制备与筛选改变特异性蛋白酶的方法
【专利说明】制备与筛选改变特异性蛋白酶的方法
[0001] 本申请是2003年10月2日提交的题为"制备与筛选改变特异性蛋白酶的方法"的 中国专利申请200380102653. 0的分案申请。
[000引发明背景
[0003] 酶可W应用于广泛的领域。一组重要的酶族是断裂蛋白的蛋白酶。许多蛋白酶在 特定的底物序列上特异性地断裂祀蛋白。由蛋白酶特异性断裂的趋势被称为底物特异性， 或者底物序列特异性。与多族溶解蛋白酶不同成员有关的底物特异性部分归因于结合区域 内不同组的氨基酸，每个酶族都利用该种结合区域内的氨基酸识别底物，并起到催化作用。 针对一些蛋白酶，已经成功地研究出设计变异酶的合理方案。从结合裂隙保留的结晶数据 获知，枯草杆菌蛋白酶的保守氨基酸残基（甘氨酸166)可W改变成多种不同氨基酸残基 中的一种氨基酸残基。所得的酶衍生物表现出底物特异性的明显变化，并伴随着疏水性与 氨基酸大小的增长（Wells等人，Cold Spring Harb，《症状定量生物学》第1987年第52期 第647-652页）。人们还合理地改变了另一种细菌编码的丝氨酸内肤酶（endop巧tidase)、 a -溶解蛋白酶，将其192甲硫氨酸改变为丙氨酸。在其活性位点内获得的变异表现出增加 了酶活性位点的结构柔性。对于更大型、疏水性更强的祀，所得的a-溶解蛋白酶衍生物具 有了更广泛的底物特异性炬one等人，《生物化学》1991年第43期第10388-10398页）。
[0004] 丝氨酸蛋白酶是广泛研究的与W其所谓催化S合体；天冬氨酸一组氨酸一丝氨酸 为特征的内肤酶相关的族。在相似蛋白的族中，保留第一、第二和第=结构的区域趋向于含 有设及活性位点的残基，W及对活性很重要的其它残基。例如，尽管催化=合体的成员远离 丝氨酸蛋白酶的第一结构（氨基酸结构），但是，该些残基对准了该些蛋白第=结构（或者 折叠）形成的结合区域。
[0005] 丝氨酸蛋白酶在底物序列识别特性方面差别很大：一些丝氨酸蛋白酶具有强特异 性（即，设及血液凝固和免疫补体系统的蛋白酶）；一些丝氨酸蛋白酶只具有部分的特异性 (即，哺乳动物消化蛋白酶，膜蛋白酶和膜凝乳蛋白酶）；并且其它类型的丝氨酸蛋白酶，象 枯草杆菌蛋白酶，一种细菌蛋白酶，完全不具备特异性。尽管存在特异性差异，丝氨酸蛋白 酶的催化机理还是非常保守的，由底物序列结合位点构成，此结合位点准确定位于活性位 点中带有五个氨键的易切断肤。一旦与该种易切断肤结合，催化=合体的=个恒定残基之 间的氨键网络就催化产生了此肤键的水解。尽管催化机理高度保守，但是该种大族蛋白酶 在序列特异性方面可W具有广泛的差异。
[0006] 发明概述
[0007] 本发明设及制备并筛选断裂公知设及疾病蛋白的蛋白酶。所得的蛋白可W作为生 命体内的治疗剂。
[000引本发明广泛设及改变底物序列特异性的蛋白酶修饰，W致修饰蛋白酶断裂了设及 或者造成病症的祀蛋白。在本发明一【具体实施方式】中，修饰的蛋白酶是丝氨酸蛋白酶。在 本发明另一【具体实施方式】中，修饰的蛋白酶是半脱氨酸蛋白酶。
[0009] 本发明一具体实施设及制备蛋白酶序列库，用于筛选在所需底物序列处断裂所需 祀蛋白的蛋白酶。在此【具体实施方式】的一个方面，序列库的每个成员是带有针对其自身产 生多种变异的蛋白酶支架。蛋白酶支架具有与公知蛋白酶相同或者相似的序列。在一具体 实施方式中，该样的支架是丝氨酸蛋白酶。在另一【具体实施方式】中，该样的支架是半脱氨酸 蛋白酶。使用所需祀蛋白的所需底物序列，测定序列库每个成员的断裂活性。结果是，可W 测定出相对于所需的底物序列具有最高断裂活性的蛋白酶。
[0010] 在此【具体实施方式】的另一方面，对于蛋白酶支架产生的变异数量可W是1、2- 5(例如 2、3、4 或者 5)，5-10(例如 5、6、7、8、9 或者 10)，或者 10-20(例如 10、11、12、13、 14、15、16、17、18、19、或者20)。
[0011] 在此【具体实施方式】的另一方面，公知的蛋白酶支架可W含有下述任一种微粒 的氨基酸序列：膜蛋白酶、膜凝乳蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶、凝血酶（thrombin)、纤溶 酶（plasmin)、凝血因子Xa、尿激酶型纤溶酶原激活物（urokinase type plasminogen activator, uPA)、组织纤溶酶原激活物（tissue plasminogen activator, tPA)、膜型丝氨 酸蛋白酶-1 (MTSP-1)、粒酶B、粒酶M、弹性蛋白酶、糜蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性白细胞弹性 蛋白酶、血浆激肤释放酶、尿激酶型纤溶酶原激活物、补体因子丝氨酸蛋白酶、ADAMTS13、神 经内肤酶/neprilysin、弗林蛋白酶、或者克鲁蛋白酶。
[0012] 在此【具体实施方式】的另一方面，祀蛋白是与病症有关的，例如，祀蛋白导致了病 症。病症可W是，例如类风湿性关节炎、败血症、癌症、艾滋病、呼吸道感染、流行性感冒、屯、 血管疾病、或哮喘。
[0013] 在此【具体实施方式】的另一方面，与序列库平均活性相比，测定的蛋白酶活性增长 了至少10倍、100倍、或者1000倍。
[0014] 本发明另一【具体实施方式】设及生成了用于筛选修饰蛋白酶的底物序列库，从而测 定出哪种底物序列（组）是修饰蛋白酶最有效断裂的底物序列（组）。序列库成员是由随 机氨基酸序列构成的，并且测定蛋白酶对于序列库每个成员的断裂活性。测定出蛋白酶最 有效断裂的底物序列。
[0015] 此【具体实施方式】的另一个方面，底物序列是祀蛋白的一部分。此祀蛋白可W设及 病症。例如，祀蛋白是造成病症的一种蛋白。此【具体实施方式】的另一个方面，病症可W是类 风湿性关节炎、败血症、癌症、艾滋病、呼吸道感染、流行性感冒、屯、血管疾病、或哮喘。
[0016] 此【具体实施方式】的另一个方面，与序列库平均活性相比、测定底物序列的断裂效 率增长了至少10倍、至少100倍、或者至少1000倍。
[0017] 在另一【具体实施方式】中，本发明包括治疗带有病症的患者。该种方法设及将断裂 与病症有关祀蛋白的蛋白酶给药患者，W致断裂祀蛋白治疗病症。
[0018] 此【具体实施方式】的一个方面，病症可W是类风湿性关节炎、败血症、癌症、艾滋病、 呼吸道感染、流行性感冒、屯、血管疾病、或哮喘。此【具体实施方式】的另一个方面，该样的蛋白 酶可W是丝氨酸蛋白酶。在本发明的另一【具体实施方式】，该样的修饰蛋白酶是半脱氨酸蛋 白酶。在此【具体实施方式】的另一方面，祀蛋白造成了病症。
[0019] 带有病症的患者，例如由本发明方法治疗的患者，可W是哺乳动物，或者更具体的 是一个人类。
[0020] 在此【具体实施方式】的另一方面，祀蛋白可W是肿瘤坏死因子受体、白介素-1、白介 素-1受体、白介素-2、白介素-2受体、白介素-4、白介素-4受体、白介素-5、白介素-5受 体、白介素-12、白介素-12受体、白介素-13、白介素-13受体、P选择蛋白（p-selectin)、P 选择蛋白糖蛋白配基（p-selectin glycoprotein ligand)、P物质、缓激肤、PSGL、凝血因子 IX、免疫球蛋白E、免疫球蛋白E受体、CC贴、CXCR4、糖蛋白120、糖蛋白41、CD4、血凝素、呼 吸道合胞病毒融合蛋白（respiratoiy syn巧tium virus fusion protein)、B7、CD28、CD2、 CD3、CD4、CD40、血管内皮生长因子、血管内皮生长因子