表达H7N9亚型禽流感病毒血凝素蛋白的重组火鸡疱疹病毒株rHOH及构建方法与流程

本发明属于分子生物学和生物技术领域的重组病毒载体疫苗，具体涉及一种能够表达具H7N9亚型禽流感病毒(Avian Influenza virus,AIV)血凝素HA蛋白的重组火鸡疱疹病毒(HVT)，该重组病毒可用于免疫家禽预防H7N9亚型禽流感病毒中的用途。

背景技术：

感染人的H7N9亚型禽流感于2013年首次爆发我国华东的长三角地区，是一株三源重组的新型禽流感病毒，对家禽不致病或低致病性。截止目前已经扩散至全国除西藏和内蒙古自治区外的所有地区，珠江三角区是继长三角地区后的又一新的爆发疫源地。根据WHO的统计显示，截止到2016年6月13日，一共有781例人感染H7N9的案例，其中死亡313人，死亡率在40％左右。根据flutracters的追踪报道，截止到2016年7月，H7N9感染人的案例已经突破800。其增长速度直逼自从2003年以来人感染H5亚型禽流感数量已经高达851例，由此可见人感染H7N9的数量增长势头迅猛，对公共卫生的危害不容小觑。由于家禽感染不发病，感染的病例多有与活期接触的流行病史，因此，活禽市场的家禽的H7N9疫情状态具有直接对公共卫生健康的影响巨大。并且人感染H7N9的高峰季节也与家禽的流行规律息息相关。然而目前临床尚无针对H7N9的家禽疫苗用于防控此类疾病，因此亟需研制新型的疫苗来保护家禽，降低疫情对公共的危害。

火鸡疱疹病毒(Herpesvirus of Turkey,HVT)是一种典型无致病性的α疱疹病毒。因HVT与鸡马立克病毒(Marek's disease virus，MDV)在遗传学和血清学上具有相关性，自1970年以来，HVT Fc-126株作为MD疫苗被广泛使用。该疫苗具有不会引发致瘤发生、保护效果良好、在体内持续存在、可以冻干、便于储存和运输等诸多优点，在MD的防控过程中发挥了重要的作用。近年来，HVT作为病毒载体方面的研究取得了许多进展，因HVT与其它禽病毒载体相比具有许多独特优势，包括：HVT对鸡及其他动物无致病性，安全性好；可以在动物体内持续存在、有利于外源基因的持续表达、刺激机体产生较高的抗体水平；HVT可引起高强度的细胞介导的免疫反应、免疫出现早、持续时间长、接种一次可达到终生免疫；HVT重组疫苗具有生产成本低、可以冻干、易于贮存和运输；HVT具有很强的细胞结合特性、病毒于细胞间传播、因此作为重组疫苗，可以突破母源抗体的干扰等[Bublot,M.,et al.,Use of a vectored vaccine against infectious bursal disease of chickens in the face of high-titred maternally derived antibody.J Comp Pathol,2007.137Suppl 1:p.S81-4.]。目前，传染性法氏囊病毒等多种禽病保护性抗原均已在HVT载体中成功表达[Tsukamoto,K.,et al.,Complete,Long-Lasting Protection against Lethal Infectious Bursal Disease Virus Challenge by a Single Vaccination with an Avian Herpesvirus Vector Expressing VP2Antigens.Journal of Virology,2002.76(11):p.5637-5645.]。应用上述水平制备的VaxxitexRHVT+IBD重组疫苗已经获得生产许可，成为商品化的以疱疹病毒为载体的动物源性疫苗，使HVT成为最具有开发前景的病毒载体。其技术核心利用同源重组原理：通过外源基因两侧的非必需区同源臂与HVT基因组相对应区段进行同源交换，从而将外源基因导入基因组中。1992年Morgan等人首次利用同源重组方法构建了表达NDV(F)基因的重组HVT，该重组病毒既能抵抗致死性MDV的攻击，又能预防新城疫，其保护率接近传统疫苗的保护效果[Morgan,R.W.,et al.,Protection of chickens from Newcastle and Marek's diseases with a recombinant herpesvirus of turkeys vaccine expressing the Newcastle disease virus fusion protein.Avian Dis,1992.36(4):p.858-70.]。后来，Gao等人使用上述方法将AIV H5N1(HA)基因插入到HVT基因组不同的位置中，构建了两株rHVT重组病毒，疫苗试验表明这两株重组病毒均可以同时抵抗AI和MD[Gao,H.,et al.,Expression of HA of HPAI H5N1Virus at US2Gene Insertion Site of Turkey Herpesvirus Induced Better Protection than That at US10Gene Insertion Site.PLoS ONE,2011.6(7):p.e22549.]。

内源性启动子具有克服针对抗原的母源抗体干扰作用。MDV基因的转录和翻译，是受到严格调控的。如当病毒感染细胞时，病毒基因的表达分为3个时期：立即早期、迟早期和晚期。但是，以MDV构建重组病毒时，异源的强启动子受到病毒的调控较少，在重组病毒免疫的早期，该启动子所控制地保护抗原基因大量表达，与机体中针对该抗原的母源抗体发生反应，使得针对该抗原的母源抗体下降，从而降低了机体对某种疾病的早期保护。Sonoda等(Sonoda,Kengo,et al."Development of an effective polyvalent vaccine against both Marek's and Newcastle diseases based on recombinant Marek's disease virus type 1in commercial chickens with maternal antibodies."Journal of virology 74.7(2000):3217-3226.)利用MDVI型自身的gB启动子构建重组病毒，表达NDV的F基因，免疫商品鸡，可以提供100％的保护，同时，并不影响重组病毒的稳定性。因此，进一步证实了MDV I型自身的gB启动子受到严格地调控，可以避免母源抗体的干扰，保证了免疫保护力。

影响外源基因表达水平的因素很多，而密码子的选择是其中重要的参数之一，基因表达水平与嗜好密码子的使用程度之间存在强的相关性。每个氨基酸平均有三个对应密码子，这使得不同的核苷酸序列可以编码出相同的氨基酸序列，而编码同一氨基酸的不同的密码子在不同的生物和不同基因中的使用频率有着显著的差异，这与在细胞中相应的tRNA的浓度是呈正相关的。使用频率极低的就是该物种或基因的稀有密码子，稀有密码子的使用已经被证实为阻碍基因表达的一个重要因素，因此去除稀有密码子能够显著提高一个基因的翻译速度。每个物种都有对应的偏嗜密码子，因此为了提高外源基因在一个物种体内的翻译和表达水平，常常对外源基因密码子进行改造，使之符合该物种的密码子偏嗜分布。Jiang(Jiang,Yongping,et al."Enhanced protective efficacy of H5subtype avian influenza DNA vaccine with codon optimized HA gene in a pCAGGS plasmid vector."Antiviral research 75.3(2007):234-241.)等人对H5的HA密码子优化(optiHA)插入到真核表达质粒pCAGGS上免疫SPF鸡，优化后的optiHA能够显著提高H5亚型禽流感DNA疫苗诱导的保护性抗体免疫反应水平，增强免疫保护效果。

此外，多家跨国公司已经研制出以HVT为载体的商品化疫苗。其中，法国梅里亚公司的HVT用来表达传染性法氏囊病(IBD)的VP2基因，即可用来预IBD，又能预防马立克氏病(MD)，目前已经在70多个国家销售使用。诗华公司的HVT系列产品中，ND表达新城疫病毒(NDV)的F基因，用于预防ND和MD；AI表达clade2.2(A/swan/Hungary/4999/2006)H5N1的HA蛋白，用于预防不同亚型的H5高致病性禽流感和MD，保护率在80％-100％。目前已经在埃及，蒙古，越南等多个国家的家禽养殖业中投入使用，发挥了巨大的经济效益。

技术实现要素：

本发明目的在于构建表达H7N9亚型禽流感血凝素蛋白的重组HVT病毒，为研制H7N9亚型禽流感的疫苗提供基础。

本发明表达H7N9亚型AIV血凝素蛋白的重组火鸡疱疹病毒株rHOH，是火鸡疱疹病毒血清3型FC126株重组毒株，其保藏号CGMCC NO.12985。

所述的重组火鸡疱疹病毒株rHOH，它的gB启动子来源于火鸡疱疹病毒载体FC126自身；表达的外源抗原(血凝素蛋白)基因经Gallus Gallus的密码子偏嗜性优化，核苷酸的序列发生改变，但不改任何变氨基酸序列。

本发明的第二个目的在于提供高效表达H7N9亚型禽流感病毒HA的HVT重组病毒的构建方法，该方法包括以下步骤：

(1)先获得密码子优化过的OHA和HVT的gB(HgB)启动子，在带有同源臂的pCMGFP上EcoRV、NheI与Kpn2I酶切位点(核苷酸位置140408-140651之间)依次进行连接替换HgB启动子和表达外源的OHA基因；连接完后的质粒，转化到Takala的JM109感受态细胞内37度培养过夜，挑斑提质粒双酶切和测序鉴定，阳性的质粒命名为pHOH；所述OHA序列如SEQ ID NO:1，HgB启动子序列如SEQ ID NO:2；

(2)将中间转移质粒pHOH与表达GFP荧光蛋白的重组火鸡疱疹病毒(rHVT-GFP)的DNA进行磷酸钙共转染，筛选出不带荧光的病毒蚀斑后，并经过间接免疫荧光(IFA)和测序鉴定，该不带荧光的蚀斑即为带有H7N9的HA的重组火鸡疱疹病毒rHOH。

本发明还公开了所述重组火鸡疱疹病毒株rHOH在制备预防H7N9亚型禽流感病毒的疫苗中的用途。

本发明的优点在于：本发明供了一种用于预防H7N9亚型禽流感的候选疫苗毒株，接种孵化后第18日龄的鸡胚或1日龄的雏鸡，预防和控制家禽的H7N9疫情，保护公众卫生和安全。

附图说明

图1 HVT的gB(HgB)启动子，M为200bp的Marker，1为742bp的HgB启动子。

图2中间转移质粒pHOH图谱。

图3转移质粒pHOH的双酶切鉴定，M为1000bp的marker，1和2同为经EcoRV和NheI双酶切。

图4同源重组示意图

图5 rHOH的IFA结果和阴性对照，(左边为阴性对照，右边为阳性结果)。

图6重组质粒pHOH构建示意图。

图7重组病毒rHOH转染、同源重组以及筛选鉴定示意图。

本发明毒株rHOH于2016年9月5日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，分类命名为火鸡疱疹病毒血清3型FC126株重组毒株；保藏号CGMCC NO.12985。

具体实施方式

材料

rHVT-GFP和pCMGFP由由扬州大学农业部畜禽传染病重点实验室构建保存，参见专利申请公布号：CN105002146A。H7N9亚型禽流感JX148株(A/chicken/Zhejiang/JX148/2014)由扬州大学农业部畜禽传染病重点实验室分离保存，鸡胚效价为10，血凝抑制反应证明JX148的多抗血清与其他亚型的H7N9具有较高的交叉反应性。

pCR2.1载体：购自Invitrogen公司；High fidelity DNA polymerase、T4DNA连接酶、Agarose Gel DNA Extraction Kit购自Roche公司；质粒抽提试剂盒(QIAprep Spin MiniPrep Kit)为QIAGEN公司产品；其余常规试剂均为国产分析纯。

步骤1.密码子优化与合成

根据JX148HA的序列(EPI_ISL_235293)，交由南京金斯瑞公司参照鸡(Gallus gallus)的密码子偏嗜(http://www.kazusa.or.jp/codon/cgi-bin/showcodon.cgi？species＝9031)进行密码子优化与合成optiHA(OHA：SEQ ID NO:1)，添加酶切位点后克隆到UC57载体上(由金斯瑞公司提供)，命名为UC57-OHA。

步骤2.扩增HVT的内源性gB启动子

使用DNeasy Blood tissue kit抽提FC126(GenBank:AF291866)的基因组DNA。使用Gene promoter miner(http://gpminer.mbc.nctu.edu.tw/index.php)在线预测分析启动子含有TAAT和CAAT等真核生物启动子的顺式作用元件。并合成引物，PCR克隆FC126的gB启动子(HgB，SEQ ID NO:2)，并在启动子首位末端均添加EcoRV和NheI限制性内切酶位点和保护性碱基。引物序列如下

gB-F:gatatcATTGTTCAATCATGATGTCCA(SEQ ID NO:3)

gB-R:gctagcGAGTTCCACCGACCGTATGA(SEQ ID NO:4)

PCR扩增(50μL反应体系)：以含有抽提的基因组基因为模板，吸至0.5mL PCR反应管中，以引物gB-F和gB-R扩增gB启动子基因，具体操作方法如下：

10×Reaction Buffer 5μL

gB-F(50pmol/μL) 1μL

gB-R(50pmol/μL) 1μL

dNTPs(10mmol/L) 1μL

Expand High Fidelity Polymerase(3.5U/μL) 1μL

cDNA 4μL

SW 37μL

PCR反应循环参数：94℃预变性3min；94℃30s，56℃45s，72℃延伸2min，20个循环后72℃延伸10min，4℃保存。将PCR产物经电泳后切割含目的大小片段的凝胶，用Agrose Gel DNA Extraction Kit回收纯化后与pCR-2.1T载体相连，转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞，提取质粒，经EcoR I酶切鉴定正确后送南京金斯瑞生物科技有限公司测序，将序列测定正确的阳性质粒命名HgB(图1)。

步骤3.构建中间转移质粒

将UC57-OHA使用Nhe I和Kpn II双酶切，电泳后胶回收备用。将pCMGFP使用EcoRv和NheI双酶切后，电泳胶回收备用。在专利CN105002146A中所构建带有同源臂的中间质粒pCMGFP基础上，将OHA和HgB分别替换到pCMGFP质粒上，并将测序鉴定好的阳性质粒重新命名为pHOH(图2)，并双酶切鉴定(图3)。中间质粒的构建示意图如图6所示。

步骤4.重组火鸡疱疹病毒的构建和纯化

(1)rHVT-GFP感染细胞DNA的制备

原代和次代CEF细胞按常规方法制备，在每瓶T75细胞培养瓶的次代CEF中接种105空斑形成单位(PFU)的重组rHVT-GFP病毒株、培养3-5天、等80％细胞产生典型的细胞病变后收获细胞、按照传统的酚氯仿方法提取HVT基因组。

(2)转移载体pCMHA和rHVT-GFP基因组DNA共转染CEF细胞

用QIAprep Spin MiniPrep Kit(QIAGEN)抽提转移载体pHOH质粒DNA。CEF按常规方法制备，在开始转染试验1h前制备次代CEF，每个60mm培养皿铺3x10⁶细胞，于37℃、5％CO2条件下培养。

在无菌的指形管中依次加入以下试剂：

无菌超纯水 194μL

rHVT-GFP DNA 5μg

转移载体pHOH质粒 1μg

TE 补足至25μL

同时需设不加转移载体pCMGFP质粒的HVT对照组，体系如下：

无菌超纯水 194μL

rHVT-GFP DNA 5μg

TE 补足至25μL

混匀上述体系后，从管底缓慢加入31μL 2mol/L CaCl2溶液和250μL 2xHBSP溶液(42mmol/L HEPES、1.4mmol/L Na2HP04、274mmol/L NaCl、5mmol/L KCI、pH7.05的6mmol/L葡萄糖)，用吸管轻轻从管底吹出数个气泡，室温静置30min，形成CaP04-DNA混合物。向每个铺有次代CEF细胞的60mm培养皿中加入500μL CaP04-DNA复合物，轻轻摇匀，继续培养4h。弃掉培养基，每个细胞培养皿中加入2mL的甘油休克。

2.5ml甘油休克液的体系按如下：

无菌超纯水 0.9mL

甘油 0.35mL

2xHBSP 1.25mL

混匀上述体系后作用1min后弃掉休克液，用维持液(V)培养基洗涤细胞，弃掉洗涤液，加入含4％胎牛血清的生长液(G)培养基，继续培养5-7d后用倒置荧光显微镜观察。

(3)重组病毒rHOH的筛选和纯化

将转染后的CEF用倒置荧光显微镜观察，标记出不带有绿色荧光的病毒空斑。弃掉培养基，用带有少许胰酶的吸管刮取病毒空斑，转移至10mL生长液(G)培养基中进行稀释，每一个病毒空斑接种一块已铺次代CEF细胞的96孔板，每孔接种l00μL稀释的病毒空斑，置于37℃、5％CO2条件下培养。重复上述步骤，直到96孔细胞培养板上所有的病毒空斑都不带有绿色荧光，并且组成每个病毒空斑的细胞都不带有荧光，说明重组病毒纯化完全，将该重组病毒命名为rHOH。同源重组的方法示意见图4。

步骤5.重组火鸡疱疹病毒的鉴定

间接免疫荧光试验(IFA)检测rHOH对外源抗原的表达：以rHOH感染次代CEF细胞，3-5天形成病毒空斑；用冷甲醇固定细胞30分钟，PBS洗涤3次；加工作浓度的抗AIV HA多克隆抗体(H7血清)，37℃作用1小时，PBS洗涤2-3次；加工作浓度的抗鸡IgG/lgM荧光单抗，37℃作用1小时，用PBS洗涤2-3次；置荧光镜下观察，结果表明组成病毒空斑的所有细胞均带荧光(图5)。转染、同源重组以及筛选和鉴定的示意图如图7所示。

SEQUENCE LISTING

<110> 扬州大学

<120> 表达H7N9亚型禽流感病毒血凝素蛋白的重组火鸡疱疹病毒株rHOH及构建方法

<130>

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1683

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

atgaacacac agatcctggt gttcgccctg attgctatca ttcccactaa tgctgacaag 60

atctgcctgg ggcaccacgc agtgagcaac ggcaccaaag tgaataccct gacagagaga 120

ggagtggaag tggtgaacgc aactgagacc gtggaaagga ctaatatccc tcgcatttgc 180

agcaagggga agaaaaccgt ggatctgggc cagtgcggac tgctggggac aatcactggc 240

ccccctcagt gcgaccagtt cctggagttt agcgctgatc tgatcattga gagaagggaa 300

ggatccgacg tgtgctaccc tgggaagttc gtgaacgagg aagcactgcg gcagatcctg 360

agagagagcg gcggaattga taaagaagcc atggggttta cttactccgg catcagaacc 420

aatggagcaa ccagcgcatg caggaggtcc gggagctcct tctacgccga gatgaagtgg 480

ctgctgagca acaccgacaa tgccgctttt ccccagatga ctaagagcta caaaaacacc 540

agaaaatccc ctgccctgat cgtgtggggc attcaccaca gcgtgtccac agctgaacag 600

actaagctgt acggaagcgg gaacaaactg gtgacagtgg gaagctccaa ttaccagcag 660

agcttcgtgc catccccagg agcaaggcca caggtgaacg gactgagcgg ccgcatcgac 720

tttcactggc tgatgctgaa ccctaatgat accgtgacat tcagctttaa tggcgctttc 780

atcgcaccag accgggcttc ctttctgaga ggcaagagca tgggaattca gtccggggtg 840

caggtggacg caaactgcga gggagattgc taccacagcg ggggcacaat catttccaac 900

ctgccattcc agaatatcga tagcagggca gtgggaaagt gcccaagata cgtgaaacag 960

cgctccctgc tgctggctac tggaatgaag aacgtgcctg agatcccaaa aggccgggga 1020

ctgttcggcg ctatcgcagg atttattgag aacgggtggg aaggcctgat tgacggatgg 1080

tacgggttta gacaccagaa tgctcagggg gagggcacag cagccgacta caagagcact 1140

cagtccgcaa tcgatcagat taccggaaag ctgaacaggc tgatcgaaaa aacaaatcag 1200

cagttcgagc tgattgacaa cgaatttaat gaggtggaaa aacagatcgg gaacgtgatt 1260

aattggaccc gcgatagcat cacagaagtg tggtcctaca acgccgagct gctggtggct 1320

atggaaaatc agcacaccat tgacctggcc gatagcgaga tggacaagct gtacgaaaga 1380

gtgaaaaggc agctgcgcga gaacgctgag gaagatggaa ccgggtgctt cgaaatcttt 1440

cacaagtgcg atgacgattg catggcaagc attaggaaca atacatacga tcactccaaa 1500

taccgggagg aagccatgca gaacagaatc cagattgacc ctgtgaagct gagctccggg 1560

tacaaagatg tgatcctgtg gttcagcttt ggcgcatcct gcttcatcct gctggccatt 1620

gtgatgggcc tggtgtttat ttgcgtgaag aacggaaata tgcgctgcac aatctgcatt 1680

taa 1683

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ggataataag taaatttagg gggttttacg attttggtgg agtggataat ataaccaccg 180

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ccgtgttcaa atgtggcgat ttgcaggtgt gtcgtgccga tggcttacag ctaacattgg 300

ggggggagta catttgggag gatggagtat atctgacata cgagaccgat tgtcctctcg 360

tagcacttat cgggtgtagg gcttatctaa cccacaatca atccccgacc gttctcgttg 420

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atcagttacg atcggatcgg tttagtaata gccacaccca caattgacct aggtcaatat 540

cgttaggact ttagtatttt gattcatacg gtcggtggaa ctcatgctta tgactcctac 600

aatgaagtac tttaatcggt ctttatttat ttttctcacc ccaatcttat ccatcgcgac 660

ctcagaaatt aaattaccaa atgtgacagc gcgagaaatt gtttcgggca tacagctatc 720

cgaagacgag acgacatttt ac 742

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<212> DNA

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<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

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