针对h7n9亚型禽流感病毒的全人源单克隆抗体及应用
【专利摘要】本发明属于生物技术领域，具体涉及针对H7N9亚型禽流感病毒的全人源单克隆抗体、其抗原结合片段，和它们的应用。所述抗体是由存在于抗体轻链和重链基因可变区中的互补决定区(CDR)特异性基因序列决定的，并在原核和真核细胞中获得有效表达的特异性结合H7N9亚型禽流感病毒血凝素蛋白(HA)的抗体。利用此抗体CDR区或部分或全基因，可在原核和真核细胞及任何表达系统中改造和生产不同形式的基因工程抗体，可用于制备预防或治疗H7N9亚型禽流感病毒相关疾病的制剂。
【专利说明】
针对H7N9亚型禽流感病毒的全人源单克隆抗体及应用
技术领域
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[0001]本发明属于生物技术领域，具体涉及针对H7N9亚型禽流感病毒的全人源单克隆抗体、其抗原结合片段，和它们的应用。【背景技术】:
[0002]据报道，禽流感病毒是感染鸟类的流感病毒，通常不会感染人类。然而，1997年我国香港首次报告了人类感染禽流感病例。这种高致病性禽流感病毒为H5N1亚型，截止 2013年12月10日已造成全球15个国家和地区共648例病例报告，其中384例死亡。随后，H9N2等多个禽流感病毒亚型也相继被发现具有感染人类的能力。特别是2013年3月， 我国上海和安徽两地第一次发现人感染新型H7N9亚型禽流感病毒病例。目前H7N9疫情仍处于散发状态，截止2014年10月2日已至少确诊453例病例，其中175例死亡。病毒囊膜表面的跨膜糖蛋白血凝素蛋白(HA)和神经氨酸酶蛋白(NA)是流感病毒的主要免疫原性抗原。HA识别靶细胞表面受体并与受体相结合，具有与宿主细胞膜融合活性，能够诱导机体产生保护性中和抗体。由于HA基因突变而引起的HA抗原变异往往会导致免疫失败和变异毒株流行，流感病毒频繁并且持续的发生抗原性变异，目前尚无有效的针对H7N9等新型禽流感病毒的疫苗，也没有特效的治疗药物。作为一类新型特异性抗病毒感染的生物工程制剂， 抗体在抗感染治疗及紧急被动免疫预防方面一直扮演着重要的角色。因此，研制特异性针对H7N9亚型禽流感病毒的抗体，用于紧急预防和治疗是十分必要和可行的。
[0003]通过抗体分子基因水平的重组可获得多种多样的特异性鼠源、人源化及全人源抗体，使对单克隆抗体的研究有了突破性进展并越来越显示出其重要意义及实际应用前景。 上世纪80年代末90年代初兴起的噬菌体抗体基因库技术兴起和整个基因工程抗体技术研究领域的发展，使当今世界全人源单克隆抗体及新结构抗体的开发研究取得很大进展并已由基础研究阶段步入实质性应用研究和开发阶段。含有特异性抗体的人源或动物血清免疫球蛋白用以预防和治疗传染病已历史悠久。而全人源单克隆抗体的发展，给这一领域的生物制品发展带来了新的希望和远大前景。单克隆抗体的体外抗病毒中和活性和体内保护机体抵抗病毒攻击已获得许多实验证明，如抗甲肝病毒、汉坦病毒、RSV病毒、SARS病毒、亨尼帕病毒、埃博拉病毒等单克隆抗体可以在体内100%保护动物免受病毒攻击(2)。我们相信特异性单克隆抗体，及其抗原结合片段，对人感染H7N9亚型禽流感应当具有良好的预防和治疗效应。
[0004]因此，研发高效、特异性的抗H7N9亚型禽流感病毒的抗体意义重大。这些抗体可以用于人感染H7N9亚型禽流感的预防和治疗。
[0005]与本发明相关的现有技术有:
[0006]1.Gao, R.et al.Human infect1n with a novel avian-origin influenza A(H7N9)virus.N Engl J Med 368, 1888-97 (2013).
[0007]2.Dimitrov, D.S.Therapeutic antibodies, vaccines and antibodyomes.MAbs 2, 347-56(2010).
[0008]3.Ying, T.et al.Except1nally potent neutralizat1n of Middle East respiratory syndrome coronavirus by human monoclonal antibodies.J Virol 88, 7796-805(2014).。
【发明内容】
[0009]本发明的目的是提供针对H7N9亚型禽流感病毒的全人源单克隆抗体及应用，具体涉及特异性结合H7N9亚型禽流感病毒血凝素蛋白的全人源单克隆抗体。本发明的全人源单克隆抗体包括克隆m826和克隆m827。
[0010]本发明还公开了所述抗体的抗原结合片段，双特异性抗体，及与效应分子的偶联物。本发明公开的抗体和组合物可以用于，比如说，人感染H7N9亚型禽流感的预防和治疗。
[0011]在本发明的一些实施方式中，单克隆抗体，或抗原结合片段的轻链可变区的氨基酸序列和/或重链可变区的氨基酸序列，包含至少一个(比如三个)克隆m826或克隆m827 的轻链和/或重链可变区的互补决定区(CDR)。
[0012]本发明中，
[0013]m826轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO: 1所示；
[0014]m826重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示；
[0015]m826轻链可变区CDR1的氨基酸序列如SEQ ID N0:3所示；
[0016]m826轻链可变区CDR2的氨基酸序列如SEQ ID N0:4所示；
[0017]m826轻链可变区CDR3的氨基酸序列如SEQ ID N0:5所示；
[0018]m826重链可变区CDR1的氨基酸序列如SEQ ID N0:6所示；
[0019]m826重链可变区CDR2的氨基酸序列如SEQ ID N0:7所示；
[0020]m826重链可变区CDR3的氨基酸序列如SEQ ID N0:8所示；
[0021]m827轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID N0:9所示；
[0022]m827重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO: 10所示；
[0023]m827轻链可变区CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO: 11所示；
[0024]m827轻链可变区CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO: 12所示；
[0025]m827轻链可变区CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO: 13所示；
[0026]m827重链可变区CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO: 14所示；
[0027]m827重链可变区CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO: 15所示；
[0028]m827重链可变区CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO: 16所示。
[0029]此外，本发明还公开了编码这些单克隆抗体，抗原结合片段，双特异性抗体，及偶联物的核酸。在本发明的一些实施方案中，公开了包含这些核酸的载体，及包含这些载体的宿主细胞。在进一步的实施方案中，公开了包含这些单克隆抗体，抗原结合片段，双特异性抗体，偶联物，核酸，和载体的药用组合物。
[0030]在本发明其它实施方案中，所述的单克隆抗体，抗原结合片段，双特异性抗体，偶联物，核酸，和载体被用来检测，预防，或治疗H7N9亚型禽流感。
[0031]更具体的，本发明提供了一种全人源单克隆抗体，或抗原结合片段，其特征在于， 其包含:抗体的轻链可变区含有SEQ ID NO: 1的27-32位，50-52位，和/或89-97位氨基酸，及抗体的重链可变区含有SEQ ID N0:2的26-33位，51-58位，和/或97-110位氨基酸；或抗体的轻链可变区含有SEQ ID NO:9的27-32位，50-52位，和/或89-97位氨基酸残基， 及抗体的重链可变区含有SEQ ID NO: 10的26-33位，51-58位，和/或97-110位氨基酸残基，其中，所述的单克隆抗体或抗原结合片段特异性结合H7N9亚型禽流感病毒。
[0032]本发明中，所述的单克隆抗体或抗原结合片段，其包含:抗体的轻链可变区含有 SEQ ID NO: 1的27-32位，50-52位，和89-97位氨基酸，及抗体的重链可变区含有SEQ ID N0:2的26-33位，51-58位，和97-110位氨基酸；或抗体的轻链可变区含有SEQ ID N0:9 的27-32位，50-52位，和89-97位氨基酸残基，及抗体的重链可变区含有SEQ ID NO: 10的 26-33位，51-58位，和97-110位氨基酸残基。
[0033]本发明中，所述的单克隆抗体或抗原结合片段，其中:所述的轻链可变区的氨基酸序列与SEQ ID NO: 1具有至少90%的相同性，且所述的重链可变区的氨基酸序列与SEQ ID N0:2具有至少90%的相同性；或所述的轻链可变区的氨基酸序列与SEQ ID N0:9具有至少 90%的相同性，且所述的重链可变区的氨基酸序列与SEQ ID NO: 10具有至少90%的相同性。
[0034]本发明中，所述的单克隆抗体或抗原结合片段，其中的单克隆抗体或抗原结合片段是全人源的。
[0035]本发明中，单克隆抗体为IgG ;抗原结合片段是scFv, Fv, Fab或F(ab)2。
[0036]本发明提供了一种双特异性抗体，其含有上述的单克隆抗体或抗原结合片段。
[0037]本发明中，上述的单克隆抗体或抗原结合片段，或双特异性抗体，与一种效应分子偶联；所述的偶联物，其中的效应分子是可检测标记；所述的可选自检测标记是荧光标记， 放射性标记，亲和素，生物素，或酶；其中的效应分子是毒素如绿脓杆菌外毒素，或化疗剂；
[0038]本发明还提供了一种核酸分子，其编码所述的单克隆抗体或抗原结合片段，所述的核酸分子，可操作地连接至启动子。
[0039]本发明还提供了一种质粒，含有所述的核酸分子；所述的质粒是一种病毒质粒。
[0040]本发明还提供了一种宿主细胞，含有所述的质粒。
[0041]本发明还提供了一种在生物样品中检测H7N9亚型禽流感病毒血凝素蛋白的方法，其特征在于，其中:
[0042]含有生物样品，所述的单克隆抗体或抗原结合片段，所述的双特异性抗体，或所述的偶联物，在足以形成免疫复合物的条件下，检测免疫复合物的存在与否，其中免疫复合物的存在表示生物样品中存在H7N9亚型禽流感病毒血凝素蛋白；
[0043]所述的方法中，样品来源于人类或来源于禽类。
[0044]本发明还提供了一种检测受试者是否患有H7N9亚型禽流感的方法，其特征在于， 其中:
[0045]含有来源于疑似感染H7N9亚型禽流感的受试者的生物样品，及有效剂量的所述的单克隆抗体或抗原结合片段，所述的双特异性抗体，或所述的偶联物，并检测单克隆抗体，抗原结合片段，双特异性抗体，或偶联物的结合，其中单克隆抗体，抗原结合片段，双特异性抗体，或偶联物的结合相比阴性对照增加表示受试者患有H7N9亚型禽流感；
[0046]所述的方法中，阴性对照是一个参比标准，或单克隆抗体，抗原结合片段，双特异性抗体，或偶联物与来源于健康受试者的样品的结合；其中的样品选自血液，血清，血浆，痰液，或活检样品。
[0047]本发明还提供了一种药用组合物，其含有有效预防剂量的所述的单克隆抗体或抗原结合片段，所述的双特异性抗体，所述的偶联物，所述的核酸，或所述的质粒，和一种药学可接受载体。
[0048]本发明同时提供了一种药用组合物，其含有有效治疗剂量的所述的单克隆抗体或抗原结合片段，所述的双特异性抗体，所述的偶联物，所述的核酸，或所述的质粒，和一种药学可接受载体。
[0049]本发明在国际上首次获得了针对H7N9亚型禽流感病毒的全人源单克隆抗体，及其抗原结合片段。并经试验表明，利用此抗体CDR区或部分或全基因，可在原核和真核细胞及任何表达系统中改造和生产不同形式的基因工程抗体，可用于制备在临床上预防或治疗 H7N9亚型禽流感病毒相关疾病的制剂。
[0050]为了便于理解，以下将通过具体的附图和实施例对本发明进行详细地描述。需要特别指出的是，具体实例和附图仅是为了说明，显然本领域的普通技术人员可以根据本文说明，在本发明的范围内对本发明做出各种各样的修正和改变，这些修正和改变也纳入本发明的范围内。另外，本发明引用了公开文献，这些文献是为了更清楚地描述本发明，它们的全文内容均纳入本文进行参考，就好像它们的全文已经在本文中重复叙述过一样。【附图说明】
[0051]图1.利用多克隆噬菌体ELISA检测针对H7N9亚型禽流感病毒HA的抗体富集。
[0052]图2.利用ELISA检测特异性抗原结合片段(Fab)与H7N9亚型禽流感病毒HA的结合能力。
[0053]图3.利用ELISA检测特异性单克隆抗体(IgGl)与H7N9亚型禽流感病毒HA的结合能力。
[0054]图4.m826抗体对H7N9亚型禽流感病毒中和能力的检测。
[0055]图5.m826抗体能够有效的诱导抗体介导的细胞毒性(ADCC)作用。【具体实施方式】
[0056]实施例1
[0057]1)制备H7N9亚型禽流感病毒HA蛋白
[0058]将合成的H7N9亚型禽流感病毒HA基因(SH2)与IgGIFc融合到一起，插入到表达质粒中，将表达质粒瞬时转染293FREESTYLE细胞，表达HA1 (SH2) -Fc蛋白并进行纯化；用同样的方法表达没有IgGl Fc标签的HA1蛋白，及三聚体形式的HA1蛋白；
[0059]2)筛选H7N9亚型禽流感病毒特异性抗原结合片段(Fab)[〇〇6〇] 使用利用40个健康志愿者的外周血单核细胞cDNA构建的大型噬菌体展示抗体文库，针对生物素标记的HA1(SH2)-Fc蛋白，及商业化的HA-SH1、HA-SH2蛋白筛选抗体； 1012个噬菌体展示的Fab在常温下于1，2, 3, 4轮分别与5, 3, 3, 1微克抗原孵育两小时，将 HA1 (SH2)-Fc，HA-SH1，HA-SH2蛋白包被在ELISA板上，用多克隆噬菌体ELISA检测抗体的富集；第1，2, 3, 4轮的噬菌体与包被的蛋白孵育，用抗噬菌体的HRP耦合抗体检测噬菌体与蛋白的结合(如图1所示)，多克隆噬菌体ELISA结果显示，利用表达的HA1(SH2)-Fc蛋白作为抗原进行的抗体筛选，在第4轮筛选后得到了非常显著的富集；利用商业化的HA-SH1、HA-SH2蛋白作为抗原进行的筛选，在第4轮筛选后得到一定富集，但程度远弱于利用所述的表达的HA1 (SH2)-Fc蛋白作为抗原进行的筛选，因此，本发明中选用HA1 (SH2)-Fc蛋白第 3, 4轮筛选获得的噬菌体，感染TG1细胞并随机挑选克隆进行单克隆噬菌体ELISA，进一步进行测序鉴定富集的Fab ;
[0061]3)检测特异性抗原结合片段(Fab)与H7N9亚型禽流感病毒HA的结合能力
[0062]根据测序结果选择十个克隆，命名为m820-m829,它们的可溶性表达产物的制备基本按现有技术的方法进行；具体为:将含有克隆m820-m829的质粒转入HB2151感受态细胞，从过夜生长的氨苄平皿中挑取单个菌落，接种SB细菌培养液，在30度IPTG诱导条件下表达10-12小时，收获细菌并从中提取纯化Fab ;将HA1 (SH2) -Fc，HA-SH1，HA-SH2蛋白包被在ELISA板上，加入梯度浓度稀释的m820-m829 Fab孵育，用抗FLAG标签抗体检测Fab与 H7N9亚型禽流感病毒HA的结合能力(如图2所示)，ELISA结果显示，十个Fab克隆中有两个不能结合HA，有八个能结合HA，其中有三个与HA结合能力较弱，另五个与HA结合能力很强，本发明从中挑选两个结合能力最强的克隆，m826和m827,转换成单克隆抗体IgGl的形式并进行进一步表征；
[0063]4)检测单克隆抗体(IgGl)与H7N9亚型禽流感病毒HA的结合能力
[0064]按现有技术的方法进行Fab转换成IgGl并进行表达纯化，具体为:将Fab的轻链与重链可变区分别用PCR扩增，并插入到IgGl的表达载体中，构建成单克隆抗体表达载体， 将表达质粒瞬时转染293 FREESTYLE细胞，表达IgGl并利用Protein G树脂进行纯化，将 HA蛋白包被在ELISA板上，加入梯度浓度稀释的m820或m827 IgGl孵育，用抗IgGIFc标签抗体检测IgGl与H7N9亚型禽流感病毒HA的结合能力(如图3所示)，ELISA结果显示， 单克隆抗体m826和m827均能高亲和力结合H7N9亚型禽流感病毒HA，亲和力约为InM (如图3左所示)，单克隆抗体m826能特异性结合H7N9和H7N7亚型禽流感病毒HA，而不结合 H1N1和H3N2亚型禽流感病毒HA(如图3右所示)，作为阴性对照的无关抗体ml02.4不结合任一种禽流感病毒HA ;
[0065]5)检测m826抗体对H7N9亚型禽流感病毒中和能力
[0066]将H7N9亚型禽流感病毒HA蛋白，NA蛋白，和表达荧光素酶作为报告基因缺陷的 HIV-1基因，共同转染293T细胞，包装H7N9亚型禽流感假病毒；将m826和无关抗体m610.27 梯度稀释，与假病毒一起感染MDCK细胞，孵育后检测细胞裂解液luciferase ;初步结果如图4所示，m826抗体与对照抗体m610.27相比，能够中和H7N9亚型禽流感假病毒；
[0067]6)m826诱导抗体介导的细胞毒性(ADCC)作用实验
[0068]将25微升的H9/IIIB(2.5X 104个)细胞铺至96孔板，然后将m826，m827和无关抗体M梯度稀释，加入到表达H7N9亚型禽流感病毒HA的H9/IIIB细胞中(50 y 1)，然后将 ADCC效应细胞(promega) 25微升(1.5X 105个)加入到H9/IIIB中，37度温育24h后测其 luciferase，结果如图5所示，m826抗体能有效诱导抗体介导的ADCC作用。
【主权项】
1.一种全人源单克隆抗体，或抗原结合片段，其特征在于，其包含:抗体的轻链可变区含有SEQ ID NO: 1的27-32位，50-52位，和/或89-97位氨基酸，及 抗体的重链可变区含有SEQ ID N0:2的26-33位，51-58位，和/或97-110位氨基酸；或 抗体的轻链可变区含有SEQ ID NO:9的27-32位，50-52位，和/或89-97位氨基酸残 基，及抗体的重链可变区含有SEQ ID NO: 10的26-33位，51-58位，和/或97-110位氨基酸 残基，其中，所述的单克隆抗体或抗原结合片段特异性结合H7N9亚型禽流感病毒。2.按权利要求1所述的单克隆抗体或抗原结合片段，其特征在于，其包含:抗体的轻链可变区含有SEQ ID NO: 1的27-32位，50-52位，和89-97位氨基酸，及抗体 的重链可变区含有SEQ ID NO: 2的26-33位，51-58位，和97-110位氨基酸；或抗体的轻链可变区含有SEQ ID NO: 9的27-32位，50-52位，和89-97位氨基酸残基，及 抗体的重链可变区含有SEQ ID NO: 10的26-33位，51-58位，和97-110位氨基酸残基。3.按权利要求1或2所述的单克隆抗体或抗原结合片段，其特征在于，其中:所述的轻链可变区的氨基酸序列与SEQ ID NO: 1具有至少90%的相同性，且所述的重链可变区的氨基酸序列与SEQ ID N0:2具有至少90%的相同性；或所述的轻链可变区的氨基酸序列与SEQ ID N0:9具有至少90%的相同性，且所述的重 链可变区的氨基酸序列与SEQ ID NO: 10具有至少90%的相同性。4.按权利要求1-3中任一项所述的单克隆抗体或抗原结合片段，其特征在于，其中的 单克隆抗体或抗原结合片段是全人源的。5.按权利要求1-4中任一项所述的单克隆抗体或抗原结合片段，其特征在于，其中的 单克隆抗体为IgG。6.权利要求1-4中任一项所述的单克隆抗体或抗原结合片段，其特征在于，其中抗原 结合片段是scFv, Fv, Fab或F (ab) 2。7.—种双特异性抗体，含有权利要求1-6中任一项所述的单克隆抗体或抗原结合片段。8.权利要求1-6中任一项所述的单克隆抗体或抗原结合片段，或权利要求7所述的双 特异性抗体，与一种效应分子偶联。9.权利要求8所述的偶联物，其中的效应分子是可检测标记。10.权利要求9所述的偶联物，其中的可检测标记是荧光标记，放射性标记，亲和素，生 物素，或酶。11.权利要求8所述的偶联物，其中的效应分子是毒素或化疗剂。12.权利要求11所述的偶联物，其中的毒素是绿脓杆菌外毒素。13.—种核酸分子，其编码权利要求1-6中任一项所述的单克隆抗体或抗原结合片段， 权利要求7所述的双特异性抗体，或权利要求8-12中任一项所述的偶联物。14.权利要求13所述的核酸分子，可操作地连接至启动子。15.—种质粒，含有权利要求13或权利要求14所述的核酸分子。16.权利要求15所述的质粒，其中质粒是一种病毒质粒。17.—种宿主细胞，含有权利要求15或权利要求16所述的质粒。18.—种在生物样品中检测H7N9亚型禽流感病毒血凝素蛋白的方法，其特征在于，其中:含有生物样品，及权利要求1-6中任一项所述的单克隆抗体或抗原结合片段，权利要 求7所述的双特异性抗体，或权利要求8-12中任一项所述的偶联物，在足以形成免疫复 合物的条件下，检测免疫复合物的存在与否，其中免疫复合物的存在表示生物样品中存在 H7N9亚型禽流感病毒血凝素蛋白。19.按权利要求18所述的方法，其特征在于，其中样品来源于人类。20.按权利要求18所述的方法，其特征在于，其中样品来源于禽类。21.—种检测受试者是否患有H7N9亚型禽流感的方法，其特征在于，其中:含有来源于疑似感染H7N9亚型禽流感的受试者的生物样品，及有效剂量的权利要求 1-6中任一项所述的单克隆抗体或抗原结合片段，权利要求7所述的双特异性抗体，或权利 要求8-12中任一项所述的偶联物，并检测单克隆抗体，抗原结合片段，双特异性抗体，或偶 联物的结合，其中单克隆抗体，抗原结合片段，双特异性抗体，或偶联物的结合相比阴性对 照增加表示受试者患有H7N9亚型禽流感。22.按权利要求21所述的方法，其特征在于，其中阴性对照是一个参比标准，或单克隆 抗体，抗原结合片段，双特异性抗体，或偶联物与来源于健康受试者的样品的结合。23.按权利要求21或权利要求22所述的方法，其特征在于，其中的样品选自血液，血 清，血浆，痰液，或活检样品。24.—种药用组合物，其特征在于，含有有效预防剂量的权利要求1-6中任一项所述的 单克隆抗体或抗原结合片段，权利要求7所述的双特异性抗体，权利要求8-12中任一项所 述的偶联物，权利要求13-14中任一项所述的核酸，或权利要求15-16中任一项所述的质 粒，和一种药学可接受载体。25.—种药用组合物，其特征在于，含有有效治疗剂量的权利要求1-6中任一项所述的 单克隆抗体或抗原结合片段，权利要求7所述的双特异性抗体，权利要求8-12中任一项所 述的偶联物，权利要求13-14中任一项所述的核酸，或权利要求15-16中任一项所述的质 粒，和一种药学可接受载体。
【文档编号】C12N15/85GK105985433SQ201510064906
【公开日】2016年10月5日
【申请日】2015年2月9日
【发明人】应天雷, 姜世勃, 陆路, 贺彪, 孙志武
【申请人】复旦大学