专利名称：基于桔小实蝇气味结合蛋白的引诱剂筛选方法
技术领域：
本发明属于生物工程技术领域，具体涉及基于桔小实蝇气味结合蛋白的引诱剂筛选方法。
背景技术：
桔小实妮ifecirocerai/iansaJis,又名东方果实妮(Orient fruit fly)，属双翅目(Diptera),实蚬科(Tephritidae),果实蚬属 Beictrocerei Macquart,是一类重要的检疫性害虫。该虫寄主范围广，据报道可以为害46科250多种水果，对香蕉、番石榴、芒果和柑橘等为害严重，给我国水果产业造成巨大的经济损失。目前生产上主要采取化学防治控制其危害，但化学农药不仅易造成水果和环境污染，且因其为害方式特殊(主要以成虫产卵于果实果皮下，幼虫潜居果瓤取食，有果皮的物理屏蔽)而难以奏效。由于植食性昆虫对其嗜好的寄主植物气味有明显的选择倾向，而桔小实蝇对于多种寄主水果也具有较明显的嗜好性，如番石榴、葡萄、甜橙、香蕉等水果均是桔小实蝇的重要水果寄主，而桔小实蝇也都能够对它们产生显著的嗅觉引诱反应，因此我们可以根据桔小实蝇的主要寄主水果挥发物筛选和获得其嗅觉引诱剂。但由于各种水果的挥发物成分种类复杂，如何筛选出合适的引诱剂配方成为制约桔小实蝇嗅觉引诱剂尤其是雌虫引诱剂的瓶颈。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明的目的在于设计提供基于桔小实蝇气味结合蛋白的引诱剂筛选方法的技术方案。所述的基于桔小实蝇气味结合蛋白的引诱剂筛选方法，其特征在于包括以下工艺步骤:
O收集桔小实蝇触角总RNA ；
2)通过RT-PCR获得桔小实蝇气味结合蛋白的全长；
3)构建桔小实蚬气味结合蛋白的原核表达载体；
4)通过IPTG诱导桔小实蝇重组气味结合蛋白表达，并通过镍琼脂糖凝胶亲和层析柱对其进行纯化；
5)通过竞争性荧光结合方法获得桔小实蝇重组气味结合蛋白与寄主水果气味挥发物的结合反应谱，解离常数&低于10 μ mol/L寄主水果嗅觉以下，荧光竞争的IC5tl值小于30 μ mol/L时,确定为适合桔小实蝇的寄主水果嗅觉引诱剂。所述的基于桔小实蝇气味结合蛋白的引诱剂筛选方法，其特征在于所述的步骤4)中IPTG诱导桔小实蝇重组气味结合蛋白表达的诱导条件为:IPTG浓度为0.8 1.2mmol/L，温度为28 32°C，诱导转速为150 250rpm，诱导时间为4 6h。所述的基于桔小实蝇气味结合蛋白的引诱剂筛选方法，其特征在于所述的步骤4)中IPTG诱导桔小实蝇重组气味结合蛋白表达的诱导条件为:IPTG浓度为l.0mmol/L，温度为30°C，诱导转速为200r pm，诱导时间为5h。
所述的基于桔小实蝇气味结合蛋白的引诱剂筛选方法，其特征在于所述的步骤5)中竞争性荧光结合方法获得桔小实蝇重组气味结合蛋白与寄主水果气味挥发物的结合反应谱的工艺步骤包括:
O荧光配基1-NPN与桔小实蝇重组气味结合蛋白的结合
在282nm激发波长下，向I μ mol/L的桔小实蝇重组气味结合蛋白中逐次加入lmmol/L的1-NPN，充分混匀；
2)配基结合和EAG验证
选取桔小实蝇寄主水果主要气味挥发物和1-NPN进行竞争结合桔小实蝇重组气味结合蛋白，如果桔小实蝇寄主水果主要气味挥发物、1-NPN与BdorOBP相对荧光值竞争至50%以下，并且解离常数&低于10 μ mol/L寄主水果嗅觉以下，荧光竞争的IC5tl值小于30μ mol/L时或者荧光值竞争至30%以下时，则确定为适合桔小实蝇的寄主水果嗅觉引诱剂。本发明从桔小实蝇嗅觉生理的模式出发，通过分子生物学技术克隆了其气味结合蛋白全长基因，并通过原核表达技术获得了编码该基因的重组蛋白，最后通过生物化学结合技术探讨了其与不同茶树来源的寄主水果嗅觉挥发物的亲和力。本发明为桔小实蝇寄主水果嗅觉气味信息引诱剂配方的筛选和设计提供了新的策略。
图1为Bdor0BP2基因的PCR扩增 图2为菌落PCR鉴定 图3为重组桔小实蝇气味蛋白BdorOBP的分离纯化 图4为重组BdorOBP蛋白与荧光配基1-NPN的荧光结合曲线 图5为候选配基与荧光配基1-NPN和重组BdorOBP蛋白的竞争结合 图6为桔小实蝇雌雄虫对不同水果挥发性物质的EAG反应对荧光结合验证图。图3 中:1:未诱导的 pET32a-Bdor0BP 的 BL21 (DE3)菌体；2:经 IPTG 诱导的pET32a-Bdor0BP 菌体；3: pET32a-Bdor0BP 经超声破碎后的沉淀；4:pET32a-Bdor0BP 经超声破碎后的上清；5:纯化后的pET32a-Bdor0BP蛋白。
具体实施例方式
以下结合实施例来进一步说明本发明。实施例1:收集桔小实蝇触角总RNA以及气味结合蛋白OBP的基因克隆 I桔小实蝇气味结合蛋白Bdor0BP2的克隆
1.1桔小实蝇总RNA的提取
采用Trizol试剂提取桔小实蝇的总RNA,具体操作步骤如下:
1)从-80°C取出保存的桔小实蝇样品，放入用液氮预冷的研钵中，加入液氮快速进行研磨，此步骤在冰上操作，待研成粉末后，称取100 mg组织样品装入1.5 mL离心管中，然后加入I ml Trizol试剂，漩涡混合器上进行混合；
2)将样品在室温静置5min，使核酸蛋白复合物完全分离；
3)4 °C, 12 000Xg,离心 5 min ； 4)将上清转移至新的离心管中(切勿吸取沉淀)，然后加入200μ L的氯仿上下颠倒混匀15 s，室温放置15 min ；
5)4 °C, 12 OOOXg,离心 15 min ；
6)转移500μ L左右的上清至另一新的离心管中，然后加入200 μ L的异丙醇，上下颠倒充分混匀后，在15 °C静置10 min ；
7)4 °C, 12 000Xg,离心 10 min ；
8)倒掉上清，然后向离心管中加入Iml浓度为75 %的乙醇(DEPC水配制)，进行洗
涤；
9)4°C，8 000 X g，离心 5 min ；
10)倒掉上清，先在空气中干燥沉淀5-10min，再用DEPC水溶解沉淀；
11)待RNA完全溶解后，将提取的总RNA保存于_801:冰箱中或者进行反转录合成第一链。1.2第一链cDNA的合成
采用TaKaRa公司的反转录试剂盒合成桔小实蝇的第一链cDNA。实验方法按照试剂盒说明书进行，具体实验步骤如下:
权利要求
1.基于桔小实蝇气味结合蛋白的引诱剂筛选方法，其特征在于包括以下工艺步骤: O收集桔小实蝇触角总RNA ； 2)通过RT-PCR获得桔小实蝇气味结合蛋白的全长； 3)构建桔小实蚬气味结合蛋白的原核表达载体； 4)通过IPTG诱导桔小实蝇重组气味结合蛋白表达，并通过镍琼脂糖凝胶亲和层析柱对其进行纯化； 5)通过竞争性荧光结合方法获得桔小实蝇重组气味结合蛋白与寄主水果气味挥发物的结合反应谱，解离常数KD低于10 μ mol/L寄主水果嗅觉以下，荧光竞争的IC50值小于30 μ mol/L时,确定为适合桔小实蝇的寄主水果嗅觉引诱剂。
2.如权利要求1所述的基于桔小实蝇气味结合蛋白的引诱剂筛选方法，其特征在于所述的步骤4)中IPTG诱导 桔小实蝇重组气味结合蛋白表达的诱导条件为:IPTG浓度为0.8 1.2mmol/L，温度为28 32°C，诱导转速为150 250rpm，诱导时间为4 6h。
3.如权利要求1所述的基于桔小实蝇气味结合蛋白的引诱剂筛选方法，其特征在于所述的步骤4)中IPTG诱导桔小实蝇重组气味结合蛋白表达的诱导条件为:IPTG浓度为1.0mmol/L,温度为30°C,诱导转速为200rpm,诱导时间为5h。
4.如权利要求1所述的基于桔小实蝇气味结合蛋白的引诱剂筛选方法，其特征在于所述的步骤5)中竞争性荧光结合方法获得桔小实蝇重组气味结合蛋白与寄主水果气味挥发物的结合反应谱的工艺步骤包括: O荧光配基1-NPN与桔小实蝇重组气味结合蛋白的结合 在282nm激发波长下，向I μ mol/L的桔小实蝇重组气味结合蛋白中逐次加入lmmol/L的1-NPN，充分混匀； 2)配基结合和EAG验证 选取桔小实蝇寄主水果主要气味挥发物和1-NPN进行竞争结合桔小实蝇重组气味结合蛋白，如果桔小实蝇寄主水果主要气味挥发物、1-NPN与BdorOBP相对荧光值竞争至·50%以下，并且解离常数KD低于10 μ mol/L寄主水果嗅觉以下，荧光竞争的IC50值小于·30 μ mol/L时或者荧光值竞争至30%以下时，则确定为适合桔小实蝇的寄主水果寄主水果嗅觉嗅觉引诱剂。
全文摘要
基于桔小实蝇气味结合蛋白的引诱剂筛选方法，属于生物工程技术领域。其包括以下步骤收集桔小实蝇触角总RNA；通过RT-PCR获得桔小实蝇气味结合蛋白的全长；构建桔小实蝇气味结合蛋白的原核表达载体；通过IPTG诱导桔小实蝇重组气味结合蛋白表达，并通过镍琼脂糖凝胶亲和层析柱对其进行纯化；通过竞争性荧光结合方法获得桔小实蝇重组气味结合蛋白与寄主水果气味挥发物的结合反应谱，解离常数KD低于10μmol/L寄主水果嗅觉以下，荧光竞争的IC50值小于30μmol/L时，确定为适合桔小实蝇的寄主水果嗅觉引诱剂。本发明为桔小实蝇寄主水果嗅觉气味信息引诱剂配方的筛选和设计提供了新的策略。
文档编号C07K1/22GK103245647SQ20131015231
公开日2013年8月14日 申请日期2013年4月27日 优先权日2013年4月27日
发明者李红亮, 陈玲, 商晗武, 王强 申请人:中国计量学院