一种同时检测五种禽垂直传播疾病抗体的液相芯片及方法与流程

本发明属于免疫化学领域，具体涉及一种同时检测五种禽垂直传播疾病抗体的液相芯片及方法。

背景技术：

畜禽重要动物疫病的监控和净化是保障动物源性食品安全和公共卫生安全的重要基础。《SPF鸡微生物学监测》国家标准中规定：SPF鸡及SPF鸡胚需要监测的病原微生物种类为19种(其中病毒病有14种)；国家中长期动物疫病防治规划(2012-2020年)也明确提出实施种畜禽场疫病监测和净化计划，优先防治和重点监测高致病性禽流感、禽新城疫、禽白血病等垂直传播疫病。但是，目前动物疫病监测工作仍旧依靠病原分离培养、血清平板凝集试验、血清中和试验、间接免疫荧光试验、酶联免疫吸附实验等。不仅成本高，而且检测时间长，批量检测能力弱，给种禽场疫病监测和净化带来严重挑战。

液相芯片检测，也称为微球体悬浮芯片检测(Suspension Array)、多重荧光免疫检测(Multiplexed Flourometric Immunoassay，MFIA)，是基于xMAP(Multiplex Analyte Profiling)技术的新型生物芯片技术平台。它在不同荧光编码的微球上进行抗原-抗体、酶-底物、配体-受体的结合反应，通过红、绿两束激光分别检测微球编码和报告荧光来达到定性和定量的目的，一个反应孔内可以完成多达500种不同的生物学反应，是继基因芯片、蛋白芯片之后的新一代高通量分子检测技术平台，也是最早通过美国食品与药物管理局(FDA)认证的可用于临床诊断的生物芯片技术。

技术实现要素：

针对现有的动物疫病检测手段一次只能检测一种病原，未能满足高通量临床诊断需求，本发明的首要目的在于建立一种同时检测种禽场重点监测的五种禽垂直传播疾病抗体的液相芯片的高通量检测方法，满足快速、准确、高通量的动物疫病监测的技术要求，为畜禽临床其他病原微生物的多重检测方法的建立提供示范作用。

本发明的目的在于提供一种同时检测五种禽垂直传播疾病抗体的液相芯片。

本发明的另一目的在于提供一种同时检测五种禽垂直传播疾病抗体的方法。

本发明所采取的技术方案是：

一种同时检测五种禽垂直传播疾病抗体的液相芯片，该液相芯片中含有偶联磁珠、检测 抗体和报告分子；

所述偶联磁珠为5种分别偶联有禽流感病毒NP蛋白、禽新城疫病毒NP蛋白、禽呼肠孤病毒δC蛋白、禽白血病病毒P27蛋白、禽网状内皮组织增生病毒env蛋白的偶联磁珠。

进一步的，所述检测抗体为生物素标记的抗鸡IgG抗体。

进一步的，所述报告分子为荧光蛋白或荧光素标记的链霉亲和素。

进一步的，所述偶联磁珠的制备方法为：

将5种不同编码的空白磁珠活化后，用偶联缓冲液重悬磁珠；漩涡震荡，超声波分散处理后，分别加入禽流感病毒NP蛋白溶液、禽新城疫病毒NP蛋白溶液、禽呼肠孤病毒δC蛋白溶液、禽白血病病毒P27蛋白溶液、禽网状内皮组织增生病毒env蛋白溶液中，混匀后35～39℃避光下进行偶联反应2～4h，离心去上清；得5种包被有不同抗原的磁珠，即得偶联磁珠。

进一步的，所述偶联缓冲液为0.05～0.2M的乙磺酸缓冲液，其pH为5.5～6.5。

进一步的，所述蛋白溶液的浓度为1～10μg/mL。

进一步的，所述空白磁珠活化包括以下步骤：

1)磁珠的预处理：取5种不同编码的空白磁珠，离心弃上清，用活化缓冲液重悬空白磁珠，漩涡震荡30～60s，超声波分散处理30～60s后，离心弃上清，重复2-3次；

2)磁珠的活化：将上步5种预处理后的磁珠分别用PBS重悬，漩涡震荡10～60s，超声波分散处理10～60s后，再依次加入氮羟基琥珀酰亚胺磺酸盐溶液和碳二亚胺溶液，混匀后35～39℃下避光作用15～30min，得到活化磁珠。

进一步的，所述活化缓冲液为0.08～0.12M的磷酸盐缓冲液，其pH为5.5～6.2；

一种同时检测五种禽垂直传播疾病抗体的方法，采用上述任一所述的液相芯片进行检测，包括如下步骤：

1)偶联磁珠与样品中抗体的结合：将偶联磁珠和预处理后的待测样品36～38℃避光震荡孵育30～90min；用洗涤缓冲液洗涤2～4次；

2)检测抗体的加入及反应：将生物素标记的抗鸡IgG抗体加入到上步反应体系中，36～38℃避光震荡孵育30～90min；用洗涤缓冲液洗板2～4次；

3)报告分子的加入及反应：将报告分子加入到上步反应体系中，36～38℃避光震荡孵育45～70min；用洗涤缓冲液洗板2～4次；

4)结果检测：将反应体系中加入洗涤缓冲液，避光条件下振荡40～70s，置于Luminx液相芯片系统读取荧光强度；

5)结果分析：先计算阴性对照血清的平均荧光强度和标准差，以阴性对照血清的平均荧光强度值与3倍标准差的和作为临界值，高于临界值视为阳性。

进一步的，步骤1)所述偶联磁珠与预处理后的待测样品的体积比为1：(0.8～1.2)。

本发明的有益效果是：

1)本发明提供了一种用于五种禽垂直传播疾病抗体检测的液相芯片及检测方法。该方法的突出优点是仅需少量样本即可同时定性、定量检测同一样本中的多种不同目的分子，即多重检测。可以满足种畜禽场疫病监测的要求(一份样品需做多种检测)，符合国家中长期动物疫病防治规划中明确提出实施种畜禽场疫病监测和净化计划。该项技术的研发与应用可极大提高种禽场疫病检测的效率，缩短检测周期，减少成本，在种禽场具有巨大市场应用前景。

2)本发明建立的五种免疫磁珠(偶联磁珠)，既可多种选择性地组合使用又可单独使用，充分满足了市场监测的不同需求。

3)本发明建立的液相芯片，特异性强，重复性好，灵敏度高，是传统ELISA方法的8-100倍。

4)本发明通过大量实验的研究和筛选，发现应用禽流感病毒NP蛋白、禽新城疫病毒NP蛋白、禽呼肠孤病毒δC蛋白、禽白血病病毒P27蛋白、禽网状内皮组织增生病毒env蛋白这5种抗原蛋白制备的液相芯片，可实现同时对五种禽垂直传播疾病抗体进行检测，在检测过程中，即使这5种抗原同时存在于同一反应体系和反应条件中，但并不影响和干扰彼此间的免疫反应，同时带了来很好的特异性和灵敏性。其中对禽网状内皮组织增生病阳性血清抗体效价最低检测限达1:12800。

5)本发明检测方法可操作性强，检测体系可以根据操作者需要进行调整；具有多重性，可以一次同时分析多种不同的因子，而ELISA每次只能对1种因子进行单一分析；反应环境更佳，整个微球是悬浮于液体中的，比ELISA固定于底板中更加接近分子反应的自然状态；节约时间，所有因子分析可在一次反应中完成，且一次分析不到4h；节约样品，敏感性强，每次检测所需血清量少；节约人力资源。

附图说明

图1为禽流感阳性血清、禽呼肠孤阳性血清、禽新城疫阳性血清、禽白血病J亚型阳性血清、禽网状内皮组织增生病阳性血清和五种病毒抗体阳性血清液相芯片方法检测实验结果图；其中，18号磁珠表示偶联禽流感抗原，35号磁珠表示偶联禽新城疫抗原，45号磁珠表示偶联禽呼肠孤抗原，74号磁珠表示偶联禽白血病J亚型抗原，27号磁珠表示偶联禽网状内皮组织增生症抗原，PS表示五种病原抗体阳性血清，NS表示阴性血清；

图2为本发明液相芯片及检测方法的特异性实验结果图；18号磁珠表示偶联禽流感抗原，35号磁珠表示偶联禽新城疫抗原，45号磁珠表示偶联禽呼肠孤抗原，74号磁珠表示偶联禽白血病J亚型抗原，27号磁珠表示偶联禽网状内皮组织增生症抗原。

具体实施方式

一种同时检测五种禽垂直传播疾病抗体的液相芯片，该液相芯片中含有偶联磁珠、检测抗体和报告分子；

所述偶联磁珠为5种分别偶联有禽流感病毒NP蛋白、禽新城疫病毒NP蛋白、禽呼肠孤病毒δC蛋白、禽白血病病毒P27蛋白、禽网状内皮组织增生病毒env蛋白的偶联磁珠。

优选的，所述检测抗体为生物素标记的抗鸡IgG抗体。

优选的，所述报告分子为荧光蛋白或荧光素标记的链霉亲和素。

优选的，所述荧光蛋白或荧光素选自藻红蛋白、Cy3、Cy5中的一种。

优选的，所述偶联磁珠的制备方法为：

将5种不同编码的空白磁珠活化后，用偶联缓冲液重悬磁珠；漩涡震荡，超声波分散处理后，分别加入禽流感病毒NP蛋白溶液、禽新城疫病毒NP蛋白溶液、禽呼肠孤病毒δC蛋白溶液、禽白血病病毒P27蛋白溶液、禽网状内皮组织增生病毒env蛋白溶液中，混匀后35～39℃避光下进行偶联反应2～4h，离心去上清；得5种包被有不同抗原的磁珠，即得偶联磁珠。

优选的，所述偶联缓冲液为0.05～0.2M的乙磺酸缓冲液，其pH为5.5～6.5。

优选的，所述蛋白溶液的浓度为1～10μg/mL。

优选的，所述空白磁珠活化包括以下步骤：

1)磁珠的预处理：取5种不同编码的空白磁珠，离心弃上清，用活化缓冲液重悬空白磁珠，漩涡震荡30～60s，超声波分散处理30～60s后，离心弃上清，重复2-3次；

2)磁珠的活化：将上步5种预处理后的磁珠分别用PBS重悬，漩涡震荡10～60s，超声波分散处理10～60s后，再依次加入氮羟基琥珀酰亚胺磺酸盐溶液和碳二亚胺溶液，混匀后35～39℃下避光作用15～30min，得到活化磁珠。

优选的，所述活化缓冲液为0.08～0.12M的磷酸盐缓冲液，其pH为5.5～6.2；

一种同时检测五种禽垂直传播疾病抗体的方法，采用上述任一所述的液相芯片进行检测，包括如下步骤：

1)偶联磁珠与样品中抗体的结合：将偶联磁珠和预处理后的待测样品36～38℃避光震荡孵育30～90min；用洗涤缓冲液洗涤2～4次；

2)检测抗体的加入及反应：将生物素标记的抗鸡IgG抗体加入到上步反应体系中，36～38℃避光震荡孵育30～90min；用洗涤缓冲液洗板2～4次；

3)报告分子的加入及反应：将报告分子加入到上步反应体系中，36～38℃避光震荡孵育45～70min；用洗涤缓冲液洗板2～4次；

4)结果检测：将反应体系中加入洗涤缓冲液，避光条件下振荡40～70s，置于Luminx液相芯片系统读取荧光强度；

5)结果分析：先计算阴性对照血清的平均荧光强度和标准差，以阴性对照血清的平均荧光强度值与3倍标准差的和作为临界值，高于临界值视为阳性。

优选的，步骤1)所述待测样品为血清样品或蛋清样品，待测样品预处理包括将待测样品进行1：10～50倍稀释、过滤。

优选的，步骤1)所述偶联磁珠与预处理后的待测样品的体积比为1：(0.8～1.2)。

优选的，所述洗涤缓冲液为PBS-BN溶液，即含有0.8％～1.2％w/w BSA和0.045％～0.055％w/v叠氮钠的磷酸缓冲液，其pH值为7.1～7.5。

下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。

实施例1：一种同时检测五种禽垂直传播疾病的液相芯片中的偶联磁珠的制备方法

在本发明前期的大量研究筛选过程中，发现只有将抗原蛋白禽流感病毒NP蛋白、禽新城疫病毒NP蛋白、禽呼肠孤病毒δC蛋白、禽白血病病毒P27蛋白、禽网状内皮组织增生病毒env蛋白同时用于液相芯片的制备，才能实现同时对禽流感病毒、禽新城疫病毒、禽呼肠孤病毒、禽白血病病毒、禽网状内皮组织增生症病毒这5种病毒的感染进行准确、高灵敏性、快速、高通量的检测。

所述液相芯片制备为将上述五种抗原蛋白(禽流感病毒NP蛋白、禽新城疫病毒NP蛋白、禽呼肠孤病毒δC蛋白、禽白血病病毒P27蛋白、禽网状内皮组织增生病毒env蛋白)分别与五种不同编码的磁珠(均购自luminex公司)进行偶联，得到五种不同编码且分别偶联不同抗原蛋白的免疫磁珠，其具体制备过程如下：

1)磁珠的预处理：将购买的5种不同编码的空白磁珠(购自luminex公司)，≥8000g离心2～3min并吸弃上清，分别用活化缓冲液重悬空白磁珠，漩涡震荡30～60s，超声波分散处理30～60s后，≥8000g离心2～3min并吸弃上清，重复2～3次；所述活化缓冲液为0.1M的磷酸盐缓冲液(PBS)，其pH为5.5～6.2；

2)磁珠的活化：将步骤1)预处理磁珠用PBS重悬，漩涡震荡10～60s，超声波分散处 10～60s理后，再依次加入10μl、50mg/mL的氮羟基琥珀酰亚胺磺酸盐(Sulfo-NHS)和10μl、50mg/ml的碳二亚胺(EDC)，混匀后37℃下避光作用15min～30min，得到5种不同的活化磁珠；

3)磁珠与抗原的偶联：将上述所得5种活化磁珠分别用PBS清洗两遍，再用偶联缓冲液重悬磁珠；漩涡震荡10～60s，超声波分散处理10～60s后，再分别加入5种抗原溶液(禽流感病毒NP蛋白、禽新城疫病毒NP蛋白、禽呼肠孤病毒δC蛋白、禽白血病病毒P27蛋白、禽网状内皮组织增生病毒env蛋白)，混匀后37℃避光下进行偶联反应2～4h，其后离心移去上清；得5种包被有不同抗原的磁珠，即得偶联磁珠。

所述偶联缓冲液为0.05M-0.2M的乙磺酸缓冲液(MES)，其pH为5.5-6.5；

所述抗原溶液中蛋白浓度为1～10μg/mL；

4)磁珠的储存：用偶联缓冲液清洗步骤3)中5种偶联有不同抗原的磁珠两遍，并用血球计数板计数，将该5种偶联磁珠重悬并保存于储存缓冲液中，使用时按检测需求进行相应比例的稀释。

所述储存缓冲液为PBS-TBN溶液或含牛血清白蛋白的磷酸缓冲液。

实施例2：一种同时检测五种禽垂直传播疾病的液相芯片中的偶联磁珠的制备方法

1)磁珠的预处理：取5种不同编码的空白磁珠，分别于10000g离心3min并吸弃上清，用活化缓冲液重悬空白磁珠，漩涡震荡30s，超声波分散处理60s后，12000g离心2min并吸弃上清，重复3次；所述活化缓冲液为0.1M的磷酸盐缓冲液(PBS)，其pH为6；

2)磁珠的活化：将上步5种预处理后的磁珠分别用PBS重悬，漩涡震荡60s，超声波分散处理60s后，再依次加入10μl、50mg/mL的氮羟基琥珀酰亚胺磺酸盐(Sulfo-NHS)和10μl、50mg/mL的碳二亚胺(EDC)，混匀后37℃下避光作用20min，得到活化磁珠；

3)磁珠与抗原的偶联：将上步所得5种活化磁珠分别用活化缓冲液清洗两遍，再用偶联缓冲液重悬磁珠；漩涡震荡10s，超声波分散处理后60s，分别加入禽流感病毒NP蛋白、禽新城疫病毒NP蛋白、禽呼肠孤病毒δC蛋白、禽白血病病毒P27蛋白、禽网状内皮组织增生病毒env蛋白这5种表面抗原溶液，混匀后37℃避光下进行偶联反应3h，其后≥8000g离心2min移去上清；得5种包被有不同抗原的磁珠，即得偶联磁珠。

所述偶联缓冲液为0.1M的乙磺酸缓冲液(MES)，其pH为6。

所述表面抗原溶液的蛋白浓度为8μg/mL。

4)偶联磁珠的储存：将上步所得5种包被有不同抗原的磁珠分别加入偶联缓冲液，8000g 离心3min清洗3遍，将5种包被好的磁珠分别重悬并保存于适量储存缓冲液中，使用时按检测需求按比例稀释；

所述储存缓冲液为PBS-TBN溶液(配方为含0.1％BSA，0.02％吐温20和0.05％叠氮钠的磷酸缓冲液，其pH值为7.4)或含牛血清白蛋白的磷酸缓冲液。

实施例3：一种同时检测五种禽垂直传播疾病的液相芯片

本实施例所述的液芯片中含有实施例1或2制备的偶联磁珠、检测抗体和报告分子。

所述检测抗体为生物素标记的抗鸡IgG抗体。

所述报告分子为荧光蛋白或荧光素标记的链霉亲和素。

所述荧光蛋白或荧光素选自藻红蛋白、Cy3、Cy5中的一种。

实施例4：一种同时检测五种禽垂直传播疾病抗体的方法

采用上述实施例3所述的液相芯片同时对五种禽垂直传播疾病抗体进行检测，具体操作步骤如下：

(1)待测样品的预处理

先将待测血清样品做1:50倍稀释，往过滤板中每孔加200μl稀释好的血清样品(做好标记)，使用PALL微孔板过滤系统过滤血清，获得预处理的待测血清样品。

(2)偶联磁珠与待测样品中抗体的免疫结合

a.准备足量体积的工作浓度的偶联磁珠悬液：从4℃取出储存的偶联磁珠；漩涡振荡和超声波水浴振荡重悬磁珠；用储存缓冲液PBS-TBN对储存的偶联磁珠做1：20倍稀释(即每0.3ml偶联磁珠悬液加入5.7ml PBS-TBN溶液)，得工作浓度的偶联磁珠悬液。

b.预湿检测板：使用检测板时，每孔加入洗涤缓冲液100μl(即PBS-BN缓冲液，含1％w/wBSA，0.05％w/v叠氮钠的磷酸缓冲液)。用Biotek的微孔板仪器吸掉液体，并且在检测孔底部贴上醋酸板封闭贴。

c.加样：检测板的每孔加入稀释后血清50μl，和工作浓度的偶联磁珠悬液50μl(偶联磁珠含量约为50个/μl)，铝箔纸覆盖避光，将微孔板置于微孔板振荡器上，室温孵育90min。

d.洗板：将微孔板置于Biotek微孔板仪器洗板3次，贴上板封闭贴。

(3)检测抗体的加入及反应

a.将工作浓度的生物素标记的抗鸡IgG抗体加到微孔板，每孔100μl。铝箔纸覆盖避光，将微孔板置于微孔板振荡器上，室温孵育90min。

b.洗板：揭开顶部的铝箔纸和底部的板贴，将微孔板置于Biotek微孔板洗板机洗板3次，纸巾吸干底部洗涤缓冲液，贴上板贴。

(4)报告分子的加入及反应

a.将工作浓度的链霉亲和素藻红蛋白(SA-PE)加到检测板，每孔加入洗涤缓冲液和链霉亲和素藻红蛋白各50μl。铝箔纸覆盖避光，将微孔板置于微孔板振荡器上，室温孵育60min。

b.揭开顶部的铝箔纸和底部的板贴，将微孔板置于Biotek洗板机洗板3次，纸巾吸干底部洗涤缓冲液，贴上板贴。

(5)结果检测

每孔加入125μl洗涤缓冲液，铝箔纸覆盖避光，将微孔板置于微孔板振荡器上，振荡1分钟。将微孔板置于Luminx 200液相芯片系统中进行检测。

(6)结果分析

阴性对照血清，以液相芯片检测系统对阴性对照血清进行3次重复检测，计算每份血清的平均荧光强度(Median Fluorescent Intensity,MFI)，计算阴性血清的均数(平均荧光强度)和标准差，以均数与3倍标准差的和作为检测指标的临界值，高于临界值就视为该指标阳性。

按照上述实施例4所述的方法，对禽流感阳性血清样品、禽呼肠孤阳性血清样品、禽新城疫阳性血清样品、禽白血病J亚型阳性血清样品、禽网状内皮组织增生病阳性血清样品和五种病毒抗体阳性血清样品进行检测；检测结果如图1所示，18号磁珠表示偶联禽流感抗原，35号磁珠表示偶联禽新城疫抗原，45号磁珠表示偶联禽呼肠孤抗原，74号磁珠表示偶联禽白血病J亚型抗原，27号磁珠表示偶联禽网状内皮组织增生症抗原，PS表示五种病原抗体阳性血清，NS表示阴性血清；从中可以看出，本发明方法对五种单独的阳性血清及混合阳性血清均能很好的检测，且无交叉反应。

实施例5：特异性试验

利用实施例3所述的液相芯片及实施例4所述的方法，对禽网状内皮组织增生病阳性血清，禽白血病阳性血清，禽脑脊髓炎病毒阳性血清、禽流感阳性血清、禽呼肠孤阳性血清、禽传染性喉气管炎血清、禽传染性支气管炎血清、禽新城疫阳性血清进行检测。

检测结果如图2所示，禽网状内皮组织增生病阳性血清，禽白血病阳性血清，禽新城疫阳性血清，禽流感阳性血清，禽呼肠孤阳性血清的荧光值较高，呈阳性；而其它病毒感染的的阳性血清荧光值都很低，呈阴性，说明本发明液相芯片及检测体系特异性良好。

实施例6：灵敏性试验

用样品稀释液稀释阳性血清，稀释倍数为1:200、1:400、1:800、1:1600、1:3200、1:6400、 1:12800、1:25600。采用实施例3和4建立的液相芯片及检测方法和ELISA试剂盒对五种阳性血清稀释液检测，每个稀释度重复检测3次，记录MFI值和OD值，计算平均值。

检测结果显示，对于禽网状内皮组织增生病阳性血清，本发明液相芯片检测到的抗体效价最低为1:12800，而ELISA试剂盒检测到的抗体效价最低为1:800；对于禽白血病阳性血清，本发明液相芯片检测到的抗体效价最低为1:1600，而ELISA试剂盒检测到的抗体效价最低为1:200；对于禽新城疫阳性血清，本发明液相芯片检测到的抗体效价最低为1:51200，而ELISA试剂盒检测到的抗体效价最低为1:3200；对于禽流感阳性血清，本发明液相芯片检测到的抗体效价最低为1:51200，而ELISA试剂盒检测到的抗体效价最低为1:3200；对于禽呼肠孤阳性血清，本发明液相芯片检测到的抗体效价最低为1:1600，而ELISA试剂盒检测到的抗体效价最低为1:200。

上述结果表明，本发明研制备的特定液相芯片比现有商品ELISA试剂盒的敏感性显著增强。

实施例7：重复性试验

采用实施例3和4液相芯片及方法分别检测5管不同阳性血清，每管重复检测3次，记录MFI值，使用SPSS13.0计算组间变异系数(CV)和组内变异系数(CV)。根据《中国生物制品规程》要求，批内CV为不大于15％，批间CV不大于20％。

检测结果如表1和表2所示，结果显示，本发明方法平均批内变异系数(CV)为10.2％(表1)，平均批间变异系数为12.8％(表2)，说明本发明液相芯片及结果可信，重复性好。

表1批内重复性测试结果(n＝3)

表2批间重复性测试结果(n＝3)

实施例8：禽场样品的检测

待测样品前处理：取10μl待测血清样品加入490μl血清稀释液中，将血清做1:50倍稀释；使用PALL微孔板过滤系统过滤血清，放置好接收板和过滤板，往过滤板中每孔加500μl稀释好样品(做好标记)，打开真空泵将血清从过滤板抽滤至接收板内，标记为待检血清。

对28份SPF种禽场血清样品采用上实施例4所述方法进行5种病原抗体检测。

检测结果如表3，结果显示，28份SPF种禽场血清的结果均为阴性，均无禽流感病毒、禽新城疫病毒、禽呼肠孤病毒、禽白血病病毒、禽网状内皮组织增生病毒的感染。

表3液相芯片方法对禽场28份样品的检测结果

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。