一种禽流感病毒的检测方法
【技术领域】
[0001]本发明属于禽流感病毒免疫检测领域，尤其涉及到一种用表面等离子体谐振(Surface Plasmon Resonance, SPR)技术检测禽流感病毒的方法以及用于上述方法的SPR生化分析仪芯片及试剂盒。
【背景技术】
[0002]人禽流行性感冒又称人禽流感，是由禽甲型流感病毒某些亚型中的一些毒株弓I起的急性呼吸道传染病。据世界卫生组织资料，禽流感为病毒诱发的动物传染病，通常仅感染鸟类，偶尔感染猪。禽流感病毒具有高度物种特异性，但偶尔也跨越物种屏障，感染人类。
[0003]根据抗原特性及其基因的不同，流感病毒分为A、B、C三型，也被称为甲、乙、丙三型。A型(即甲型)攻击力最强，也最常见，禽流感病毒就属于A型流感病毒。流感病毒表面密布的糖蛋白也即抗原结构分H和N两大类,H代表Hemagglutinin (血细胞凝集素),可帮助病毒与呼吸道黏膜上皮细胞表面的相应受体结合，吸附可宿主的呼吸道上皮细胞上。N代表Neuramidinase (神经氨酸)，可帮助病毒作用于核蛋白的受体，使病毒和上皮细胞的核蛋白结合，在核内组成RNA型可溶性抗原，并渗出至胞质周围，复制子代病毒，以出芽方式排出上皮细胞，排出的病毒扩散至附近细胞，产生炎症反应，临床上出现发热，肌肉痛和白细胞减低等全身毒血症样反应。A型流感病毒根据H和N抗原不同，又分为许多亚型，H分为15个亚型(Hl?H15)，N分为9个亚型(NI?N9)，H N组合可以有144种可能。不过，目前仅有3种组合——H1NUH2N2以及H3N2具有感染人类的能力，其他组合如H5N1型禽流感病毒虽然偶尔也传染给人类，但自然宿主仍然主要是多种禽类和动物。AIV基因共编码至少 10 种蛋白质(PA、PB1、PB2、HA、NA、NP、M1、M2、NS1、NS2 等)。除 NSl 与 NS2 为非结构蛋白外，其余均为结构蛋白，其中HA和NA为糖基化的结构蛋白，其它均为非糖基化结构蛋白。
[0004]最早的禽流感记录在1878年，意大利发生鸡群大量死亡，当时被称为鸡瘟。到1955年，科学家证实其致病病毒为甲型流感病毒。此后，这种流行性疾病被更名为禽流感。1999年3月至11月，英国伦巴第地区暴发禽流感，到次年3月1300万只病禽被捕杀。2002年10月，美国加州暴发禽流感，仅加州就销毁326多万只鸡；4月，荷兰发生禽流感，人类感染者达80人，并出现死亡病例。自从2003年以来，禽流感病毒持续在全球蔓延，造成数千万只家禽被宰杀销毁，染病死亡者已达数十人。由于存在大流行的潜在危险，因此引起了广泛的关注。
[0005]禽流感被发现100多年来，人类并没有掌握有效的预防和治疗方法，仅能以消毒、隔离、大量宰杀禽畜的方法防止其蔓延。目前，国际上加强了对于禽流感检测技术的研究。禽流感特异性的检测实验可以分为直接检测病毒法和基于抗体的检测方法两类。直接检测法包括传统的病毒培养，以及检测特异性的病毒抗原或核酸。目前，随着仪器微型化和计算技术的发展，人类不仅能够迅速判断病毒的亚型，还能够对病毒的全基因组进行测定，并且对单个病毒进行遗传分析。基于抗体的禽流感病毒检测方法包括传统的琼脂糖凝胶免疫扩散以及红血球凝集抑制法，还有基于ELISA的方法，这些方法提供了禽流感的现场筛查和确定禽流感病毒亚型的检测方法。抗原捕获和侧流ELISA方法(试纸条)是被广泛应用的禽流感检测方法，这些方法最初是应用于人感染禽流感的临床诊断的，后来迅速发展被应用于畜牧业。
[0006]但是这些方法具有如下缺点:
[0007]ELISA方法操作过程复杂，检测时间长，不适合现场快速检测；试纸条方法简单快速，但是读数具有主观性，准确性低。
[0008]SPR检测技术的原理如错误！未找到引用源。所示。具有横磁(TransverseMagnetic, TM)偏振的平行入射光通过棱镜耦合，照射在传感芯片上，入射光与传感芯片表面的金属膜的表面等离子体波发生谐振，在棱镜的另一侧采用光检测装置检测出射光的强度。在金属膜的表面，制备有敏感膜(如抗体、受体等分子)。微流通道覆盖在传感芯片的表面，用于引入待测样品。当待测样品中含有与敏感膜发生特异性反应的物质(如抗原)时，出射光的强度会发生改变。利用SPR检测禽流感病毒可以实现禽流感病毒的现场快速检测，而且具有操作简单，准确性高的特点。目前国内外还没有利用检测禽流感病毒的便携式SPR仪、方法以及试剂盒的相关论文及专利。
【发明内容】
[0009]为解决现有技术中存在的上述问题，本发明将便携式表面等离子体谐振生化分析仪应用于禽流感病毒的检测，并且提供检测方法与芯片以及试剂盒。本发明提出的检测方法无需标记，现场快速、操作简单等特点，可实现自动化。
[0010]本发明提出了一种禽流感病毒检测方法，其包括:
[0011]步骤1、将从环境中获取的待测样品注入SPR生化分析仪；
[0012]步骤2、在所述SPR生化分析仪中，待测样品在SPR敏感芯片表面反应预定时间；
[0013]步骤3、SPR生化分析仪计算出禽流感病毒的浓度数值，并根据预先设定的警戒值进行报警或不报警；
[0014]其中，所述SPR敏感芯片为其表面固定有禽流感病毒抗体或禽流感病毒抗原的SPR金属片。
[0015]其中，所述SPR敏感芯片表面固定有禽流感病毒抗体时，步骤I中所述待测样品直接注入SPR分析仪。
[0016]其中，所述SPR敏感芯片表面固定有禽流感病毒抗原时，所述待测样品需要进行预处理,并与禽流感病毒抗体混合后注入SPR分析仪。
[0017]其中，所述预处理包括将待测样品经过裂解液裂解并温浴一段时间后注入SPR生化分析仪。
[0018]其中，SPR分析仪通过检测SPR敏感芯片表面的折射率的变化而检测禽流感病毒。
[0019]其中，所述固定在SPR敏感芯片上的禽流感病毒抗体为针对禽流感病毒表面蛋白NA的抗体，所述固定在SPR敏感芯片上的禽流感病毒抗原是指禽流感内部蛋白Ml。
[0020]其中，所述SPR敏感芯片为其基板为玻璃或塑料，基板表面有两层金属膜，下层为铬膜，上层为金膜或银膜，上层金膜或银膜的厚度为40-50nm，下层铬膜的厚度为3_7nm。
[0021]其中，在所述SPR敏感芯片上固定禽流感病毒抗体或抗原的过程如下:
[0022]将表面的金属膜经过葡聚糖修饰的SPR敏感芯片用去离子水清洗，并将其表面吹干；将SPR敏感芯片浸泡在0.4M N-羟基琥珀酰亚胺(EDC)和0.1M N-乙基-N’ - ( 二甲氨基丙基)碳二亚胺(NHS)的混合液中，SPR敏感芯片表面进行活化10分钟，活化后用去离子水清洗后吹干；将禽流感病毒抗体用PH4.2-4.6醋酸缓冲液稀释至适当的浓度后，滴加在芯片表面以制备固定有禽流感病毒抗体的SPR敏感芯片，或将禽流感病毒抗原用pH值4.2-4.6醋酸缓冲液稀释至适当的浓度后，滴加在芯片表面以制备固定有禽流感病毒抗原的SPR敏感芯片；20°C反应5分钟；将芯片泡入IM乙醇胺溶液中反应10分钟，以灭活剩余的结合位点；快速将芯片用去离子水吹干，置于4°C保存。
[0023]其中，所述裂解液为Triton或SDS，工作浓度为10% -0.5%;温浴的温度为25-45度，温浴的时间10-90分钟。
[0024]其中，被检测的禽流感病毒包括所有亚型的完整禽流感病毒颗粒或病毒碎片，以及以任伺已知的方式获得的禽流感病毒结构蛋白；所述待测样品包括水、土壤或空气。
[0025]本发明所采用的生化分析仪便携式表面等离子体谐振生化分析仪为中国科学院电子学研究所传感技术国家重点实验室自行