高穿透性纳米抗体融合蛋白制备及其在抗肿瘤中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物与新医药技术领域，特别涉及高穿透性纳米抗体融合蛋白制备及 其在抗肿瘤中的应用。
【背景技术】
[0002] 在本发明作出之前，肿瘤的靶向治疗研究是迄今提高肿瘤治疗效果、减少药物毒 副反应的最有效、最有实际应用潜力的措施之一。融合蛋白（重组蛋白）的构建和表达为 肿瘤靶向药物的研发提供了方法。然而这类药物只对一小部分（通常< 20% )肿瘤发挥作 用，通过个体化地检查药物疗效相关生物标志，才能确定少数适宜用药的患者，并且药物发 挥理想抗肿瘤效应的前提不仅仅是设法让药物积聚于肿瘤局部，更重要的是要使药物在肿 瘤局部获得良好的穿透性，使其更多地进入肿瘤细胞而发挥作用。
【发明内容】
[0003] 本发明的目的就在于克服上述缺陷，研究高穿透性纳米抗体融合蛋白制备及其在 抗肿瘤中的应用。
[0004] 本发明的技术方案如下：
[0005] 高穿透性纳米抗体融合蛋白，其主要技术特征在于：该蛋白由革巴向人EGFR纳米抗 体和肿瘤穿透肽iRGD经由连接肽linker，即GGGGSGGGGSGGGGS连接组成。
[0006] 本发明的另一技术方案是：
[0007] 高穿透性纳米抗体融合蛋白的制备方法，其主要技术特征在于它包括以下步骤： 通过设计三条引物在已保存有ant i-EGFR基因片段的载体PSJF2上进行聚合酶链式反应扩 增得到HIS-ant i-EGFR-linker-iRGD基因片段，并克隆到表达载体pET-28a上，构建表达载 体pET-28a-ant i-EGFR-iRGD，并经过测序验证，将其转化入大肠杆菌BL21DE3表达菌，经过 异丙基-β -D-硫代半乳糖苷诱导重组蛋白表达，通过镍离子亲和层析柱纯化重组蛋白，可 得到聚丙烯酰氨凝胶电泳纯95%，15mg/L细菌培养物的融合蛋白；
[0008] 上游引物Pl:
[0009] 5, -CATGCCATGGGCCATCACCATCACCATCACCAGGTAAAGCTGGAG-3'
[0010] 45bp
[0011] 下游引物P2:
[0012] 5 ' -CGATCCGCCACCGCCAGAGCCACCTCCGCCTGAACCGCCTCCACCGTTCAGATCTTCTTCGCTGAT
[0013] 67bp
[0014] 下游引物P3:
[0015] 5 ' -CCCAAGCTTCTAGCAGTCCGGACCTTTGTCACCACGGCACGATCCGCCACCGCCAGAGCCACCTCC GCCTGAACCGCCTCCACC-3 '
[0016] 84bp
[0017] (1)重组人ant i-EGFR-iRGD基因片段扩增：
[0018] 选用上游引物Pl和下游引物P2,以已保存有ant i-EGFR基因片段的pSJF2 载体重组质粒为模板，聚合酶链式反应（PCR)扩增出Nco I-HIS-ant i-EGFR-linker， 将此作为模板，再用上游引物Pl和下游引物P3进行PCR反应，得到Nco I-HIS-ant i-EGFR-linker-iRGD-Hind III ；
[0019] (? ant i-EGFR-iRGD 表达载体 pET28a-ant i-EGFR-iR⑶的构建：
[0020] 将步骤⑴中获得的ant i-EGFR-iR⑶目的基因 PCR产物纯化回收，并将其与载体 pET28a连接，构建ant i-EGFR-iRGD表达载体pET28a-ant i-EGFR-iRGD，通过转化入大肠杆 菌DH5 α，进行抗性筛选挑选连接成功的菌株，并用菌液PCR手段对表达载体进行鉴定，挑 选得到阳性克隆按照质粒小提试剂盒使用说明提取质粒并送测序验证；
[0021] (3)将表达载体 pET28a-ant i-EGFR-iRGD 转化至表达菌株 BL21DE3 :
[0022] 取已经确认的 100 μ g/ μ L表达载体pET28a-ant i-EGFR-iRGDO. 1 μ L-5 μ L 转化入 氯化钙制备的表达菌株BL21DE3感受态细胞中，涂布到特定抗性的LB平板上，挑选阳性克 隆低温冰箱内甘油保存该菌种；
[0023] (4)重组ant i-EGFR-iR⑶的诱导表达及纯化：
[0024] 3)重组ant i-EGFR-iRGD异丙基-β -D-硫代半乳糖苷诱导表达：
[0025] 对重组ant i-EGFR-iRGD用ImM异丙基-β -D-硫代半乳糖苷诱导表达，在诱导4 小时后，聚丙烯酰氨凝胶全蛋白电泳；
[0026] 4)重组ant i-EGFR-iR⑶经AKTA Purifier900FPLC系统，镍离子亲和层析柱纯化：
[0027] 收集1000 mL经过异丙基-β -D-硫代半乳糖苷诱导表达后的BL21DE3菌体，用 PBS、5mM咪唑重悬菌体，350W功率进行超声破碎，12000r ·π?η-1离心后收集上清液于AKTA PurifieWOOFPLC系统纯化，最后通过对纯化的蛋白进行聚丙烯酰氨凝胶电泳，检测蛋白，测 定纯度；
[0028] (5) AXIMA MALDI-LNR-T0F验证纯化蛋白的分子量为18KD。
[0029] 本发明又一技术方案是：
[0030] 高穿透性纳米抗体融合蛋白作为抗肿瘤药物的应用，其主要技术特征在于高穿透 性纳米抗体融合蛋白为活性成分用于治疗肿瘤。
[0031] 所述肿瘤特别是指胃癌和胃转移癌。
[0032] 所述适于经直肠、鼻内、肺部、阴道内、外部、口服或肠胃外，包括皮下、植入、静脉 内和肌内给药。
[0033] 本发明的有益效果是：融合蛋白的双特异性靶向（EGFR和整合素 α νβ 3/β 5)可以 提高该融合蛋白的适应范围，使药物积聚于肿瘤局部，同时融合蛋白通过NRP-I途径，使药 物在肿瘤局部获得良好的穿透性，使其更多地进入肿瘤细胞而发挥作用。
【附图说明】
[0034] 图1-Pl Ρ2 PCR得到的Nco I-HIS-ant i-EGFR-linker基因片段琼脂糖电泳图：
[0035] 泳道 I :DL2000marker ;泳道 2 :PCR 结果（489bp)。
[0036] 图 2-P1P3PCR 得到的 Nco I-HIS-ant i-EGFR-linker-iRGD-Hind III 基因片段 琼脂糖凝胶电泳图：
[0037] 泳道 I :DL2000marker ;泳道 2 :PCR 结果（528bp)。
[0038] 图3-目的基因表达载体pET28a_ant i-EGFR-iRGD DH5 α菌体PCR电泳图：
[0039] 泳道I :DL2000marker ;泳道2 :阳性对照（同图2泳道2);泳道3 :1号菌PCR结 果；泳道4 :2号菌PCR结果；泳道5 :3号菌PCR结果；泳道6 :4号菌PCR结果；泳道7 :5号 菌PCR结果；泳道8 :6号菌PCR结果。
[0040] 图4-表达载体pET28a-ant i-EGFR-iRGD中Nco I和Hind III之间的测序结果 示意图。
[0041] 图 5-BL21 DE3-pET28a-ant i-EGFR-iRGD 蛋白可溶性表达与纯化：
[0042] 泳道1 :未诱导；泳道2 :诱导；泳道3 :沉淀；泳道4 :上清；泳道5 :纯化蛋白（星 标出）；泳道6 :Marker。
[0043] 图6--镍柱亲和层析纯化目的蛋白图谱（流速：5MI/min ;A液：1*PBS PH7. 4 ;B 液：1*PBSPH7.4，1M咪唑，箭头指示目的蛋白）。
[0044] 图 7-AXIMA MALDI-LNR-T0F 检测结果示意图。
[0045] 图8--胃癌细胞株EGFR表达情况示意图。
[0046] 图9--免疫荧光分析示意图。
[0047] A ant i-EGFR 组 FITC 荧光；B ant i-EGFR-iRGD 组 FITC 荧光；C EGFR 单克隆抗体 组 FITC 荧光；D ant i-EGFR 组 Hochest 染色；E ant i-EGFR-iR⑶组 Hochest 染色；F EGFR 单克隆抗体组 Hochest 染色；G ant i-EGFR 组 FITC 与 Hochest 融合；H ant i-EGFR-iR⑶组 FITC与Hochest融合；I EGFR单克隆抗体组FITC与Hochest融合。
[0048] 图10--ant i-EGFR-iR⑶融合蛋白对BGC823胃癌细胞的体外抑制作用：
[0049] 对于西妥昔单抗横坐标0.5以]?、14]\1、2 4]\1、4 4]\1、8 4]\1、16 4]\1分别指7.5 4 8/1^、 15 μ g/mL、30 μ g/mL、60 μ g/mL、120 μ g/mL、240 μ g/mL。
[0050] 图11--ant i-EGFR-iRGD融合蛋白的小鼠体内抗肿瘤作用。
【具体实施方式】
[0051] 本发明技术思路是：将编码抗人EGFR抗原的单域抗体和肿瘤穿透肽iRGD的核苷 酸序列连接起来，得到编码ant i-EGFR-iRGD的融合基因片段，并将其插入原核表达质粒载 体。发明还涉及了能够表达融合蛋白的宿主细胞，该融合蛋白能在大肠杆菌中高效表达，及 在抗肿瘤中的应用。
[0052] 以下结合【具体实施方式】详细说明，但不限制本发明。
[0053] 具有抗肿瘤作用的融合蛋白的表达和纯化过程如下：
[0054] 1、重组人ant i-EGFR-iRGD基因片段扩增：
[005