一种禽流感h9亚型特异性血清的制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种禽流感H9亚型特异性血清的制备方法，首先将SPF鸡胚制备的抗原用常规方法进行灭活乳化，得到禽流感灭活疫苗，然后用灭活疫苗免疫30～35日龄SPF鸡，免疫后经过系列步骤采集鸡血、收获血清。本发明对1月龄左右鸡进行免疫即可获得满意的免疫应答反应，能得到高效价的抗体，用于禽流感H9亚型外源病毒检验的血清与抗原的中和能力对胚的要求要达到107.5EID50/ml，对细胞的要求要能达到108.5TCID50/ml。
【专利说明】
一种禽流感H9亚型特异性血清的制备方法
技术领域
[0001]本发明属于生物技术领域，具体涉及一种禽流感H9亚型特异性血清的制备方法。
【背景技术】
[0002]随目前国内已有禽流感H9亚型标准物质，该物质系免疫青年鸡或成年鸡，肌肉注射禽流感亚型H9油乳剂苗灭活疫苗后采集SPF血清制备而成。该标准物质用于禽流感H9亚型诊断、免疫监测及疫苗免疫效果评价。
[0003]该禽流感H9亚型标准物质存在以下缺点:
①HI效价偏低:该标准物质用途为禽流感H9亚型的确诊、免疫监测及疫苗免疫效果的评价，作为标准物质而言，其质量稳定、效价均一即可，不要求血清效价要达到高水平。
[0004]②免疫日龄大:该标准物质用成年鸡制备，耗时长，成本高。
[0005]③获得血量有限:该制备方法一次性采血，获得的血量有限。
[0006]④免疫方法单一:只采用肌肉注射进行免疫。
【发明内容】
[0007]本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种降低成本、提高HI效价的禽流感H9亚型特异性血清的制备方法。
[0008]为实现上述目的，本发明采用如下技术方案:
一种禽流感H9亚型特异性血清的制备方法，包括以下步骤:
1)灭活:选择禽流感H9亚型病毒效价2108'7EID5Q/0.1mLSPF鸡胚制备的抗原用常规方法进行灭活乳化，得到禽流感灭活疫苗(H9亚型)；
2)第I次免疫:用上述禽流感灭活疫苗(H9亚型)免疫若干只30?35日龄SPF鸡，免疫方法及剂量为:每只SPF鸡颈部皮下注射lmL、肌肉注射0.3mL；
3)第2次免疫:第I次免疫后21天按第I次免疫方法及剂量重复免疫一次；
4)采集鸡血:第2次免疫后21天采集少量免疫鸡血进行HI效价测定(1%鸡红细胞血凝抑制试验)，免疫鸡HI效价均>21()后即可对所有免疫鸡进行采血；
第I次采血每只免疫鸡采血量为15?20mL，此后每隔5天采血一次，采血量为15?20mL;每次采血后测定HI效价并计算HI效价几何平均值，当HI效价几何平均值比前面任何一次采血后测得的HI效价几何平均值低0.51og2时，即对所有免疫鸡采出全部鸡血；
5)收获血清:每次采血获得的鸡血放置在37°C恒温箱中恒温2-2.5h，再将鸡血放入2?8°C的冰箱16?24h;然后以3000-3500r/min的转速将鸡血离心10-15min后将血清吸出，全部血清混合后用0.20-0.22um的滤膜过滤，无菌分装，即得到禽流感H9亚型特异性血清。
[0009]所述步骤2)，肌肉注射部位为胸部肌肉，注射0.3mL0
[0010]进一步，所述步骤2)，肌肉注射部位为胸部肌肉和腿部肌肉，各注射0.15mL 所述步骤4)，每次采血前一天对SPF鸡充足供水并饲喂少量饲料。
[0011]优选的，所述步骤4)，每次采血前一天对SPF鸡停止喂料，正常喂水，这样血清析出比例提尚。
[0012]本发明收获的禽流感H9亚型特异性血清按以下方法进行血清检验:
1、无菌检验:按《中国兽药典》规定方法进行，无菌生长；
2、支原体检验:按《中国兽药典》规定方法进行，无支原体生长；
3、外源病毒检验:按《中国兽药典》规定方法进行，无外源病毒污染；
4、HI抗体效价测定:>211;所述血清于-40°C保存3年，HI效价2 21Q;
5、中和抗体效价测定:10—3.95/0.1mL。
[0013]本发明采用以上技术方案，动物免疫日龄降低，从原来的3?4月龄缩短至I月龄，减少了2个月的饲养时间，可节约成本1904元以上:
1、隔离器运行费用1080元(1.5kw X 24小时X 60天X 0.5元=1080元)；
2、每只鸡节约饲养成本24元(0.1kgX60天X4元=24元)；
3、人工成本600元(I人XI小时X 10元X 60天=600元)；
4、材料成本200元(每天更换垫布、垃圾袋等)；
本发明具有以下有益效果:
①提高血清效价:用于禽流感H9亚型外源病毒检验的血清与抗原的中和能力对胚的要求要达到107.5EID5o/ml，对细胞的要求要能达到108.5TCID5Q/ml。
[0014]②降低免疫日龄:I月龄鸡免疫系统及免疫应答即可以满足高免阳性血清制备需求，对I月龄左右鸡进行免疫即可获得满意的免疫应答反应，能得到高效价的抗体。
[0015]③增加血清获得量:当抗体达到所需要求后，高抗体水平会稳定维持I月左右，在此期间每间隔5天即可采血一次，每次15?20mL，在血清效价下降前采全部血容量。血清量可增加I?1.5倍。
[0016]④免疫途径改变:采血结合肌肉注射与皮下注射免疫途径，能够更好的激发外周免疫器官与中枢免疫系统。
【具体实施方式】
[0017]一种禽流感H9亚型特异性血清的制备方法，包括以下步骤:
1)灭活:选择禽流感H9亚型病毒效价2108'7EID5Q/0.1mLSPF鸡胚制备的抗原用常规方法进行灭活乳化，得到禽流感灭活疫苗(H9亚型)；
2)第I次免疫:用上述禽流感灭活疫苗(H9亚型)免疫若干只30?35日龄SPF鸡，免疫方法及剂量为:每只SPF鸡颈部皮下注射lmL、肌肉注射0.3mL；
3)第2次免疫:第I次免疫后21天按第I次免疫方法及剂量重复免疫一次；
4)采集鸡血:第2次免疫后21天采集少量免疫鸡血进行HI效价测定(1%鸡红细胞血凝抑制试验)，免疫鸡HI效价均>21()后即可对所有免疫鸡进行采血；
第I次采血每只免疫鸡采血量为15?20mL，此后每隔5天采血一次，采血量为15?20mL;每次采血后测定HI效价并计算HI效价几何平均值，当HI效价几何平均值比前面任何一次采血后测得的HI效价几何平均值低0.51og2时，即对所有免疫鸡采出全部鸡血；
5)收获血清:每次采血获得的鸡血放置在37°C恒温箱中恒温2-2.5h，再将鸡血放入2?8°C的冰箱16?24h;然后以3000-3500r/min的转速将鸡血离心10-15min后将血清吸出，全部血清混合后用0.20-0.22um的滤膜过滤，无菌分装，即得到禽流感H9亚型特异性血清； 6)血清检验:
无菌检验:按《中国兽药典》规定方法进行，无菌生长；
支原体检验:按《中国兽药典》规定方法进行，无支原体生长；
外源病毒检验:按《中国兽药典》规定方法进行，无外源病毒污染。
[0018]所述步骤2)，肌肉注射部位为胸部肌肉注射0.3mL，或者胸部肌肉和腿部肌肉各注射0.15mL0
[0019]所述步骤4)，每次采血前一天对SPF鸡充足供水并饲喂少量饲料。
[0020]优选的，所述步骤4)，每次采血前一天对SPF鸡停止喂料，正常喂水，这样血清析出比例提尚。
[0021]实施例1
一种禽流感H9亚型特异性血清的制备方法，包括以下步骤:
1)灭活:选择禽流感H9亚型病毒效价2108'7EID5Q/0.1mLSPF鸡胚制备的抗原用常规方法进行灭活乳化，得到禽流感灭活疫苗(H9亚型)；
2)第I次免疫:用上述禽流感灭活疫苗(H9亚型)免疫若干只30日龄SPF鸡，免疫方法及剂量为:每只SPF鸡颈部皮下注射ImL、胸部肌肉注射0.3mL;
3)第2次免疫:第I次免疫后21天按第I次免疫方法及剂量重复免疫一次；
4)采集鸡血:第2次免疫后21天采集少量免疫鸡血进行HI效价测定(1%鸡红细胞血凝抑制试验)，免疫鸡HI效价均>21()后即可对所有免疫鸡进行采血;第I次采血每只免疫鸡采血量为15mL，此后每隔5天采血一次，采血量为15mL;每次采血后测定HI效价并计算HI效价几何平均值，当HI效价几何平均值比前面任何一次采血后测得的HI效价几何平均值低0.51og2时，即对所有免疫鸡采出全部鸡血；
每次采血前一天对SPF鸡充足供水并饲喂少量饲料；
5 )收获血清:每次采血获得的鸡血放置在37 0C恒温箱中恒温2h，再将鸡血放入2 0C的冰箱16h;然后以3000r/min的转速将鸡血离心1min后将血清吸出，全部血清混合后用0.22um的滤膜过滤，无菌分装，即得到禽流感H9亚型特异性血清。
[0022]6)血清检验:
无菌检验:按《中国兽药典》规定方法进行，无菌生长；
支原体检验:按《中国兽药典》规定方法进行，无支原体生长；
外源病毒检验:按《中国兽药典》规定方法进行，无外源病毒污染。
[0023]实施例2
一种禽流感H9亚型特异性血清的制备方法，包括以下步骤:
1)灭活:选择禽流感H9亚型病毒效价2108'7EID5Q/0.1mLSPF鸡胚制备的抗原用常规方法进行灭活乳化，得到禽流感灭活疫苗(H9亚型)；
2)第I次免疫:用上述禽流感灭活疫苗(H9亚型)免疫若干只35日龄SPF鸡，免疫方法及剂量为:每只SPF鸡颈部皮下注射ImL，胸部肌肉和腿部肌肉各注射0.15mL;
3)第2次免疫:第I次免疫后21天按第I次免疫方法及剂量重复免疫一次；
4)采集鸡血:第2次免疫后21天采集少量免疫鸡血进行HI效价测定(1%鸡红细胞血凝抑制试验)，免疫鸡HI效价均>21()后即可对所有免疫鸡进行采血；
第I次采血每只免疫鸡采血量为20mL，此后每隔5天采血一次，采血量为20mL;每次采血后测定HI效价并计算HI效价几何平均值，当HI效价几何平均值比前面任何一次采血后测得的HI效价几何平均值低0.51og2时，即对所有免疫鸡采出全部鸡血；
每次采血前一天对SPF鸡停止喂料，正常喂水；
5)收获血清:每次采血获得的鸡血放置在37 0C恒温箱中恒温2.5h，再将鸡血放入8 0C的冰箱24h;然后以3500r/min的转速将鸡血离心15min后将血清吸出，全部血清混合后用0.20um的滤膜过滤，无菌分装，即得到禽流感H9亚型特异性血清；
6)血清检验:
无菌检验:按《中国兽药典》规定方法进行，无菌生长；
支原体检验:按《中国兽药典》规定方法进行，无支原体生长；
外源病毒检验:按《中国兽药典》规定方法进行，无外源病毒污染。
[0024]实施例3
一种禽流感H9亚型特异性血清的制备方法，包括以下步骤:
1)灭活:选择禽流感H9亚型病毒效价2108'7EID5Q/0.1mLSPF鸡胚制备的抗原用常规方法进行灭活乳化，得到禽流感灭活疫苗(H9亚型)；
2)第I次免疫:用上述禽流感灭活疫苗(H9亚型)免疫若干只30?35日龄SPF鸡，免疫方法及剂量为:每只SPF鸡颈部皮下注射ImL，胸部肌肉注射0.3mL;
3)第2次免疫:第I次免疫后21天按第I次免疫方法及剂量重复免疫一次；
4)采集鸡血:第2次免疫后21天采集少量免疫鸡血进行HI效价测定(1%鸡红细胞血凝抑制试验)，免疫鸡HI效价均>21()后即可对所有免疫鸡进行采血；
第I次采血每只免疫鸡采血量为15?20mL，此后每隔5天采血一次，采血量为15?20mL;每次采血后测定HI效价并计算HI效价几何平均值，当HI效价几何平均值比前面任何一次采血后测得的HI效价几何平均值低0.51og2时，即对所有免疫鸡采出全部鸡血；
每次采血前一天对SPF鸡充足供水并饲喂少量饲料；
5)收获血清:每次采血获得的鸡血放置在37 0C恒温箱中恒温2h，再将鸡血放入4 0C的冰箱20h;然后以3000r/min的转速将鸡血离心10-15min后将血清吸出，全部血清混合后用
0.22um的滤膜过滤，无菌分装，即得到禽流感H9亚型特异性血清。
[0025]6)血清检验:
无菌检验:按《中国兽药典》规定方法进行，无菌生长；
支原体检验:按《中国兽药典》规定方法进行，无支原体生长；
外源病毒检验:按《中国兽药典》规定方法进行，无外源病毒污染。
【主权项】
1.一种禽流感H9亚型特异性血清的制备方法，其特征在于:其包括以下步骤: 1)灭活:选择禽流感H9亚型病毒效价2108'7EID5Q/0.1mLSPF鸡胚制备的抗原用常规方法进行灭活乳化，得到禽流感灭活疫苗； 2)第I次免疫:用上述禽流感灭活疫苗免疫若干只30?35日龄SPF鸡，免疫方法及剂量为:每只SPF鸡颈部皮下注射ImL、肌肉注射0.3mL; 3)第2次免疫:第I次免疫后21天按第I次免疫方法及剂量重复免疫一次； 4)采集鸡血:第2次免疫后21天采集少量免疫鸡血进行HI效价测定，免疫鸡HI效价均>21Q后即可对所有免疫鸡进行采血； 第I次采血每只免疫鸡采血量为15?20mL，此后每隔5天采血一次，采血量为15?20mL;每次采血后测定HI效价并计算HI效价几何平均值，当HI效价几何平均值比前面任何一次采血后测得的HI效价几何平均值低0.51og2时，即对所有免疫鸡采出全部鸡血； 5)收获血清:每次采血获得的鸡血放置在37°C恒温箱中恒温2-2.5h，再将鸡血放入2?.8°C的冰箱16?24h;然后以3000-3500r/min的转速将鸡血离心10-15min后将血清吸出，全部血清混合后用0.20-0.22um的滤膜过滤，无菌分装，即得到禽流感H9亚型特异性血清。2.根据权利要求1所述的一种禽流感H9亚型特异性血清的制备方法，其特征在于:所述步骤2)，肌肉注射部位为胸部肌肉。3.根据权利要求1所述的一种禽流感H9亚型特异性血清的制备方法，其特征在于:所述步骤2)，肌肉注射部位为胸部肌肉和腿部肌肉，各注射0.15mL。4.根据权利要求1所述的一种禽流感H9亚型特异性血清的制备方法，其特征在于:所述步骤4)，每次采血前一天对SPF鸡充足供水并少量喂料。5.根据权利要求1所述的一种禽流感H9亚型特异性血清的制备方法，其特征在于:所述步骤4)，每次采血前一天对SPF鸡停止喂料，正常喂水。
【文档编号】C07K16/10GK105859881SQ201610193697
【公开日】2016年8月17日
【申请日】2016年3月31日
【发明人】赵华娥
【申请人】福州大北农生物技术有限公司