均不引起鸡胚死亡，鸡胚液无血凝性。表明病毒灭活彻底。
[0063]3.1.4疫苗配制
[0064]用经步骤3.1.3项灭活处理的病毒液制备了一批疫苗1001。
[0065]油相制备
[0066]按注射用白油94容量份、司本-806容量份和硬脂酸铝1.5容量份的比例配制油相。
[0067]取少量注射用白油与硬脂酸铝混合，加热溶化至半透明状再与全量司本-80及注射用白油混合均匀，经116°C灭菌30分钟，冷却至室温备用。
[0068]水相制备
[0069]将96容量份步骤3.1.2项的HA效价为1: 256、灭活前病毒含量为107 67EID50/0.1ml的H9亚型禽流感病毒A1001批病毒液，经步骤1.3灭活检验合格后，加入灭菌吐温-804重量份，充分振荡混匀，直到吐温-80完全溶解，得到水相。
[0070]按照油相和水相1.5: I的容量比，将油相加入匀浆杯中，低速转动时，缓慢加入水相。加完水相后匀浆2~3分钟，停止乳化前加入乳剂总重量的0.01% (W/V)的硫柳汞，得到批号为1001的500ml疫苗。
[0071]3.1.5禽流感(H9亚型)YZG4株灭活疫苗的制备
[0072]取YZG4株病毒液接种SPF鸡胚，制备生产种子，经毒价测定、病毒含量测定、特异性鉴定和纯净性检验合格后，作为生产种子，接种易感鸡胚，无菌收获鸡胚液，按本实施例3.1.3所示方法进行灭活和检验，检验合格后，按3.1.4所示方法进行配苗，得到批号为
1002的 500ml 疫苗。
[0073]将批号为1001和1002的500ml疫苗，定量分装，贴签后，2~8°C保存。同时抽样按照《中华人民共和国兽药典》(2005年版)的规定做无菌检验、物理性状检验、甲醛含量和硫柳汞含量测定。结果，疫苗无菌生长；物理性状、甲醛和硫柳汞含量均符合规定。
[0074]3.2HI抗体与攻毒保护的平行关系
[0075]使用1001批疫苗，剂量分别是0.5ml/只、0.25ml/只和0.13ml/只。每个剂量经颈背部皮下注射H9亚型HI抗体阴性(HI < I: 4)的10只105日龄的易感麻鸭，7天后采血，测定HI效价。根据测定结果，将不同抗体水平的免疫鸭重新分组，每组10只，连同条件对照鸭5只，用禽流感病毒(H9亚型)YZG4株攻击，观察10天。攻毒后第2天，采集每只鸭的喉头棉拭子，分离病毒。以对照组4/5以上鸭病毒分离阳性，免疫组8/10以上鸭病毒分离阴性，且观察期结束，10/10鸭健活判为保护。根据HI抗体水平与攻毒保护平行关系的试验结果，制订疫苗成品效力检验的HI抗体效价标准。结果如表1所示。
[0076]表1禽流感(H9亚型)灭活疫苗HI抗体与攻毒保护的平行关系测定结果
[0077]
【权利要求】
1.H9亚型禽流感病毒，所述病毒HA基因编码的氨基酸序列包含如图1所示的具有131-K、224-M、253-1和377-E4个氨基酸取代位点。
2.根据权利要求1所述的禽流感病毒，所述禽流感病毒为H9亚型禽流感病毒Dl株，分类命名为禽流感病毒H9亚型Dl株,拉丁文学名为Aviarius InfIuenza,保藏于中国典型培养物保藏中心，地址为中国武汉.武汉大学，保藏日期为2012年6月14日，保藏号为CCTCC NO:V201226o
3.—种DNA序列，所述序列实质上编码含有SEQ.N0.2的氨基酸序列。
4.根据权利要求1所述的禽流感病毒，所述禽流感病毒为H9亚型禽流感病毒YZG4株，分类命名为禽流感病毒H9亚型YZG4株,拉丁文学名为Aviarius Influenza,保藏于中国典型培养物保藏中心，地址为中国武汉.武汉大学，保藏日期为2012年6月14日，保藏号为CCTCC NO:V201227o
5.—种HA抗原蛋白，所述HA抗原蛋白包含如图1所示的具有131-K、224-M、253-1和377-E4个氨基酸取代抗原位点和127-S、129-Υ、147-T、152-S、188-ff和216-D6个保守的氨基酸抗原位点的H9亚型禽流感病毒HA共有序列。
6.一种用于预防和治疗H9亚型禽流感的疫苗，其中，所述疫苗包括免疫量的权利要求1所述的灭活全病毒和佐剂。
7.根据权利要求6所述的疫苗，其中，所述的H9亚型禽流感病毒为Dl株，所述灭活全病毒含量为灭活前10 7 67 1 08_67EID5tlA).1rnl ;所述佐剂为油佐剂。
8.根据权利要求6 或7所述的疫苗，所述疫苗进一步包括免疫量的其它抗原，所述其它抗原选自新城疫病毒抗原、鸭痕病毒抗原、鸭巴氏杆菌抗原、鸭黄病毒抗原以及鸭疫里默氏杆菌抗原的一种或几种。
9.根据权利要求8所述的疫苗，所述附加抗原为鸭瘟病毒灭活全病毒。
10.一种制备权利要求6~7所述疫苗的方法，所述方法包括:将所述H9亚型禽流感病毒灭活，加入佐剂，乳化得到所述H9亚型禽流感灭活全病毒的疫苗。
11.权利要求6~7所述疫苗在预防和治疗H9亚型禽流感方面的应用。
【文档编号】C12N7/00GK103805572SQ201210440229
【公开日】2014年5月21日 申请日期:2012年11月5日 优先权日:2012年11月5日
【发明者】张许科, 孙进忠, 白朝勇 申请人:普莱柯生物工程股份有限公司