禽流感病毒NA亚型多重探针组合荧光定量RT‑PCR分型方法与流程

本发明属于生物检测领域，具体涉及一种禽流感病毒NA亚型多重探针组合荧光定量RT-PCR分型方法。

背景技术：

禽流感病毒分为16个HA亚型和9个NA亚型，可组合成不同的HA和NA亚型，如H5N1,H5N2,H5N5,H5N5,H5N8等。NA亚型需要通过神经氨酸酶抑制试验来确定，也可以通过RT-PCR扩增后测序分型。前者需要特异性的NA抗血清，后者耗时较长，而且RT-PCR扩增后通常需要利用琼脂糖凝胶电泳显示出目的条带的大小，与预期产物大小相比较，得出结果，耗时较长；或者采用普通SYBR Green法，即通过每个组合中溶解曲线的TM值来判断阴阳性，再通过多个组合的结果间接判断出样品的NA亚型。这种SYBR Green方法相比与探针法，灵敏性和特异性要低的多。而且需多次不同组合的实验，才能最终判断出NA亚型，不能通过一次实验，迅速、直观的得出结果。因此需要建立一种快速的NA分型方法。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明的第一目的在于提供一种禽流感病毒NA亚型RT-PCR单重检测引物组，所述禽流感病毒NA亚型RT-PCR单重检测引物组包括一对特异性引物对和一个荧光基团标记的探针。

优选地，本发明所述的禽流感病毒NA亚型RT-PCR单重检测引物组包括针对9种NA亚型N1～N9的9对特异性引物与带有荧光探针基团标记的探针，其中，所述特异性引物对与探针分别具有SEQ ID NO 1～27所示的序列。

即本发明的针对9种NA亚型N1～N9的9对特异性引物与带有荧光探针基团标记的探针分别为下表N1～N9所示(分别对应序列表SEQ ID NO 1～27)：

兼并碱基：R＝A/G,Y＝C/T,S＝G/C,H＝A/C/T,V＝A/G/C

本发明的另一目的在于提供禽流感病毒NA亚型RT-PCR多重检测引物组，所述禽流感病毒NA亚型RT-PCR多重检测引物组包括3组禽流感病毒NA亚型RT-PCR检测引物组，每组禽流感病毒NA亚型RT-PCR检测引物组包括一对特异性引物对和一个荧光基团标记的探针。

优选地，本发明所述的禽流感病毒NA亚型RT-PCR多重检测引物组，包括针对9种NA亚型N1～N9的9对特异性引物与带有荧光探针基团标记的探针，其中，所述特异性引物对与探针分别具有SEQ ID NO 1～27所示的序列。

优选地，本发明所述的禽流感病毒NA亚型RT-PCR多重检测引物组，包括三组所述禽流感病毒NA亚型RT-PCR单重检测引物组。

优选地，本发明所述的禽流感病毒NA亚型RT-PCR多重检测引物组中，第一组禽流感病毒NA亚型RT-PCR单重检测引物组包括基因型N1、N4与N5禽流感病毒NA亚型RT-PCR单重检测引物组；第二组禽流感病毒NA亚型RT-PCR单重检测引物组包括基因型N3、N2与N6禽流感病毒NA亚型RT-PCR单重检测引物组；第三组禽流感病毒NA亚型RT-PCR单重检测引物组包括基因型N7、N9与N8禽流感病毒NA亚型RT-PCR单重检测引物组，分别为下表2所示：

兼并碱基：R＝A/G,Y＝C/T,S＝G/C,H＝A/C/T,V＝A/G/C

本发明还提供了一种禽流感病毒NA亚型RT-PCR多重检测试剂盒，包括反转录试剂、PCR试剂、超纯水，其中，所述PCR试剂中包括如上所述的禽流感病毒NA亚型RT-PCR多重检测引物组；

优选地，本发明所述的禽流感病毒NA亚型RT-PCR多重检测试剂盒中，所述PCR试剂中的禽流感病毒NA亚型RT-PCR多重检测引物组配制为：

优选地，本发明所述的禽流感病毒NA亚型RT-PCR多重检测试剂盒中，所述PCR试剂为25μl，分别为Taqprobe 2×qPCR MasterMix 12.5μl，上下游引物(0.4μmol/L)各1μl，探针(0.4μmol/L)1μl，模板cDNA 2μl，加水至25μl。

优选地，本发明所述的禽流感病毒NA亚型RT-PCR多重检测试剂盒中，所述PCR反应条件为95℃10min，95℃15s，60℃20s，扩增40个循环，在60℃结束开始收集荧光信号。

本发明还提供了上述禽流感病毒NA亚型RT-PCR单重检测引物组、禽流感病毒NA亚型RT-PCR多重检测引物组、禽流感病毒NA亚型RT-PCR多重检测试剂盒在鉴别禽流感病毒中的应用。

由上可见，本发明至少有以下优点：

1、本发明针对9个NA亚型设计了Taqman探针，显著提高了检测的特异性；

2、本发明建立了3个多重探针荧光定量组合RT-PCR体系，每个体系中的各个成分互不干扰，且都能特异地检测出3个不同NA亚型。

3、本发明只需要同时进行3个体系的荧光定量PCR，根据CT值就能直接判断出NA亚型，实验流程更加省时、方便，实验结果更加直观、可信。

附图说明

图1为本发明实验设计流程图；

图2为普通RT-PCR特异性试验；

图3为9个单重探针法荧光定量PCR体系扩增曲线；

图4为多重探针荧光定量PCR灵敏度检验结果。

具体实施方式

如图1所示，在本发明的一个实施例中给出了本发明实验设计流程图。

以下通过具体实施例进一步对本发明的技术方案进行说明，应理解以下仅为本发明的示例性说明，并不用于限制本发明权利要求的保护范围。

实施例1禽流感病毒NA亚型RT-PCR多重检测

(1)引物的设计

根据实验目的，选择了流行的禽流感病毒9种不同NA的基因序列，包括不同动物源性和不同年代的毒株序列。再通过每个NA亚型序列同源性的比较，选取其保守序列，设计型特异性引物和不同荧光基团标记的探针。引物、探针序列及产物大小如表1：

表1 9种AIV NA亚型分型引物和探针

兼并碱基：R＝A/G,Y＝C/T,S＝G/C.,H＝A/C/T,V＝A/G/C

(2)病毒核酸的提取

1、加入20μl Proteinase K于一个无菌的1.5ml离心管中。

2、样品为鸡胚尿囊液，来自于临床分离得到的阳性禽流感病毒，经过鸡胚传代后由实验室冻存的禽流感病毒尿囊液。

在离心管中加入200μl样品。(注意：如果样品量不足200μl，用PBS或0.9％NaCl补充)

3、加入200μl Binding Buffer 5(包含5.6μg Carrier RNA(购自北京全式金公司，EasyPure Viral DNA/RNA Kit,货号为ER201)，漩涡混合15min，室温放置5min。

4、56℃孵育15min。

5、加入250μl无水乙醇(此时可能会出现絮状沉淀)，涡旋混合15s，室温放置5min。

6、将溶液和沉淀一起加入离心柱中，12000×g离心1min，弃掉流出液。

7、加入500μl Wash Buffer 5 12000×g离心1min，弃掉流出液。

8、重复步骤7一次。

9、室温12000×g离心1min，彻底去除残留的乙醇，在室温静置数分钟彻底晾干离心柱。

10、将离心柱转入一个新1.5ml RNase-free的离心管中，并向离心柱中央加20～50μl RNase-free Water,室温静置1min。

11、室温12000×g离心1min，洗脱RNA。

12、将RNA置于-80℃保存。

13、RNA反转录

RNA反转录使用诺唯赞生物公司的HiScript Reverse Transcriptase试剂盒。

反应体系如下：2μl 5×qRT SuperMix(包括Buffer、dNTP、HiScipt、Reverse Trancriptase、RNase inhibitor、Random primers/Oligo dT Primer mix)，模板RNA(Total RNA)1pg～500ng,加入RNase free ddH₂O至10μl。反应程序：25℃10min，50℃30min，85℃5min。得到的cDNA可立即用于PCR反应，或在-20℃保存。

(3)普通RT-PCR验证引物的特异性

取1μl上述获得的cDNA作为模板进行PCR扩增，体系如下：12.5μl 2×Taq Plus Master Mix，引物F、R各1μl(0.4μmol/L)，加入ddH₂O至25μl。反应程序：预变性温度为94℃5min，然后按94℃30s，55℃30s，72℃30s，进行35个循环，最后72℃延伸10min。

取PCR扩增产物10μl，点样于1.5％琼脂糖凝胶(含0.5μg/mL溴化乙锭)，以100bp Ladder marker作为标准参照，电泳后可见普通RT-PCR检测N1～N9流感毒株均出现100bp-200bp左右的型特异条带，目的条带大小正确。结果表明设计的针对各个NA亚型的引物具有良好的特异性，结果见图2，其中M：100bp Marker；1：N1 AIV；2：N2 AIV；3：N3 AIV；4：N4 AIV；5：N5 AIV；6：N6 AIV；7：N7 AIV；8：N8 AIV；9：N9 AIV.。

(4)单重探针荧光定量PCR体系的建立

本实验所采用的荧光定量PCR反应体系为25μl，分别为Taq probe 2×qPCR MasterMix 12.5μl(镇江爱必梦生物技术有限公司，货号：MasterMix-ps)，按照表1中的探针和引物进行反应，上下游引物(0.4μmol/L)各1μl，探针(0.4μmol/L)1μl，模板cDNA 2μl，加水至25μl。LightCycler Nano(Roche)实时荧光定量PCR仪反应参数：95℃10min，95℃15s，60℃20s，扩增40个循环，在60℃结束开始收集荧光信号。单重探针荧光定量PCR体系扩增曲线见图3(a～i)，其中图3a～图3i分别为引物组N1～N9PCR体系扩增曲线。

结果表明，9个单重探针法荧光定量PCR体系具有良好的特异性、灵敏性和重复性。

(5)3个多重探针荧光定量体系的建立及优化

根据已经建立好的单重探针法荧光定量PCR体系和3种不同荧光基团，将9个体系分成3组，每个组中包含3种不同荧光基团标记的探针。经过反复摸索，最终确定3个组合，见表3：

表3 3个多重探针荧光定量体系

(6)多重探针荧光定量PCR特异性检验结果

尿囊液样本来自于临床分离得到的阳性禽流感病毒，经过鸡胚传代后由实验室冻存的禽流感病毒尿囊液，其他几种禽类病原体如禽传染性支气管炎病毒(IBV)，传染性法氏囊病病毒(IBDV)，新城疫病毒(NDV，Lasota毒株)和细菌菌株(沙门氏菌和大肠杆菌)作为对照。其中禽流感病毒的NA 基因已经经过基因测序确定其NA亚型。使用全式金公司的EasyPure Viral DNA/RNA Kit提取尿囊液样本中的病毒核酸，提取20个N1 AIV阳性样本，30个N2 AIV阳性样本，5个N3 AIV阳性样本，2个N4 AIV阳性样本，2个N5 AIV阳性样本,20个N6 AIV阳性样本,2个N7 AIV阳性样本,30个N8 AIV阳性样本,20个N9 AIV阳性样本和其他禽类病原体核酸。使用特异性引物与Taq Man探针，完成多重荧光定量RT-PCR实验。结果表明，本方法具有良好的特异性，各个NA亚型均鉴定正确，且无交叉反应，其他禽类病原体均未被检测出，结果见表4。

表4 多重荧光定量PCR特异性试验结果

(7)多重探针荧光定量PCR灵敏度检验结果

本方法是用不同EID₅₀的尿囊液提取核酸，进行多重荧光定量PT-PCR灵敏度试验，从而得到用该方法能检测出的最低EID₅₀。灵敏度检验结果见表5,灵敏度检验扩增图见图4，表明该方法对不同亚型禽流感病毒具有较高的灵敏度。

表5多重荧光定量PCR灵敏度试验结果

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 扬州大学

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<170> PatentIn version 3.5

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