一种特异性结合PRRS病毒非结构蛋白Nsp4纳米抗体及其应用
【专利摘要】本发明涉及一种PRRS病毒非结构蛋白Nsp4的纳米抗体，同时公布了该纳米抗体的氨基酸序列以及编码该纳米抗体的DNA序列。本发明还提供了一种慢病毒载体，其可以将上述纳米抗体基因导入宿主细胞使其发挥抗病毒功能。本发明的Nsp4纳米抗体可以特异性结合PRRS病毒非结构蛋白Nsp4，并且具有抑制PRRS病毒在细胞中增殖的功能。
【专利说明】
一种特异性结合PRRS病毒非结构蛋白NsP4纳米抗体及其应用
技术领域
[0001 ]本发明属于生物技术领域，具体涉及一种PRRS病毒非结构蛋白Nsp4纳米抗体及其 在抗病毒中的应用。
【背景技术】
[0002] 猪繁殖与呼吸综合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome, PRRS)又名蓝耳病，是由PRRS病毒感染所致的一种猪的急性传染病。该病使得我国养猪业遭 受的巨大的经济损失，但是由于PRRS病毒具有抗原变异性、嗜巨噬细胞性、抗体依赖性增强 作用（ADE)和持续性感染等特征（Chand R J:Pathogenesis of porcine reproductive and respiratory syndrome virus.Curr Opin Virol ,2012,2(3) :256-263)，现有疫苗对 该病的保护作用非常有限，而且目前还没有针对该病的特效抗病毒药物。
[0003] PRRS病毒为单股正链RNA病毒，其基因组大小约为15kb，包括至少11个开放阅读框 (0RF)。其中0RF1 (包括ORFla和ORFlb)是最大的一个阅读框约占病毒基因组的SO^ARFla 和ORFlb编码的多聚蛋白ppla和pplab随后被病毒编码的蛋白酶酶解为成熟的非结构蛋白， 这些非结构蛋白共同组成病毒的复制转录复合体来完成病毒的复制和增殖。Nsp4具有3C样 丝氨酸蛋白酶活性，是PRRS病毒的主要蛋白酶，负责Nsp3-12的加工与成熟。最新的研究还 表明Nsp4还与病毒的毒力以及宿主对病毒的固有免疫有关。因此Nsp4非常合适作为抗病毒 药物靶点。
[0004] 1993年Hamers等人发现骆驼体内存在一种仅具有重链的抗体，将其称为重链抗体 (heavy-chain antibodies,HCAbs)(Hamers-Casterman C: Naturally occurring antibodies devoid of light chains .Nature ,1993,6428(363) :446-448)。这类抗体的抗 原结合位点仅由重链的可变区VHH(variabledomain of the heavy chain of HCAbs，VHH) 单结构域形成，尽管天然缺失轻链可变区，却仍具有良好和广泛的抗原结合力。VHH抗体是 目前所发现的具有完整功能的最小分子抗体片段，分子量为15kDa，仅为常规抗体的1/10， 其分子高度4.8nm，直径2.2nm，故被称为纳米抗体(nanobody) JHH抗体重要的特征之一是 其具有更长的抗原互补结合区（CDR)，可结合一些常规抗体无法接近的抗原表位，如位于酶 蛋白裂隙中的活性中心结构（De Genst E:Molecular basis for the preferential cleft recognition by dromedary heavy-chain antibodies.Proc Natl Acad Sci USA, 2006，103(12): 4586-4591)。另外，它还具有易表达，水溶性好，稳定性强，免疫原性弱，组织 穿透性好等优点，使得该抗体作为一种小型化的基因工程抗体在基础研究、药物开发等领 域有广阔的应用前景。
【发明内容】
[0005] 发明目的
[0006] 本发明所要解决的技术问题是提供一种特异性针对PRRS病毒非结构蛋白Nsp4并 可以抑制病毒增殖的纳米抗体，同时提供这些纳米抗体的编码序和一种慢病毒载体。
[0007] 技术方案
[0008] 本发明的目的是通过如下措施来达到：
[0009] 一种PRRS病毒非结构蛋白Nsp4的纳米抗体，包括框架区FR和互补决定区⑶R，其特 征在于，所述框架区FR选自下组的FR的氨基酸序列：SEQ ID N0:1所示的FR1，SEQ ID N0:2 所示的FR2，SEQIDN0:3所示的FR3，SEQIDN0:4所示的FR4;或SEQIDN0:5所示的FR1， SEQIDN0:6所示的FR2，SEQIDN0:7所示的FR3，SEQIDN0:8所示的FR4;所述互补决定区 CDR选自下组的CDR氨基酸序列：SEQIDN0:9所示的CDR1，SEQIDN0:10所示的CDR2，SEQ ID N0:11 所示的CDR3;或SEQ ID N0:12所示的CDR1，SEQ ID N0:13所示的CDR2，SEQ ID NO: 14所示的CDR3。优选地，所述的PRRS病毒非结构蛋白Nsp4的纳米抗体，其特征在于，具有SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列。
[0010] -种DNA分子，其特征在于，它编码本发明所述的Nsp4纳米抗体。优选地，所述DNA 分子，其特征在于，具有SEQ ID NO :17所示的核苷酸序列。
[0011] -种慢病毒载体，其特征在于，它含SEQ ID N0:17或SEQ ID N0:18所示的核苷酸 序列。优选地，所述慢病毒载体，其特征在于，其可以将PRRS病毒非结构蛋白Nsp4的纳米抗 体基因导入宿主细胞使其发挥抗病毒功能。
[0012]有益效果
[0013]本发明的PRRS病毒非结构蛋白Nsp4特异性纳米抗体可以特异性结合Nsp4。利用慢 病毒载体，其可以将上述纳米抗体基因导入宿主细胞，并在细胞中表达纳米抗体，从而发挥 抗病毒功能。
【附图说明】
[0014] 图1是ELISA实验鉴定Nsp4纳米抗体结合力及特异性的结果。
[0015] 图2是用We stern Blot检测经慢病毒转导后Marc-145细胞中Nanobody-eGFP融合 蛋白表达的结果。泳道1是未经转导的Marc-145细胞，泳道2是Nb-NC慢病毒转导的Marc-145 细胞，泳道3是Nb4-1慢病毒转导的Marc-145细胞，泳道4是Nb4-2慢病毒转导的Marc-145细 胞。
[0016] 图3 PRRS病毒接种细胞24和48小时后培养上清中子代病毒滴度(TCID50)。
【具体实施方式】
[0017] 本发明首先将Nsp4重组蛋白免疫一只阿拉善双峰驼，经过5次免疫之后分离该双 峰驼外周血淋巴细胞并构建了 Nsp4特异的单域重链抗体文库。将可溶性Nsp4重组蛋白包被 在酶标板上，利用噬菌体展示技术筛选Nsp4免疫性的纳米抗体基因库(骆驼重链抗体噬菌 体展示基因库），获得了 Nsp4特异性纳米抗体。构建携带纳米抗体基因的慢病毒载体，将其 导入Marc-145细胞，胞质内表达的Nsp4纳米抗体可以高效地抑制PRRS病毒在Marc-145细胞 中的增殖。
[0018] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。
[0019] 实施例1:针对PRRS病毒非结构蛋白Nsp4纳米抗体文库的构建：
[0020] (1)将5ml Nsp4重组蛋白（lmg/ml)与弗氏佐剂等体积混合并乳化均匀，免疫一只 阿拉善双峰驼，每两周1次，共免疫5次，除第一次使用弗氏完全佐剂，剩余几次全部使用弗 氏不全佐剂。（2)最后一次免疫后3天，提取骆驼外周血淋巴细胞并提取总RNA，参照QIAGEN RNA提取试剂盒说明书操作。（3)按照InvitrogenS_upe:rSc_i'ip_t?III第一链合成系统试剂盒说 明书，将提取的RNA反转录成cDNA并利用套式PCR扩增VHH链，第一轮PCR:
[0021] 上游引物:GTCCTGGCTGCTCTTCTACAAGG
[0022] 下游引物:GGTACGTGCTGTTGAACTGTTCC
[0023]扩增重链抗体信号肽肽和抗体CH2之间的片段，55°C退火，28个循环；回收700bp附 近目的条带。
[0024]第二轮 PCR:
[0025]以第一轮PCR回收产物作模板，
[0026] 上游引物：CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCTGGGGGAGR
[0027] 下游引物：CTAGTGCGGCCGCTGAGGAGACGGTGACCTGGGT
[0028]扩增重链抗体可变区（VHH)基因，55°C退火，18个循环，回收目的片段。（4)使用限 制性的内切酶(购自NEB)PstI及Notl酶切20yg pCANTAB 5E噬菌体展示载体，及7yg VHH，并 用T4DNA连接酶(NEB)连接两个片段。（5)将连接产物电转化至电转感受态细胞TG1中，活化 后涂布于LB-AMP琼脂平板，37°C过夜培养，收集菌苔_80°C保存。（6)取50μ1-80Γ保存的甘 油菌，接种于l〇〇ml LB-AMP培养基，待细菌生长至对数期，用20Μ0Ι Μ13Κ07辅助噬菌体感染 TG1细胞，过夜培养后纯化噬菌体，得到免疫骆驼纳米抗体噬菌展示基因库。
[0029] 实施例2:针对Nsp4的纳米抗体筛选过程：
[0030] (1)将溶解在0.01M pH 7.4PBS中的Nsp4重组蛋白（10yg/孔)偶联在NUNC酶标板 上，4°C放置过夜，同时设立阴性对照。（2)第二天加入200微升2.5%脱脂奶粉，室温封闭2小 时。（3)2小时后，每孔加入100μΙ噬菌体（lXloUpfu免疫骆驼纳米抗体噬菌展示基因库），在 室温下作用1小时。（4)用PBST(PBS中含有0.05 %吐温20)洗15遍，洗去不结合的噬菌体。（5) 用三乙基胺（100mM)洗脱与Nsp4特异性结合的噬菌体，并感染处于对数期生长的大肠杆菌 TG1，产生并纯化噬菌体用于下一轮的筛选。经过3轮筛选，富集阳性克隆。
[0031 ]实施例3:用酶联免疫方法(ELISA)鉴定单个阳性克隆：
[0032] (1)经过3轮筛选后，将感染噬菌体的TG1细胞按一定稀释比例涂布于LB-AMP琼脂 平板，随机挑取96个单克隆接种于TB-AMP培养基中生长至对数期后，加入终浓度ImM的 IPTG，37°C培养过夜。（2)收集菌体，-20°C冻融一次，上清中应含有纳米抗体片段。（3)取100 μL上清加入经Nsp4包被的ELISA孔中，同时分别取100μ1上清加入经对照蛋白Nsp9包被的 ELISA孔中，室温放置1小时。（4)用PBST洗5次，加入Rabbit anti-E tag antibody(兔源多 克隆抗体，购自南京金斯瑞公司），室温放置1小时。（5)用PBST洗5次，加入HRP G anti Rabbit antibody(山羊抗兔辣根过氧化物标记抗体，购自Jackson公司），在室温下放置1小 时。（6)用PBST洗5次，加入TMB显色底物，在405nm波长，读取吸收值。（7)当样品孔0D值大于 对照孔0D值3倍以上时，判为阳性克隆孔。（8)对阳性克隆经行测序分析，最终得到两株Nsp4 特异性纳米抗体，命名为Nb4-1和M^ULISA结果如图1所示，核苷酸序列如SEQ ID N0:17 和SEQ ID NO: 18所示。实施例4:慢病毒包装及转导
[0033] (1)通过overlap PCR将纳米抗体基因与增强型绿色荧光蛋白（EGFP)基因通过 linker融合，并通过Xba I和BamH I酶切位点克隆入pTRIP-CMV-Puro载体，得到pTRIP-CMV-Nbx-Puro 载体。（2)将pTRIP-CMV-Nbx-Puro 与载体psPAX2 和pMD2 · G 共转染 Marc-145 细胞，参 照罗氏X-tremeGENE-HP-DNA转染试剂说明书操作。（3)转染后16小时换液，转染后60小时收 集含有慢病毒的培养上清。（4)用上述慢病毒转导Marc-145细胞，转导后36小时换用嘌呤霉 素选择性培养基加压筛选。（5)Wessern-blot进一步验证纳米抗体EGFP融合蛋白的表达，结 果如图2显示，在40kDa附近出现特异性的目的条带，说明融合蛋白表达。
[0034] 实施例5:病毒感染实验
[0035] 将Marc-145细胞和上述经慢病毒转导的Marc-145细胞铺在24孔细胞培养板，至细 胞达到80%汇合度，接种0.1M0I的PRRS病毒SD-16毒株。感染后24和48小时收集细胞上清， 检测病毒滴度(TCID50)，结果如图3显示，Nb4-1和Nb4-2慢病毒转导的Marc-145细胞产生的 子代病毒滴度显著低于对照组(Nb-NC)。
[0036] SEQ ID MO:1 G.l:n Val CAr\ f；ou Gin Gin Sot G.l.y Gly Gly Sor Val. Ilo Sor GJy fr.ly Sor i.ou Arg Leu Ser Cy& Ala Ala Ser SE:Q ID 、TQ:'2: Leu Gly T.rp Phe Arg Glri ￥.al Pro Gly Lys €.lu Arg Glu Gly Val, Ala Ser SEQ ID NO:3 Ty.r Ala Asp Ser Va]- Lys G'ly Arg Phe Thr lie Ser Gin Asp .A.sn Ala Lys Sor Thr Leu Tyr .Leu Gin Met Asn Ser Leu Ly：s Pro Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys SEQ ID NO :4 Trp： Gly Gin Gly Thr Gin Val T.hr ￥al Ser Ser SEQ TD NO:5 Glri Vnl 01η ?；οπ Gin G1n Sor Gly Gly VhI Ι,οιι Val Gin Fro· Ciy Gly Ser Loti. Arg Leu Ser Cys. Ala. .Ala Sar SEQ TD \D：:6 Mot Sor Trp Vnl hrg Gl.n Ala Pro (1.1 y l.ys Gl.y Lou CAn Trp Va;l. S.cr Sor SEQ I'D MO:7 Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr LM Tyr Leti Glu Leu Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr .Ala Met Tyr Tyr Cys SEQ ID NO：8 Trp· Gly Qln Gl.y T.hr Gin ￥al Thr Vn；l Ser Ser SEQ ID NO;9 Gly Tyr Thr Tyr Ser Arg Tyr Ser S.EQ I:D、T0:1Q lie Thr Ser Al.a Gly Thr Thr SEQ ID NQ;11 Ala. i.au Al.a .Gly- Arg Phe Tyr Λκη· Pro Gin His. Trp A)n i.e-u Arg- S：er G：1y Slti Tyr Ala Tyr SEQ ID ,N〇> 12 Gly Phe Thr Phe Ser Ser T.yr Ala· SEQ ΤΙ) Λτ0:13 Tin Asn Gly (rly Gly Asp Thr* His SEQ ID NO: 14 Ala Lys Ala Ala Ser Glu Tyr Trp Ser Gly Gly Tyr Tyr Tyr Thr let Leu Glu Phe Trp Arg Glu His Asp Tyr SEQ ID NO: 15 Gin Val Gin Leu Gin Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val He Ser Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Tyr Ser Arg Tyr Ser Leu Gly Trp Phe Arg Gin Val Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val Ala Ser lie Thr Ser Ala Gly Ser Thr Thr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Se.r Girt Asp· Asn Ala l,ya Ser· Thr i,eu Tyr Gin Met； Asn Ser f.eu f.ys Pro. Glu A,sp Thr ^la Met Tyr Tyr Cys Ala, Leu Ala· Gly Arg. Phe" Ty.r Asn Pm Gin His· Trp. Ala Leu Arg Ser Gly Gl.u Tyr Ala Tyr Trp Gly Gin Glv Thr .Gin Val Thr Val S&r Ser SEQ TD NO: 16 Qln Val Gin i.ou Gin Glu Sor Giy Gly Vnl hou Vnl Gin Pro Gly Gly Srr i,ou Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Met S^r Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly L.eu Glu Trp Val Ser Ser lie As：n. Ser Gly Gly Gl.y Asp T.hr His Tyr Ala Asp- Ser ￥a.l Lys €lj Arg. Phe Thr I'Le Ser Arg Asp- Asn. Ala Lys Asn Thr i,eti· Tyr L：eii' Glu- Leu- Asn $er Leu I,y.s fhr
[0037] Gin Asp. Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Lys Ala Ala Ser Glu Tyr Trp Ser Gly Gly Tyr Tyr Tvr' Thr Met Lea Glu .Fbe (i'rp Arg Glu His',A：sp Tyr Trp Gly Gin Gly I'hr Gin VbI ^hi Val Ser ber
[0038] SEQ ID NO: 17
[0039] CAGGTCCAACTGCAGGAGTCTGGGGGAGGCTCGGTGATTTCTGGAGGGTCTCTGAGACTCTCCTGTGCA GCCTCTGGATACACCTACAGTCGCTATTCACTGGGCTGGTTCCGCCAGGTTCCAGGGAAGGAGCGCGAGGGGGTCGC AAGTATTACTAGTGCTGGTAGCACAACCTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCCAAGACAACGCCA AGAGCACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAAACCTGAAGACACGGCCATGTATTACTGTGCGCTAGCAGGGAGG TTCTATAATCCCCAGCATTGGGCTCTGCGCTCCGGCGAATATGCCTACTGGGGCCAGGGGACCCAGGTCACCGTCTC CTCA
[0040] SEQ ID NO: 18
[0041 ] CAGGTCCAACTGCAGGAGTCTGGGGGAGTCTTGGTGCAGCCTGGGGGGTCTCTGAGACTCTCCTGTGCA GCCTCTGGTTTCACCTTCAGTAGCTATGCCATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTCGAGTGGGTCTC GAGTATTAACAGTGGTGGCGGCGACACACACTATGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACG CCAAAAACACGCTGTATCTGGAATTGAACAGCCTGAAAACTGAGGACACGGCCATGTATTACTGTGCAAAAGCCGCT TCGGAATACTGGAGTGGTGGTTACTACTACACGATGCTGGAGTTTTGGAGGGAACATGACTACTGGGGCCAGGGGAC ACAGGTCACCGTCTCCTCA
【主权项】
1. 一种PRRS病毒非结构蛋白Nsp4的纳米抗体，包括框架区FR和互补决定区CDR，其特征 在于，所述框架区FR选自下组的FR的氨基酸序列： SEQIDN0:1所示的FR1，SEQIDN0:2所示的FR2，SEQIDN0:3所示的FR3，SEQIDN0: 4所示的FR4; 或SEQIDN0:5所示的FR1，SEQIDN0:6所示的FR2，SEQIDN0:7所示的FR3，SEQID 从):8所示的卩尺4; 所述互补决定区⑶R选自下组的⑶R氨基酸序列： SEQIDN0:9所示的CDR1，SEQIDN0:10所示的CDR2，SEQIDN0:11所示的CDR3; 或SEQIDN0:12所示的CDR1，SEQIDN0:13所示的CDR2，SEQIDN0:14所示的CDR3。2. 根据权利要求1所述的PRRS病毒非结构蛋白Nsp4的纳米抗体，其特征在于，具有SEQ ID NO: 15或SEQ ID NO: 16所示的氨基酸序列。3. -种DNA分子，其特征在于，它编码权利要求1或2所述的Nsp4纳米抗体。4. 根据权利要求3所述的DNA分子，其特征在于，具有SEQ ID NO: 17或SEQ ID NO: 18所 示的核苷酸序列。5. -种慢病毒载体，其特征在于，它含SEQ ID NO: 17或SEQ ID NO: 18所示的核苷酸序 列。6. 根据权利要求1或2所述的Nsp4纳米抗体在抗PRRS病毒感染中的应用。7. 根据权利要求3或4所述的DNA序列在抗PRRS病毒感染中的应用。
【文档编号】A61P31/14GK106008709SQ201610142887
【公开日】2016年10月12日
【申请日】2016年3月14日
【发明人】周恩民, 刘红亮
【申请人】西北农林科技大学