共表达h9亚型禽流感病毒ha和鸡白介素6蛋白的重组新城疫耐热疫苗株及制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种共表达H9亚型禽流感病毒HA和鸡白介素6蛋白的重组新城疫耐热疫苗株及制备方法，所述的耐热疫苗株分类命名为rTS?HA/H9?IL6，于2016年4月19日保藏于武汉大学中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO:V201630。该疫苗株该毒株在感染动物或细胞后，可高效表达H9亚型禽流感病毒的全长HA蛋白和鸡白介素6蛋白。该毒株可用于制备H9禽流感、新城疫二联耐热活疫苗，鸡白介素6蛋白起到了免疫增强剂的作用。CCTCC NO: V20163020160419
【专利说明】
共表达H9亚型禽流感病毒HA和鸡白介素6蛋白的重组新城疫 耐热疫苗株及制备方法
技术领域
[00011本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种共表达H9亚型禽流感病毒HA和鸡白介 素6蛋白的重组新城疫耐热疫苗株及制备方法。
【背景技术】
[0002] H9亚型禽流感是危害我国养禽业的一个重要的禽流感病毒亚型，属低致病性禽流 感。由于其致病力较低，不直接引发禽群的大量死亡而易被人们所忽视。但该亚型禽流感病 毒可破坏鸡群的免疫系统，严重时可导致免疫抑制，继而引发大肠杆菌等其它病原的感染， 从而造成较高的死亡率，感染H9亚型禽流感病毒的产蛋鸡死亡率约为10%，产蛋率下降 20%左右，造成较大的经济损失。预防接种灭活疫苗是我国当前防控H9亚型禽流感的主要 手段。传统的灭活疫苗制备比较简单，储存运输方便，免疫效果持久，在禽流感防控中发挥 了重要作用。但灭活疫苗也有一些不足之处，如需肌肉注射，费工费时，免疫成本高。灭活疫 苗的使用在一定程度上增加了临床上区分野毒感染与疫苗免疫的难度，且存在散毒风险。 因此，研发廉价、安全、高效的H9亚型禽流感疫苗具有重要的现实意义。
[0003] 随着分子生物学技术的不断进步，新型基因工程疫苗的研发不断取得突破，其中 基于新城疫病毒载体的新型多联活疫苗是研发热点之一，许多病原的免疫原性基因已经在 新城疫载体内成功表达，并取得了较好的免疫保护效果，如传染性法氏囊病毒的VP2蛋白、 H5亚型禽流感病毒的HA蛋白、狂犬病毒的G糖蛋白、严重急性呼吸综合征病毒的CoV蛋白、人 类免疫缺陷病毒的Gag蛋白等。此类疫苗具有可诱导全身性免疫(体液免疫、细胞免疫和粘 膜免疫）、高鸡胚生长特性、生产成本低廉、免疫方式简便(饮水、气雾、点眼/滴鼻等方式）、 安全(毒株间发生重组及毒力返强可能性极小)等优点。但现有的新城疫病毒载体疫苗均是 以非耐热型新城疫病毒为骨架构建的。
[0004] 研究表明，一些禽类细胞因子具有佐剂性质。白细胞介素6(IL_6)是一种多功能细 胞因子，它在调节机体免疫应答、急性期反应和造血等方面起着重要作用。共表达IL-6和 HIV 1B亚型代表株的gpl20蛋白的表达质粒pGPIL-6,免疫小鼠后发现该质粒能够刺激机体 产生细胞毒性T淋巴细胞(CTL)反应，并可显著提高机体CD4+和CD8+T淋巴细胞的数量，表明 细胞因子IL-6很好的发挥了免疫佐剂的效应。将鸡重组白介素-6蛋白（rChIL-6)与鸡传染 性支气管炎病毒（IBDV)灭活疫苗免疫雏鸡后，发现rChIL-6可上调细胞因子鸡白细胞介素4 (ChIL-4)表现有已经上市的H9禽流感、新城疫二联疫苗均是将H9亚型禽流感病毒株和新城 疫病毒株灭活后制备而成的，其主要原因是由于H9亚型禽流感病毒具有一定的致病性，不 能用于制备活疫苗。此类疫苗的缺点是需肌肉注射，费工费时，免疫成本高。灭活疫苗的使 用在一定程度上增加了临床上区分野毒感染与疫苗免疫的难度，且存在散毒风险。
[0005] 专利申请号为"CN200810222776.2"的文献公开了表达禽流感病毒H9亚型HA蛋白 的重组新城疫病毒LaSota弱毒疫苗株。该疫苗株不具备显著的耐热特性，且未加入免疫增 强因子。
[0006] 因此，如何提供一种具有耐热、稳定性强、冷藏条件要求低的共表达H9亚型禽流感 病毒HA和鸡白介素6蛋白的重组新城疫耐热疫苗株及制备方法是本领域技术人员亟待解决 的技术问题。
【发明内容】
[0007] 针对现有技术中的不足，本发明进行了深入研究，提供了一种共表达H9亚型禽流 感病毒HA和鸡白介素6蛋白的重组新城疫耐热疫苗株及制备方法。
[0008] 本发明一方面涉及一种共表达H9亚型禽流感病毒HA和鸡白介素6蛋白的重组新城 疫耐热疫苗株，其特征在于所述的耐热疫苗株分类命名为rTS-HA/H9-IL6,于2016年4月19 日保藏于武汉大学中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC N0:V201630。
[0009] 本发明另一方面还涉及共表达H9亚型禽流感病毒HA和鸡白介素6蛋白的重组新城 疫耐热疫苗株的制备方法，其特征在于包括如下步骤：
[0010] 1.1 HA/H9基因的插入
[0011] 将H9N2禽流感病毒A/Chicken/Hubei/Cl/2007株在9-11日龄鸡胚上进行增殖，接 种5天后收获鸡胚尿囊液;将收获的尿囊液进行HA基因的RT-PCR扩增，扩增引物为:上游引 物S'-CAGCTATATTAAGGATTAAGAAAAAATACGGGTAGAAAGCTTGCCACCATGGAAACAATATCACTAATAGC-3'，下游引物5' -ATCGGGGCACTCCGATTCTACCCGTATTTTTTCTTAATTATTATTATATACAAATGTTGCATC TGC-3';对PCR产物进行琼脂糖凝胶回收纯化后，测定DNA浓度，待进行克隆连接。
[0012] 1.2新城疫病毒耐热载体片段的PCR扩增
[0013] 以超长片段PCR的方法获得新城疫病毒载体序列，扩增引物为：上游引物5Y-TCGGAGTGCCCCGATTGTGCCAAGATGGACTC-3 7，下游引物5' -TCCTTAATATAGCTGAATTGATTGCAGCTG CGCGATC-3';扩增模板为新城疫病毒耐热株质粒pTS09-C;对PCR产物进行回收纯化，测定其 浓度，待克隆连接；
[0014] 1.3重组质粒pTS-HA/H9的连接与鉴定
[0015]采用In-fusion克隆连接技术，将纯化好的HA基因片段和耐热载体片段进行克隆 连接(连接序列为CAGCTATATTAAGGA和TCGGAGTGCCCCGAT)。连接产物转化DH5a感受态细胞， 转化后的细胞在LB平皿上培养16小时后挑单菌落进行液体培养;对菌液进行HA基因的PCR 鉴定，鉴定为阳性的菌液进彳丁质粒提取进彳丁酶切鉴定；
[0016] 14 IL6基因的PCR扩增
[0017] 以质粒p IL6为模板，进行IL6基因的PCR扩增，扩增引物为：上游引物57 -ACAGGGCCAAAGAAATTAGAAAAAAGTACGGGTAGAAAGCAGCTTGCCACCATGAACTTCACCGAGGGCTGCGA-3'，下游引物5' -CTCTGAATGTCTCCCTTCTACCCGTATTTTTTCTTAATTATTATTAGGCACTGAAACTCCTGG TC-3;对PCR产物进行琼脂糖凝胶回收纯化后，测定DNA浓度，待进行克隆连接；
[0018] 1.5新城疫病毒耐热载体片段的PCR扩增
[0019]以超长片段PCR的方法获得新城疫病毒载体序列，扩增引物为：上游引物5Y-GGGAGACATTCAGAGATCAGGGCGAGTCACCCGGGT-3 7，下游引物5' -TTTCTTTGGCCCTGTATTGATTATTA GTGGGTCGC-3'，扩增模板为中间质粒pTS-HA/H9，对PCR产物进行回收纯化，测定其浓度，待 克隆连接；
[0020] 1.6重组质粒PTS-HA/H9-IL6的连接与鉴定
[0021]采用In-fusion克隆连接技术，将纯化好的IL6基因片段和耐热载体片段进行克隆 连接(连接序列为ACAGGGCCAAAGAAA和GGGAGACATTCAGAG);连接产物转化DH5a感受态细胞， 转化后的细胞在LB平皿上培养16小时后挑单菌落进行液体培养;对菌液进行IL6基因的PCR 鉴定;鉴定为阳性的菌液进彳丁质粒提取进彳丁酶切鉴定；
[0022] 1.7重组病毒rTS-HA/H9-IL6的拯救恢复
[0023]采用脂质体转染法，将已构建的重组质粒PTS-HA/H9-IL6与三个分别表达NP、P和L 蛋白的辅助质粒共转染BHK-21细胞;转染后72小时，反复冻融收获细胞液，接种9-11日龄 SPF鸡胚;接种后5天，收获鸡胚尿囊液，分离得到共表达H9亚型禽流感病毒HA和鸡白介素6 蛋白的重组新城疫耐热疫苗株。
[0024]本发明还涉及上述共表达H9亚型禽流感病毒HA和鸡白介素6蛋白的重组新城疫耐 热疫苗株在制备重组病毒中的应用。
[0025]本发明还涉及上述共表达H9亚型禽流感病毒HA和鸡白介素6蛋白的重组新城疫耐 热疫苗株在制备H5禽流感、新城疫二联耐热活疫苗中的应用。
[0026]本申请公开了一种可表达H9亚型禽流感病毒截短HA蛋白的重组新城疫病毒耐热 株。该疫苗株具有显著的耐热特性，可极大降低对冷链系统的依赖，节省保存运输成本和提 高疫苗热稳定性。该毒株在感染动物或细胞后，可高效表达H9亚型禽流感病毒的全长HA蛋 白和鸡白介素6蛋白。该毒株可用于制备H9禽流感、新城疫二联耐热活疫苗，鸡白介素6蛋白 起到了免疫增强剂的作用。
【附图说明】
[0027]图1为本发明可共表达H9亚型禽流感病毒HA蛋白和鸡白介素6的重组耐热新城疫 病毒全长质粒的构建示意图。其中rTS09-C为亲本株的基因组结构，rTS-HA/H9-IL6为在 rTS09-C基因组中插入了 HA和IL6基因后的结构，详细标注了插入序列的整体序列组成。
【具体实施方式】
[0028] 下面结合实施例对本发明做进一步的说明，以下所述，仅是对本发明的较佳实施 例而已，并非对本发明做其他形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示 的技术内容加以变更为同等变化的等效实施例。凡是未脱离本发明方案内容，依据本发明 的技术实质对以下实施例所做的任何简单修改或等同变化，均在本发明的保护范围内。
[0029] 实施例1
[0030] 第一步、重组全长质粒pTS-HA/H9-IL6的构建与鉴定
[0031] 重组全长质粒pTS-HA/H9-IL6是通过将H9亚型禽流感病毒HA基因（HA/H9)和鸡白 介素6基因（IL6)共同插入到新城疫病毒重组质粒pTS09-C中而获得的。如图1所示，其构建 分为两大步，第一步是将HA/H9基因插入至质粒pTS09-C的P和Μ基因之间，获得中间质粒 PTS-HA/H9;第二步是将IL6基因插入至pTS-HA/H9的ΝΡ基因前面，最终获得重组全长质粒 pTS-HA/H9-IL6〇
[0032] 1.1 HA/H9基因的插入
[0033] 1.1.1 H9亚型禽流感病毒HA基因的PCR扩增
[0034] 将H9N2禽流感病毒A/Chicken/Hubei/Cl/2007株在9-11日龄鸡胚上进行增殖，接 种5天后收获鸡胚尿囊液。将收获的尿囊液进行HA基因的RT-PCR扩增，扩增引物为:上游引 物S'-CAGCTATATTAAGGATTAAGAAAAAATACGGGTAGAAAGCTTGCCACCATGGAAACAATATCACTAATAGC-3'，下游引物5' -ATCGGGGCACTCCGATTCTACCCGTATTTTTTCTTAATTATTATTATATACAAATGTTGCATC TGC-31下划线部分为用于In-fusion克隆连接的互补序列）。琼脂糖凝胶电泳检测目的条 带约1.8kb，与预期的1774bp相符(HA1基因长度为1680bp，分别在HA基因前端和后端引入了 基因起始序列和基因终止序列，同时在HA基因前端引入了Kozak序列）。对PCR产物进行琼脂 糖凝胶回收纯化后，测定DNA浓度，待进行克隆连接。
[0035] 1.1.2新城疫病毒耐热载体片段的PCR扩增
[0036] 以超长片段PCR的方法获得新城疫病毒载体序列，扩增引物为：上游引物5Y-TCGGAGTGCCCCGATTGTGCCAAGATGGACTC-3 7，下游引物5' -TCCTTAATATAGCTGAATTGATTGCAGCTG CGCGATC-31下划线部分为用于In-fusion克隆连接的互补序列）。扩增模板为新城疫病毒 耐热株质粒PTS09-C。琼脂糖凝胶电泳检测目的条带约18kb，与预期的17.8kb大小相符。对 PCR产物进行回收纯化，测定其浓度，待克隆连接。
[0037] 1.1.3重组质粒pTS-HA/H9的连接与鉴定
[0038]采用In-fusion克隆连接技术，将纯化好的HA基因片段和耐热载体片段进行克隆 连接(连接序列为CAGCTATATTAAGGA和TCGGAGTGCCCCGAT)。连接产物转化DH5a感受态细胞， 转化后的细胞在LB平皿上培养16小时后挑单菌落进行液体培养。对菌液进行HA基因的PCR 鉴定。鉴定为阳性的菌液进行质粒提取进行酶切鉴定。分别以BamHI和Mlul内切酶对全长重 组质粒进行酶切鉴定，均得到了与预期相符的酶切图谱。将酶切鉴定正确的重组质粒PTS-HA/H9送至测序公司进行序列测定，结果表明H9亚型禽流感的HA基因插入到了新城疫病毒 耐热载体的P和Μ基因之间，且所有序列与预期完全一致，中间质粒PTS-HA/H9构建成功。
[0039] 1.2 IL6基因的插入
[0040] 1.2.1 IL6 基因的 PCR 扩增
[0041] 含有鸡白介素6基因的质粒pIL6由本实验室设计序列并交于上海生物工程股份公 司合成。以质粒PIL6为模板，进行IL6基因的PCR扩增，扩增引物为：上游引物5'-ACAGGGCCAAAGAAATTAGAAAAAAGTACGGGTAGAAAGCAGCTTGCCACCATGAACTTCACCGAGGGCTGCGA-3'，下游引物5' -CTCTGAATGTCTCCCTTCTACCCGTATTTTTTCTTAATTATTATTAGGCACTGAAACTCCTGG TC-3(下划线部分为用于In-fusion克隆连接的互补序列）。琼脂糖凝胶电泳检测目的条带 约0.8kb，与预期的819bp相符（IL6基因长度为726bp，分别在IL6基因前端和后端引入了基 因起始序列和基因终止序列，同时在IL6基因前端引入了Kozak序列）。对PCR产物进行琼脂 糖凝胶回收纯化后，测定DNA浓度，待进行克隆连接。
[0042] 1.2.2新城疫病毒耐热载体片段的PCR扩增
[0043]以超长片段PCR的方法获得新城疫病毒载体序列，扩增引物为：上游引物5Y-GGGAGACATTCAGAGATCAGGGCGAGTCACCCGGGT-3 7，下游引物5' -TTTCTTTGGCCCTGTATTGATTATT AGTGGGTCGC-31下划线部分为用于In-fusion克隆连接的互补序列）。扩增模板为中间质粒 PTS-HA/H9。琼脂糖凝胶电泳检测目的条带约19kb，与预期的19.5kb大小相符。对PCR产物进 行回收纯化，测定其浓度，待克隆连接。
[0044] 1.2.3重组质粒pTS-HA/H9-IL6的连接与鉴定
[0045]采用In-fusion克隆连接技术，将纯化好的IL6基因片段和耐热载体片段进行克隆 连接(连接序列为ACAGGGCCAAAGAAA和GGGAGACATTCAGAG)。连接产物转化DH5a感受态细胞， 转化后的细胞在LB平皿上培养16小时后挑单菌落进行液体培养。对菌液进行IL6基因的PCR 鉴定。鉴定为阳性的菌液进行质粒提取进行酶切鉴定。分别以BamHI和Mlul内切酶对全长重 组质粒进行酶切鉴定，均得到了与预期相符的酶切图谱。将酶切鉴定正确的重组质粒PTS-HA/H9-IL6送至测序公司进行序列测定，结果表明HA/H9和IL6基因均插入到了新城疫病毒 耐热载体，且所有序列与预期完全一致，重组质粒PTS-HA/H9-IL6构建成功。
[0046] 第二步、重组病毒rTS-HA/H9-IL6拯救恢复与鉴定
[0047] 2.1重组病毒rTS-HA/H9-IL6的拯救恢复
[0048]采用脂质体转染法，将已构建的重组质粒PTS-HA/H9-IL6与三个分别表达NP、P和L 蛋白的辅助质粒共转染BHK-21细胞（已预感染表达T7RNA聚合酶的痘苗病毒）。转染后72小 时，反复冻融收获细胞液，接种9-11日龄SPF鸡胚。接种后5天，收获鸡胚尿囊液，待进行新城 疫病毒检测。
[0049] 2.2重组病毒的血凝效价和荧光定量PCR检测
[0050] 以血凝试验和荧光定量PCR的方法，对收获鸡胚尿囊液进行检测，结果均为新城疫 阳性。初步表明重组病毒rTS-HA/H9-IL6拯救成功。
[0051 ] 2.3重组病毒HA/H9基因和IL6基因的PCR扩增与测序
[0052] 分别应用HA/H9和IL6基因的特异性扩增引物两对，对重组病毒rTS-HA/H9-IL6的 HA/H9和IL6基因进行RT-PCR扩增，对PCR扩增产物进行序列测定分析，均扩增到了预期片 段。具体信息分别为:H9/HA长度为1774bp(SEQ ID No. 1)，从5'到3'端，依次包含了P基因的 部分非编码区序列(UTR)、P基因的基因终止序列(GE)、中间序列（IGS)、HA基因的基因起始 序列(GS)、HA基因的Kozak序列、HA基因序列、HA基因的双重终止密码子、HA基因的GE序列、 IGS序列、Μ基因的GS序列和Μ基因的UTR序列；IL6长度为918bp(SEQ ID No.2)，从5'到3'端， 依次包含了3'端Leader部分序列、IL6基因的基因起始序列(GS)、IL6基因的Kozak序列、IL6 基因序列、IL6基因的双重终止密码子、IL6基因的GE序列、IG序列、NP基因的GS序列和NP基 因的UTR序列。与预期序列100%-致。
[0053] 第三步、H9亚型禽流感病毒HA蛋白在重组病毒rTS-HA/H9-IL6中的表达验证
[0054] 3.1间接免疫荧光法检测HA蛋白的表达
[0055] 将重组病毒rTS-HA/H9-IL6和rTS09-C(对照）分别以0.01M0I感染BHK-21细胞，24h 后进行间接免疫荧光检测，一抗为NDV阳性鸡血清或H9亚型禽流感阳性血清。检测结果表 明：在重组病毒rTS-HA/H9-IL6感染的细胞内，使用NDV阳性鸡血清或H9亚型禽流感阳性血 清作为一抗时均能检测到绿色荧光，而rTS09-C株感染的细胞只在NDV阳性血清作用下检测 到荧光。
[0056] 3.2 Western Blot法检测HA蛋白的表达
[0057] 将重组病毒rTS-HA/H9-IL6和rTS09-C(对照）分别以0.01M0I感染BHK-21细胞，24h 后收集细胞裂解液，以H9亚型禽流感阳性鸡血清为一抗进行Western Blot检测。检测结果 表明：在55-70KDa区间出现一条明显的目的条带，与预期的61KDa大小相近。表明HA蛋白在 重组病毒感染的细胞内正确表达。
[0058] 第四步、重组病毒rTS-HA/H9-IL6的生物学特性鉴定
[0059] 4.1重组病毒的增殖特性测定
[0060] 为比较重组病毒rTS-HA/H9-IL6株与亲本rTS09-C株的生长增殖情况，将两株病毒 分别以l〇〇TCID5Q接种BHK-21细胞，接种后24h、48h、72h、96h取上清500μ1，测定病毒TCID50， 绘制病毒的生长曲线。结果表明，与亲本rTS09-C株相比，重组病毒rTS-HA/H9-IL6株的生长 特性有所下降，增殖滴度约为lO^TCIDM/ml。
[0061 ] 4.2重组病毒的致病性测定
[0062] 测定重组病毒对鸡胚的最小致死剂量的平均致死时间（MDT/MLD)，结果显示不同 稀释度（ΠΓ1至ΠΓ9)的病毒接种鸡胚后的120h内均不会对鸡胚致死，重组病毒rTS-HA/H9-IL6的MDT/MLD大于120h，表明重组病毒保持了亲本株的低毒特性，外源基因的插入并未改 变重组病毒的致病性。
[0063] 4.3重组病毒的耐热特性测定
[0064] 测定重组病毒在56 °C环境下的HA耐热特性，同时设置非耐热株LaSota株和耐热株 rTS09-C株为对照。如表1所示，非耐热株LaSota在56°C耐热处理9min后，HA效价降为0,亲本 株rTS09-C和重组病毒rTS-HA/H9-IL6在56°C耐热处理150min后仍具有血凝活性。表明重组 病毒rTS-HA/H9-IL6的耐热特性与亲本株一致，均为耐热株。（该病毒株已经保藏，保藏在武 汉大学中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC N0:V201630)。
[0065]表1.重组病毒的HA耐热特性测定结果
[0067] a表示病毒具有血凝活性，|3表示病毒没有血凝活性
[0068] 以上所述实施例只是本发明的较佳实例，而没有限制本发明的实施范围。因此，凡 是根据本
【发明内容】
的实质所作出的等效修改，都应属于在本发明的保护范围内。
【主权项】
1. 共表达H9亚型禽流感病毒HA和鸡白介素6蛋白的重组新城疫耐热疫苗株，其特征在 于所述的耐热疫苗株分类命名为rTS-HA/H9-IL6，于2016年4月19日保藏于武汉大学中国典 型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC N0:V201630。2. 共表达H9亚型禽流感病毒HA和鸡白介素6蛋白的重组新城疫耐热疫苗株的制备方 法，其特征在于包括如下步骤： 1.1 HA/H9基因的插入 将H9N2禽流感病毒A/Chicken/Hubei/Cl/2007株在9-11日龄鸡胚上进行增殖，接种5天 后收获鸡胚尿囊液;将收获的尿囊液进行HA基因的RT-PCR扩增，扩增引物为:上游引物5'-CAGCTATATTAAGGATTAAGAAAAAATACGGGTAGAAAGCTTGCCACCATGGAAACAATATCACTAATAGC-3'，下 游引物5' -ATCGGGGCACTCCGATTCTACCCGTATTTTTTCTTAATTATTATTATATACAAATGTTGCATCTGC-3';对PCR产物进行琼脂糖凝胶回收纯化后，测定DNA浓度，待进行克隆连接。 1.2新城疫病毒耐热载体片段的PCR扩增 以超长片段PCR的方法获得新城疫病毒载体序列，扩增引物为：上游引物5'-TCGGAGTGCCCCGATTGTGCCAAGATGGACTC-3 7，下游引物57 -TCCTTAATATAGCTGAATTGATTGCAGCTGCGCGATC-3';扩增模板为新城疫病毒耐热株质粒pTS09-C;对PCR产物进行回收纯化，测定其浓度，待克隆连接； 1.3重组质粒pTS-HA/H9的连接与鉴定 采用In-fusion克隆连接技术，将纯化好的HA基因片段和耐热载体片段进行克隆连接， 连接序列为CAGCTATATTAAGGA和TCGGAGTGCCCCGAT;连接产物转化DH5a感受态细胞，转化后 的细胞在LB平皿上培养16小时后挑单菌落进行液体培养;对菌液进行HA基因的PCR鉴定，鉴 定为阳性的菌液进彳丁质粒提取进彳丁酶切鉴定； 14 IL6基因的PCR扩增 以质粒PIL6为模板，进行IL6基因的PCR扩增，扩增引物为：上游引物5'-ACAGGGCCAAAGAAATTAGAAAAAAGTACGGGTAGAAAGCAGCTTGCCACCATGA ACTTCACCGAGGGCTGCGA-3'，下游引物5' -CTCTGAATGTCTCCCTTCTACCCGTATTTTTTCTTAATTATTATTAGGCACTGAAACTC CTGGTC-3;对PCR产物进行琼脂糖凝胶回收纯化后，测定DNA浓度，待进行克隆连接； 1.5新城疫病毒耐热载体片段的PCR扩增 以超长片段PCR的方法获得新城疫病毒载体序列，扩增引物为：上游引物5'-GGGAGACATTCAGAGATCAGGGCGAGTCACCCGGGT-3 7，下游引物57 -TTTCTTTGGCCCTGTATTGATTATTAGTGGGTCGC-3'，扩增模板为中间质粒pTS-HA/H9，对PCR产物 进行回收纯化，测定其浓度，待克隆连接； 1.6重组质粒pTS-HA/H9-IL6的连接与鉴定 采用In-fusion克隆连接技术，将纯化好的IL6基因片段和耐热载体片段进行克隆连 接，连接序列为ACAGGGCCAAAGAAA和GGGAGACATTCAGAG;连接产物转化DH5a感受态细胞，转化 后的细胞在LB平皿上培养16小时后挑单菌落进行液体培养;对菌液进行IL6基因的PCR鉴 定;鉴定为阳性的菌液进彳丁质粒提取进彳丁酶切鉴定； 1.7重组病毒rTS-HA/H9-IL6的拯救恢复 采用脂质体转染法，将已构建的重组质粒PTS-HA/H9-IL6与三个分别表达NP、P和L蛋白 的辅助质粒共转染BHK-21细胞;转染后72小时，反复冻融收获细胞液，接种9-11日龄SPF鸡 胚;接种后5天，收获鸡胚尿囊液，分离得到共表达H9亚型禽流感病毒HA和鸡白介素6蛋白的 重组新城疫耐热疫苗株。3. 权利要求1所述的共表达H9亚型禽流感病毒HA和鸡白介素6蛋白的重组新城疫耐热 疫苗株在制备重组病毒中的应用。4. 权利要求1所述的共表达H9亚型禽流感病毒HA和鸡白介素6蛋白的重组新城疫耐热 疫苗株在制备H9禽流感、新城疫二联耐热活疫苗中的应用。
【文档编号】A61K39/39GK105969741SQ201610425143
【公开日】2016年9月28日
【申请日】2016年6月15日
【发明人】温国元, 邵华斌, 罗玲, 胡潇, 罗青平, 王红琳, 张腾飞, 汪宏才, 张蓉蓉, 卢琴, 艾地云
【申请人】湖北省农业科学院畜牧兽医研究所