H9亚型禽流感病毒分离株以及由其制得的疫苗组合物的制作方法
【专利摘要】根据本发明的禽流感病毒分离株属于H9亚型，其血凝素蛋白的HA1结构域氨基酸序列具有以下特征性位点：69位P；180位A；221位N及236位R。以具有上述特征位点的H9亚型禽流感病毒分离株制得的疫苗组合物具备良好的免疫效力，效果优于现有技术毒株制得的疫苗，可以对流行野毒株提供有效的交叉保护，显示出显著交叉免疫原特性，在预防和治疗禽交叉免疫保护方面具有很好的应用前景。
【专利说明】H9亚型禽流感病毒分离株以及由其制得的疫苗组合物
【技术领域】
[0001]本发明属于禽类生物制药【技术领域】，涉及一种H9亚型禽流感病毒分离株及由其制得的疫苗组合物。
【背景技术】
[0002]禽流感(Al)是由A型流感病毒引起的一种禽类的感染和/或疾病综合征。根据病原的致病力不同，分为高致病性和低致病性两种类型。低致病性禽流感病毒中尤以H9亚型分布最为广泛，最具危害性。H9亚型禽流感病毒(H9 AIV)单病原感染往往不引起临床症状，但由于其易与其它病原发生协同作用，造成继发感染，从而引起肉鸡和蛋鸡的复合型呼吸道疾病甚至死亡、禽类产蛋下降及免疫抑制等，可对养禽业造成重大损失。另外，它可以跨越宿主障碍感染哺乳动物(包括人)。因此，控制H9亚型禽流感疫情的发生和流行具有重要的经济与公共卫生意义。
[0003]免疫法是控制所述疫病的主要方法。鸡可以通过接受母源抗体而被动免疫，或者通过活疫苗或灭活疫苗对其进行主动免疫。目前，对所述疫病的控制主要依赖灭活疫苗，这类疫苗通常是一种包含禽流感病毒抗原和药理学上可接受的载剂的组合物。存在于疫苗中的禽流感病毒抗原一般为经灭活的疫苗毒株的全病毒或来自于病毒的保护性蛋白。疫苗毒株需具备良好的抗原性及免疫原性以确保疫苗的免疫效力。
[0004]流感病毒有着较强的进化变异能力，病毒的两个表面蛋白(HA和NA)是引起抗原变异的主要根源。一方面，发生在病毒基因组RNA上的点突变逐渐积累会导致抗原漂移；另一方面，病毒之间的基因片段的重配，则会导致一个全新的表面抗原或一个新亚型的出现，即为抗原漂变。同时，由于疫苗的广泛使用，使野生病毒在免疫选择压力下朝着偏离疫苗株的方向加速进化，其结果会导致疫苗株对野毒株的交叉免疫保护效力逐渐下降。
[0005]从1998年开始，H9亚型禽流感灭活疫苗在中国逐渐开始广泛使用，主要选用的疫苗株有 A/Chicken/Shanghai/F/98 (简称 F 株)、A/Chicken/Guangdong/SS/94 (简称 SS 株)等，疫苗的广泛应用使得H9亚型禽流感的流行得到了有效控制。但禽群的感染仍不断发生，甚至出现在免疫群体，特别是近年来呈现出逐渐增多的趋势。导致这种现象出现的主要原因是由于疫苗株与目前流行的野毒株之间存在着较大的遗传距离及抗原性差异，导致疫苗株的免疫保护效力下降。
[0006]因此，目前存在的问题是需要研究开发一种可以对流行野毒株提供有效的交叉保护的，用于H9亚型禽流感的疫苗。
【发明内容】
[0007]本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种H9亚型禽流感病毒分离株以及由其制得的疫苗组合物。该禽流感病毒分离株属于H9亚型，以该H9亚型禽流感病毒分离株制得的疫苗组合物可以对流行野毒株提供有效的交叉保护，显示出显著的交叉免疫特性。[0008]为此，本发明提供了一种H9亚型禽流感病毒分离株，其血凝素蛋白的HAl结构域氨基酸序列具有以下特征性位点:69位P ；180位A ；221位N及236位R。
[0009]根据本发明，所述H9亚型禽流感病毒分离株的血凝毒蛋白具有序列表SEQ N0.1的氨基酸序列。
[0010]当以根据本发明所述的H9亚型禽流感病毒分离株调配于疫苗组合物中时，所述禽流感病毒SZ株显示出显著交叉免疫特性。因此，对于所述疫苗组合物而言，所述禽流感病毒SZ株，以及其它本质上具有相同本质识别特征的分离株极为优选。
[0011]本发明的H9亚型禽流感病毒分离株包含禽流感病毒H9亚型SZ株(AivanInfluenza Virus H9 subtype Strain SZ),其保藏编号为:CCTCCN0:V201240,保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC);地址:湖北省武汉市武昌区珞珈山路16号武汉大学)。保藏日期:2012年9月16日。
[0012]本发明中所用术语H9亚型禽流感病毒分离株也称为禽流感病毒H9亚型分离株。
[0013]类似的，本发明中所用术语禽流感病毒H9亚型SZ株也称为H9亚型禽流感病毒SZ株。
[0014]本发明还提供了一种根据本发明所述禽流感病毒分离株制得的疫苗组合物，其特征在于:所述疫苗组合物含有H9亚型禽流感病毒分离株和可药用载剂。
[0015]本发明中，所述疫苗组合物为水包油乳液、油包水乳液或双重乳液。所述双重乳液通常表现为水包油包水乳液。
[0016]根据本发明，在所述疫苗组合物中，所述H9亚型禽流感病毒分离株灭活前含量为IO6 5~IO8 5EID5tlA).1m`l0优选在所述疫苗组合物中，所述H9亚型禽流感病毒分离株灭活前含量为107_°~108_%ID5(i/0.1ml0更为优选的，在所述疫苗组合物中，所述H9亚型禽流感病毒分尚株灭活前含量为10〃~10&5EID5(i/0.1mlo
[0017]本发明的疫苗组合物可使用可用技术来调配，优选为与医药学上可接受的载体一起调配。例如，油可有助于稳定调配物，且另外充当疫苗佐剂。因此，本发明中，所述可药用疫苗佐剂包括油佐剂，其选自白油、角鲨烷或角鲨烯、德雷克油(Drakeoil)，以及其他动物油、植物油或矿物油。上述油佐剂既可以是来源，也可以是经过人工合成获得的。
[0018]在本发明的一个实施方式中，所述疫苗组合物还包括助悬剂、表面活性剂、抗原灭活剂或防腐剂。所述助悬剂可包括，例如，硬脂酸铝，以及所属【技术领域】可用的其他助悬剂。所述表面活性剂可包括，例如，脱水山犁醇单油酸酯(TWEEN系列)，司本(SPAN)，以及所属【技术领域】可用的其他表面活性剂。所述抗原灭活剂包括(但不限于)，例如福尔马林、P -丙内酯等等。所述防腐剂包括，例如硫柳汞。上述物质的使用方法及用量均为本领域技术人员所熟知。还可以选择本领域的其它佐剂，包括氢氧化铝、磷酸铝及其它金属盐。
[0019]根据本发明，所述疫苗组合物还含有至少一种额外的家禽抗原，其选自抵抗鸡疱疹病毒、鸡贫血病毒(CAV)、新城疫病毒、传染性支气管炎病毒(IB)、鸡传染性法氏囊炎病毒、减蛋综合症病毒以及呼肠孤病毒抗原。
[0020]本发明还进一步提供了一种根据根据本发明所述的疫苗组合物在预防和治疗禽交叉免疫保护中的应用。
[0021]根据本发明的禽流感病毒分离株属于H9亚型，其血凝素蛋白的HAl结构域氨基酸序列具有以下特征性位点:69位P ；180位A ；221位N及236位R。以具有上述特征位点的H9亚型禽流感病毒分离株制得的疫苗组合物具备良好的免疫效力，效果优于现有技术毒株制得的疫苗，可以对流行野毒株提供有效的交叉保护，显示出显著交叉免疫原特性，在预防和治疗禽交叉免疫保护方面具有很好的应用前景。
[0022]菌种保藏
[0023]禽流感病毒H9 亚型 SZ 株(Aivan Influenza Virus H9 subtype StrainSZ),由普莱柯生物工程股份有限公司分离、鉴定，已在中国典型培养物保藏中心(简称=CCTCC ;地址:湖北省武汉市武昌区珞珈山路16号武汉大学)进行保藏，保藏日期:2012年9月16日，保藏编号:CCTCC NO:V201240。
【具体实施方式】 [0024]为使本发明更加容易理解，下面将结合实施例来详细说明本发明，这些实施例仅起说明性作用，并不局限于本发明的应用范围，下列实施例中未提及的具体实验方法，通常按照常规实验方法进行。
[0025]实施例
[0026]实例1:毒株分离鉴定
[0027]2008年，从山东诸诚肉鸡场鸡群中采集喉头与泄殖腔拭子，置于病毒保存液中(每ml含青霉素10000U、链霉素2000ug，pH:7.0)，_20°C冻结。拭子样品经处理后接种10日龄SPF鸡胚(北京梅里亚维通实验动物有限公司)。将所收获鸡胚液样品用1%鸡红细胞悬液进行血凝性检测，阳性样品配制4单位抗原，再用H9 AIV、H5 AIV、EDS及ND 4种阳性血清通过血凝抑制(HI)试验进行血清学鉴定，经确认为H9亚型AIV。取病毒液用病毒RNA提取试剂盒提取RNA，并反转录cDNA，反转录引物序列为:5’ -AGCAAAAGCAGG-3’。PCR扩增HA基因。PCR产物经电泳鉴定大小正确后，送Invitrogen公司进行核苷酸序列测定，获得编码HAl蛋白的核苷酸序列，见序列表中的SEQ ID N0.1序列，进而推定其HAl结构域的氨基酸序列，见序列表中的SEQ ID N0.2序列，并通过与参考毒株的氨基酸序列比对，确定了血凝素蛋白HAl结构域氨基酸序列的区别性特征位点。
[0028]1.血凝素蛋白HAl结构域的氨基酸序列的下列位点为其区别性特征:69位P ；101位 P ；145 位 S ；198 位 A ；239 位 N 及 245 位 R。
[0029]2.基因序列比对
[0030]从NCBI (http://www.ncb1.nlm.nih.gov)获得如下H9亚型禽流感病毒参考株的 HA 蛋白的核苷酸序列:A/chicken/Shandong/TH9/2010 (登录号:JN804001.1)、A/chicken/Shandong/N/2010 (登录号:JN683647)、A/chicken/Shandong/PD/2009 (登录号:HM751154)、A/chicken/Shandong/SG2/2009 (登录号:HM751194)、A/chicken/Zhejiang/ZC28/2007 (登录号:FJ434586)、A/chicken/Shandong/JN/1999 (登录号:HM773437)、A/chicken/Shandong/K/2010 (登录号:JN683644)、A/chicken/Shandong/L/2010 (登录号:JN683645)、A/chicken/Shandong/lx316/2008(登录号:FJ190138)。
[0031]用DNASTAR软件包中的MegAlign软件(选择Align菜单下的Clustal V方法)，
将SZ株血凝素蛋白HAl结构域的氨基酸序列与参考株序列进行比对，获得如下结果:
[0032]
【权利要求】
1.一种H9亚型禽流感病毒分离株，其血凝素蛋白的HAl结构域氨基酸序列具有以下特征性位点:69位P ；180位A ；221位N及236位R0
2.根据权利要求1所述的H9亚型禽流感病毒分离株，其特征在于:其血凝素蛋白具有序列表SEQ N0.1的氨基酸序列。
3.根据权利要求2所述的H9亚型禽流感病毒分离株，其特征在于:所述H9亚型禽流感病毒分离株为禽流感病毒 H9 亚型 SZ 株(Aivanlnfluenza Virus H9 subtype Strain SZ),其保藏编号为=CCTCC NO:V201240，保藏于中国典型培养物保藏中心。
4.一种根据权利要求1~3中任意一项所述的H9亚型禽流感病毒分离株制得的疫苗组合物，其特征在于:所述疫苗组合物含有H9亚型禽流感病毒分离株和可药用载剂。
5.根据权利要求4所述的疫苗组合物，其特征在于:在所述疫苗组合物中，所述H9亚型禽流感病毒分离株灭活前含量为106.5~108_%ID5(i/0.1ml0
6.根据权利要求5所述疫苗组合物，其特征在于:在所述疫苗组合物中，所述H9亚型禽流感病毒分离株灭活前含量为107_°~108_ 5EID5tlA).1ml0
7.根据权利要求6所述疫苗组合物，其特征在于:在所述疫苗组合物中，所述H9亚型禽流感病毒分离株灭活前含量为IO7 5~108_ 5EID5tlA).1ml0
8.根据权利要求1~3中任意一项所述的疫苗组合物，其特征在于:所述可药用疫苗佐剂包括油佐剂，其选自白油、角鲨烷或角鲨烯、德雷克油，以及其他动物油、植物油或矿物油。
9.根据权利要求1~3中任意一项所述的疫苗组合物，其特征在于:所述疫苗组合物还含有至少一种额外的家禽抗原，其选自抵抗鸡疱疹病毒、鸡贫血病毒、新城疫病毒、传染性支气管炎病毒、鸡传染性法氏囊炎病毒、减蛋综合症病毒以及呼肠孤病毒抗原。
10.根据权利要求4~9中任意一项所述的疫苗组合物在预防和治疗禽交叉免疫保护中的应用。
【文档编号】C12N7/00GK103789272SQ201210435106
【公开日】2014年5月14日 申请日期:2012年10月31日 优先权日:2012年10月31日
【发明者】张许科, 孙进忠, 白朝勇 申请人:普莱柯生物工程股份有限公司