甲型禽流感H7N2的纳米抗体及其应用的制作方法

本发明涉及生物制药技术领域，具体涉及针对甲型禽流感H7N2的纳米抗体、其编码序列及其应用。

背景技术：

甲型流感病毒（Avian Influenza Virus，AIV）基因组为八个分节段的负链RNA，属于正粘病毒科，共编码12-13种蛋白，根据两种表面蛋白HA（血凝素）和NA（神经氨酸酶）可分为不同的血清型，现已从禽类中分离到81种不同血清亚型的禽流感病毒，而且还有新的HA和NA不断被发现，禽流感病毒的多型性给防治禽流感带来极大难度。按照致病性大小，禽流感病毒可以分为高致病性（HPAIV）、低致病性(LPAIV)和非致病性三类，非致病性禽流感不会引起明显症状；低致病性禽流感可使禽类出现轻度呼吸道症状，导致食量减少，产蛋量下降，甚至零星死亡；高致病性禽流感危害最为严重，传播快，发病率和死亡率均高，被世界动物卫生组织列为A类动物疫病，我国亦将其列为一类动物疫病。与所有亚型的AIVs一样，H7亚型AIVs也可由禽类直接传给了人，但对人感染H7亚型的禽流感病毒关注度相对却很低。H7N2在美国东北部的活禽市场流行数十年，2002年在火鸡中大规模暴发80位职业人群均出现流感样症状，2003年禽流感病毒H7N2再次爆发。2013年3月31日中国的上海和安徽两地共发现3例人感染新型重配H7N9病毒的报道，其中2人死亡1人重症提醒我们H7亚型禽流感病毒对公众健康的威胁不容忽视。

有效的疫苗针对禽流感可提供最好的保护，但目前的疫苗技术限制了短期内满足大量有效疫苗需求的生产。对HPAIV H7N2病毒而言，由于欧亚地区流行不同支系的H7N2病毒，选择群特异性的疫苗株对于H7N2病毒疫苗的设计和选择来说是个很大的挑战。不同抗原性的H7谱系均能使人致病，近年来从人群中分离到的北美谱系H7N2、H7N3以及欧亚谱系H7N2 、H7N3的人分离株可供选择合适的疫苗株，但针对两个谱系的人用H7疫苗仍在研制中。

抗病毒药物是治疗流感病毒感染非常有效的方法之一，但H7有耐药株出现，体外实验表明2003年荷兰暴发的H7对M2离子通道抑制剂金刚烷胺类耐药，同样北美谱系的H7也有耐金刚烷胺的报道，因此对耐药株的监测与新型药物的研发同样重要。

纳米抗体在基础研究、新药开发以及疾病的诊断和治疗以及食品科学领域具有广阔的应用前景，已经成为一个重要研究热点。利用抗体技术获得针对甲型H7N2流感病毒表位的纳米抗体，从而应用于临床诊断和靶向治疗具有广阔前景。目前尚无针对甲型H7N2流感病毒表位的纳米抗体报导。

技术实现要素：

本发明的目的一方面是提供一种针对甲型流感病毒H7N2的纳米抗体。本发明提供的一种针对甲型流感病毒H7N2的纳米抗体（也称为重链抗体，VHH），包括框架区FR和互补决定区CDR，所述框架区FR选自下组的FR的氨基酸序列：SEQ ID NO：1所示的FR1，SEQ ID NO：2所示的FR2，SEQ ID NO：3所示的FR3，SEQ ID NO：4所示的FR4。

所述互补决定区CDR选自下组的CDR的氨基酸序列：SEQ ID NO：5所示的CDR1，SEQ ID NO：6所示的CDR2，SEQ ID NO：7所示的CDR3。

优选地，所述的H7N2纳米抗体的VHH链，它具有SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列。

纳米抗体(nanobody，Nb)是近年来发现的一种新型抗体，其抗原结合位点仅由重链的可变区( variable domain of the heavy chain of HCAbs，VHHs) 构成，也称为VHH抗体，是目前可以得到的具有完整功能的最小抗体分子片段，具有相对分子质量小、稳定性强、可溶性好、抗原结合性能好、表达量高及免疫原性低等特点，较常规抗体用途更广。

与具有重链和轻链4条多肽链组成的常规抗体分子不同，重链抗体由两条同源的重链肽段组成，重链分子只包含可变区、CH2区和CH3区，相对分子质量为90kDa，远小于常规的IgG抗体分子150KDa。

本发明第二方面，提供的一种针对甲型流感病毒H7N2表面抗原的重链抗体VHH，包括一条具有SEQ ID NO：8所示氨基酸序列的VHH链。

本发明第三方面，提供了一种DNA分子，它编码选自下组的蛋白质：本发明所述的甲型流感病毒H7N2的重链抗体VHH。

优选地，所述的DNA分子，其特征在于，它具有选自下组的DNA序列：SEQ ID NO：9。

本发明的第四方面，提供了一种表达载体，它含SEQ ID NO：9所示的核苷酸序列。作为优选，其为pMECS、 pET32a或pET28a。

本发明的第五方面，提供了一种宿主细胞，其含有所述的表达载体，所述甲型流感病毒H7N2的纳米抗体。作为优选，其为WK6、TG1或BL21。

本发明的第六方面，提供了一种检测甲型流感病毒H7N2的试剂盒，其包含修饰或未修饰的所述纳米抗体，优选的，所述修饰为偶联HRP、FITC或生物素。

本发明的第七方面，提供了本发明所述的甲型流感病毒H7N2的重链抗体VHH在用于制备诊断甲型H7N2流感制剂的用途。禽流感的早期诊断对于控制疫情有重大意义，甲型流感病毒H7N2的纳米抗体在禽流感的诊断中发挥作用，从而对疫情的控制产生积极影响。

与现有技术相比，本发明的优点如下：本发明使用灭活的甲型H7N2流感病毒免疫双峰驼，随后利用该骆驼外周血淋巴细胞建立了针对甲型流感病毒H7N2的重链抗体VHH噬菌体文库。随后试验中将灭活的甲型H7N2流感病毒偶联在酶标板上，利用噬菌体展示技术筛选免疫性的纳米抗体噬菌体文库，从而获得了针对甲型H7N2流感病毒的特异性纳米抗体基因，将此基因转至大肠杆菌中，从而建立了能在大肠杆菌中高效表达的纳米抗体株。获得纳米抗体后，对其进行生物素化，并将生物素化的纳米抗体与链霉亲和素化的微孔板偶联，同时捕获抗原，另外一株识别抗原另一表位且偶联HRP的纳米抗体进行显色，得到甲型流感H7N2的检测灵敏度为2.97 ng/ml，检测线性范围为0-100 ng/ml，线性方程为y= 0.0105x + 0.3229，相关系数为0.9952，用此方法对流感病毒H7N2进行检测表现出良好的线性关系，为禽流感H7N2的纳米抗体应用于临床诊断以及诊断试剂盒的开发奠定基础。

附图说明

图1是纳米抗体的基因电泳图，1、DNA分子标准（bp）；2、纳米抗体DNA片段，大小约为500bp；

图2是构建的单域抗体文库的插入率检测结果，从左到右凝胶孔的DNA条带分别是：第一道为DNA分子标准，其余孔道为从所建单域抗体文库中随机挑取单克隆检测插入片段的PCR产物，经检测，该文库的插入率为100％；

图3是经镍柱纯化后，得到的H7N2纳米抗体的SDS-PAGE的电泳图，其表达的蛋白对应SEQ ID NO：9所示的核苷酸序列。

图4是利用双抗夹心法检测甲型流感H7N2的原理图。

图5是利用双抗夹心法检测甲型流感H7N2的灵敏度和检测线性。

具体实施方式

本发明公开了一种甲型禽流感H7N2的纳米抗体及其应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的产品及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明首先将灭活的甲型H7N2流感病毒免疫一只双峰驼，经过7次免疫之后提取该双峰驼外周血淋巴细胞并构建了甲型H7N2流感病毒特异的单域重链抗体文库。将灭活的甲型H7N2流感病毒偶联在酶标板上，灭活的甲型H7N2流感病毒表面的抗原表位得以暴露出来，利用噬菌体展示技术从文库中筛选甲型H7N2流感病毒免疫性的纳米抗体基因，而获得了能在大肠杆菌中高效表达的纳米抗体株。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。

实施例1： 针对甲型流感病毒H7N2的重链抗体VHH文库的构建

（1）用灭活的甲型H7N2流感病毒免疫双峰驼，每次将灭活甲型H7N2流感病毒与弗氏佐剂按1：1体积混合，每周一次，共免疫7次，第一次使用完全的弗氏佐剂，剩余六次全部使用弗式不完全佐剂，在免疫过程中刺激B细胞表达特异针对甲型流感病毒H7N2的重链抗体VHH。（2）7次免疫结束后，提取骆驼外周血淋巴细胞100 ml并提取总RNA。（3）将提取的RNA反转录成cDNA并利用巢式PCR扩增VHH链，结果如图1显示，该片段的大小约为500 bp。（4）使用限制性的内切酶PstI及Not I（购自NEB）酶切20 μg pComb3噬菌体展示载体（购自Biovector）及10 μg VHH并连接两个片段。（5）将连接产物电转化至电转感受态细胞TG1（购自北京神州红叶科技有限公司）中，构建甲型流感病毒H7N2的重链抗体VHH噬菌体展示文库并测定库容，库容的大小为3×10⁸；与此同时，通过菌落PCR检测所建文库的插入率检测结果插入率约95%，图2显示菌落PCR结果。文库构建完成后，为检测文库的插入率，我们随机的选取24颗克隆做菌落PCR。结果显示：文库插入率已达到100％。

实施例2：针对甲型流感病毒H7N2的重链抗体VHH筛选过程

（1）将溶解在100 mM pH 8.2 NaHCO₃ 中的灭活甲型H7N2流感病毒200 μg偶联在NUNC酶标板上，4℃放置过夜，同时设立负对照包被NaHCO₃。（2）第二天两个孔中分别加入100 μg 1%脱脂牛奶，室温封闭2小时。（3）2小时后，加入100 μl噬菌体，在室温下作用1小时。(4）用 PBST（PBS中含有0.05% Tween 20）洗5遍，以洗掉不能抗原结合的噬菌体。(5）用100 mM三乙醇胺将与甲型流感病毒H1N1特异性结合的噬菌体洗脱下，并侵染处于对数期生长的大肠杆菌TG1，产生并纯化噬菌体用于下一轮的筛选，相同筛选过程重复3-4轮。在不断地筛选的过程中，阳性的克隆将不断的被富集，从而达到了利用噬菌体展示技术筛取抗体库中甲型流感病毒H7N2特异抗体的目的。

实施例3：用噬菌体的酶联免疫方法（ELISA）筛选特异性单个阳性克隆：

（1）从上述3-4轮筛选后含有噬菌体的细胞培养皿中，挑选96个单个菌落并接种于含有100 μg/ml的氨苄青霉素的TB培养基(1L TB培养基中含有2.3 g磷酸二氢钾，12.52 g磷酸氢二钾，12 g蛋白胨，24 g酵母提取物，4 mL甘油)中，生长至对数期后，加终浓度1 mM的IPTG，28℃培养过夜。（2）利用渗透压法获得粗提抗体，并将抗体转移到经抗原包被的ELISA板中，在室温下放置1小时。（3）用PBST洗去未结合的抗体，加入一抗mouse anti-HA tag antibody（抗鼠抗HA抗体，购自北京康为世纪生物科技有限公司），在室温下放置1小时。（4）用PBST洗去未结合的抗体，加入anti-mouse alkaline phosphatase conjugate（山羊抗小鼠碱性磷酸酶标记抗体，购自艾美捷科技有限公司），在室温下放置1小时。（5）用PBST洗去未结合的抗体，加入碱性磷酸酶显色液，使用酶标仪在405nm波长，读取吸收值。（6）当样品孔OD值大于对照孔OD值3倍以上时，判为阳性克隆孔。（7）将阳性克隆孔的菌转摇在含有100 μg/mL 氨苄青霉素的LB培养基中以便提取质粒并进行测序。

根据序列比对软件Vector NTI分析各个克隆株的基因序列，把CDR1，CDR2，CDR3序列相同的株视为同一克隆株，而其序列不同的株视为不同克隆株，最终得到氨基酸序列SEQ ID NO：8所示的纳米抗体，其骨架区和互补决定区氨基酸序列为：

FR1：QVQLQESGGGSVQAGGSLRLSCAES

FR2：WFRQAPGKEREGVA

FR3：RFTISRDNAKNTVYLQMSSLQPEDTAMYYCAA

FR4：WGQGTQVTVSS

CDR1：GYIGSNRPM

CDR2：GISTIGGYTYYADSVKG

CDR3：CYGLRADMAGDYSSLCTY。

实施例4：纳米抗体在宿主菌大肠杆菌中表达、纯化：

（1）将前面测序分析所获得不同克隆株的质粒电转化到大肠杆菌WK6中，并将其涂布在含有氨苄青霉素和葡萄糖的LB培养平板上，37 ℃培养过夜；（2）挑选单个菌落接种在5 mL含有氨苄青霉素的LB培养液中，37 ℃摇床培养过夜；（3）接种1 mL的过夜菌种至330 mL TB培养液中，37 ℃摇床培养，培养到OD值达到0.6~1.0时，加入终浓度为1 mmol IPTG，28 ℃摇床培养过夜；（4）离心，收菌；（5）利用渗透法，获得抗体粗提液；（6）经镍柱离子亲和层析可制备纯度达90%以上的蛋白，结果见图3。

实施例5：纳米抗体偶联HRP的方法：

（1）取200 μl 5 mg/ml HPR与新鲜配制的100 μl 0.1 mol/L NaIO4混合，4℃放置15-30 min，随后加入200 μl 2.5％ 乙二醇，室温放置30-60 min；（2）加入1 mL 1mg/mL 的待标记抗体，并用1 mol/L pH 9.5 CB溶液（Na₂CO₃、NaHCO₃溶液）调节pH至9.0，混匀，4℃过夜；（3）向过夜的抗体中加20 μl 5mg/mL NaHB，4℃放置3小时；（4）将偶联HRP的纳米抗体换液至PBS溶液中。

实施例6：纳米抗体进行生物素化的方法

（1）将纳米抗体VHH片段亚克隆至pBAD载体上，随后构建好的质粒pBAD与质粒BirA共转至大肠杆菌WK6中，并将其涂布在含有氨苄青霉素、氯霉素和葡萄糖的LB培养平板上，37 ℃培养过夜；（2）挑选单个菌落接种在5 mL含有氨苄青霉素和氯霉素的LB培养液中，37 ℃摇床培养过夜；（3）接种1 mL的过夜菌种至330 mL含氨苄青霉素和氯霉素的TB培养液中，37 ℃摇床培养，培养到OD值达到0.4-0.5时，加入330μl 50 mM 的D-biotion溶液，37 ℃慢摇30 min；（4）加入终浓度为1 mM IPTG，28 ℃摇床培养过夜；（4）离心，收菌；（5）利用渗透法，获得抗体粗提液；（6）使用链霉亲和素磁珠纯化偶联生物素的纳米抗体。

实施例7：利用双抗夹心法检测甲型流感H7N2（原理图见图4）

(1)将100 μl 1 μg/mL 的生物素化的H7N2纳米抗体包被在偶联有链霉亲和素的微孔板上，水平摇床室温震荡孵育1-2小时；（2）PBST洗涤5次，每孔加入100μl 5％ BSA进行封闭，室温震荡孵育1小时；（3）PBST洗涤5次，向每孔中加入100 μl梯度稀释的流感病毒H7N2（抗原浓度为0、1 ng/mL、5 ng/mL、10 ng/mL、50 ng/mL、100 ng/mL、200 ng/mL、500 ng/mL、1000 ng/mL、2000 ng/mL、5000 ng/mL），室温震荡孵育1-3小时（或4℃静置孵育过夜）；（4）PBST洗涤5次，每孔加入100μl能与流感病毒H7N2另一表位结合且偶联HRP的纳米抗体（1μg/mL），室温震荡孵育1小时；（5）PBST洗涤5次，TMD显色，结果见图5，显示出良好的线性关系。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 北京科卫临床诊断试剂有限公司；

<120> 甲型禽流感H7N2的纳米抗体及其应用

<160> 9

<170> PatentIn version 3.2

<210> 1

<211> 25

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Glu Ser

20 25

<210> 2

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val Ala

1 5 10

<210> 3

<211> 32

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 3

Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln

1 5 10 15

Met Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Ala

20 25 30

<210> 4

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 4

Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser

1 5 10

<210> 5

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 5

Gly Tyr Ile Gly Ser Asn Arg Pro Met

1 5

<210> 6

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 6

Gly Ile Ser Thr Ile Gly Gly Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 7

<211> 18

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 7

Cys Tyr Gly Leu Arg Ala Asp Met Ala Gly Asp Tyr Ser Ser Leu Cys

1 5 10 15

Thr Tyr

<210> 8

<211> 126

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 8

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Glu Ser Gly Tyr Ile Gly Ser Asn Arg

20 25 30

Pro Met Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val Ala

35 40 45

Gly Ile Ser Thr Ile Gly Gly Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys

50 55 60

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Ala Cys Tyr Gly Leu Arg Ala Asp Met Ala Gly Asp Tyr Ser Ser Leu

100 105 110

Cys Thr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser

115 120 125

<210> 9

<211> 378

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

caggtgcagc tgcaggagtc tggaggaggc tcggtgcagg ctggagggtc tctgagactc 60

tcctgtgcag agtctggata catcggcagt aacaggccaa tgtggttccg ccaggctcca120

gggaaggagc gcgaaggggt cgcaggtatt tctactattg gtggttacac atactatgcc 180

gactccgtga agggccgatt caccatctcc cgagacaacg ccaagaacac ggtgtatctg 240 caaatgagca gcctgcaacc cgaggacact gccatgtact actgtgcagc atgctacggg 300

ctccgcgccg acatggctgg tgattactct tccctttgta catactgggg ccaggggacc 360

caggtcaccg tctcctca 378