专利名称：一种从昆虫触角中分离鉴定OBPs基因的方法
技术领域：
本发明涉及利用昆虫的嗅觉系统来进行害虫生物防治的技术领域；进一步，本发明涉及利用SMART技术构建触角cDNA文库以及结合生物信息学方法分离鉴定昆虫气味结合蛋白OBI^s的方法。
背景技术：
盲蝽蟓隶属于半翅目盲蝽科，是我国棉花生产上的一类重要害虫。1997年，我国开始商业化种植Bt棉花，到2007年Bt棉花的种植面积达到了 380万公顷，占全国棉花总种植面积的69%。种植Bt棉花有效的控制了棉铃虫等主要鳞翅目害虫的危害，使化学农药使用量因此大幅度减少，随之，棉田害虫地位发生了一系列演替，盲蝽蟓种群数量剧增，危害加强，并且呈严重灾变趋势发生(Lu YH,Qiu F, Feng HQ，et al. Species composition and seasonal abundance ofpestiferous plant bugs(Hemiptera :Miridae)on Bt Cotton in china. CropProtection,2008,27 :465-472)。据各地植保部门反映，近年来很多地方盲蝽蟓为害导致的棉花产量损失约为20% -30%，严重地区高达50%左右。棉田盲蝽蟓的严重发生还波及了枣、桃、苹果、樱桃、葡萄、茶树等农作物，已经成为影响多种农作物生产的重大问题。由于Bt棉抗盲蝽蟓效果较差，因此现在防治盲蝽蟓主要靠化学农药，这不仅容易导致棉铃虫等鳞翅目害虫抗药性的产生，而且对环境造成了巨大的破坏和污染，因此，有必要发展经济有效的、环境友好的防治方法。嗅觉对于许多昆虫的生存和繁衍至关重要。昆虫在长期的进化过程中，发展演变了发达的触角系统(Field LM, Pickett JA and WadhamsLJ. Molecular studies in insect olfaction. Insect Mol. Biol. ,2000,9(6) :545-551)。昆虫的触角系统是一个高度专一和灵敏的化学检测器，可以特异性识别环境中的化学气味分子，并依次觅食、寻偶、 选择产卵的信息。而昆虫气味结合蛋白与脂溶性的气味物质发生作用，是昆虫专一性识别外界气味物质的第一步生化反应(Vogt RG and RiddifordLM. Pheromone Binding and inactivation by moth antennae. Nature, 1981, 293 :161-163)。昆虫气味结合蛋白(Odorant binding proteins, OBPs)是一类低分子量 (16KDa左右)、等电点偏酸性(为4. 0-5.0)、球状的水溶性蛋白，在昆虫识别外界气味物质中起着重要的作用，其主要存在于昆虫嗅觉感器淋巴液中。其作用是结合并运输脂溶性的气味分子通过水溶性的淋巴液到达嗅觉神经树突末梢(Pelosi P and Maida R. Odorant-bindingproteins in insects. Comp. Biochem.Physiol. ,1995,111 (3) 503-514)。因此，深入研究OBI^s不仅具有重要的理论意义，而且在实践中可以为害虫检测防治和益虫利用提供新途径、新方法，为研制开发无污染、不杀伤天敌、与环境相容性较好的高效引诱剂提供理论依据。也有利于阐明昆虫的嗅觉识别机制，同时对于研究脊椎动物的嗅觉识别机制也具有重要的启示意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种昆虫气味结合蛋白基因的分离鉴定方法，利用此方法可以有效分离出OBI^s基因，所发现的OBI^s基因可以为害虫检测防治和益虫利用提供新途径、 新方法，为研制开发无污染、不杀伤天敌、与环境相容性较好的高效引诱剂提供理论依据。为达到上述目的，本发明的技术方案提供一种从昆虫触角中分离鉴定气味结合蛋白基因的方法，包括步骤(1)利用SMART技术获得触角全长cNDA序列；(2) Sfi 酶双酶切所述 ds cDNA ；(3)利用凝胶层析柱对酶切产物按片段大小进行分离，收集片段长度最长的ds cDNA ； (4)步骤(3)的ds cDNA和pDNR-LIB载体连接，得重组质粒；(5)所述重组质粒转化ElectroMAX DH5 α -E感受态细胞，得到未扩增的初始化 cDNA文库；(6)采用生物信息学的方法从cDNA文库中鉴别气味结合蛋白基因。根据本发明的一个优选实施方案，本发明的方法的具体技术方案包括以下步骤(1)触角RNA的提取、反转录合成第一链cDNA及LD-PCR合成ds cDNA 取200对触角在液氮中研磨，利用Trizol提取RNA，电泳检测RNA的质量，分光光度计测定RNA的浓度。利用SMART技术和LD-PCR方法反转录合成第一链cDNA和ds cDNA。 1.5%琼脂糖电泳检测LD-PCR产物条带大小分布。同时为了抑制DNA聚合酶的活性，利用蛋白酶K消化LD-PCR产物。(2) Sfi I 酶切 ds cDNA 及 CHROMA SPIN-400 柱子分离 dsCDNA 上述蛋白酶K消化好的ds cDNA 5’端和3’端含有Sfi I内切酶的酶切位点，为了便于ds cDNA和pDNR-LIB载体的连接，用Sfi I内切酶对ds cDNA进行酶切。酶切完之后，再利用CHROMA SPIN-400柱子按ds⑶NA的大小进行分离，1. 5%电泳检测分离产物，收集片段长度最长的ds cDNA。(3) ds cDNA和pDNR-LIB载体的连接及重组质粒电转化DH5 α大肠杆菌细胞为了得到最佳的连接效果，需要对ds cDNA和pDNR-LIB的连接比例进行优化，ds cDNA和pDNR-LIB载体的连接比例分别为1 2，1 1和3 2，分别电转化DH5a大肠杆菌细胞，转化完成后，根据得到的单克隆数量确定最佳的连接比例是ds cDNA =PDNR-LIB载体=1 2，然后按照最佳的连接比例再进行重组质粒转化DH5a大肠杆菌细胞，最终得到未扩增的初始化cDNA文库。 (4)初始化cDNA文库滴度的测定在将原始cDNA文库冷冻或者扩增之前，应当检测原始cDNA文库的滴度。一个好的有代表性的文库其滴度应当是独立克隆子数目的10倍以上。通常情况下，为了便于长期保存，质粒文库的滴度应该至少在Kfpfu/ml。本文库测定滴度的方法如下分别取0. 5μ 1，0. 25μ 1，0. 05μ 1，0. 025μ 1，0. 005μ 1 原始文库涂于 200μ 1 LB 平板中，混勻，37 °C共培养1 Oh左右，待出现单克隆，计数。(5)菌液PCR检测插入片段的大小和重组率利用菌液PCR随机检测1000个单克隆插入片段的大小，并计算重组率。菌液PCR引物序列如下M13-Forward primer(5‘ _3，) TGTAAAACGACGGCCAGTM13-Reverse primer(5‘ _3， ) :AACAGCTATGACCATG从电泳图谱可以看出，插入片段均> 500bp，平均大小在800bp以上，重组率> 98%，说明所构建的cDNA文库质量较高，能够进行下一步分析。(6)利用生物信息学方法从cDNA文库中鉴别气味结合蛋白OBI5s基因利用M13引物对从文库中挑选的单克隆进行测序，为了得到基因的全长，测序方向为5’端测序。对通过测序得到的EST序列进行生物学分析如下 PHRED程序评估EST序列的质量，用Q20程序剔除EST序列两端的低质量碱基。用 PHRAP软件包中的Cross Match程序剔除EST序列中的载体序列和弓I物序列。然后得到的高质量的EST序列用CAP3软件进行聚类分析，聚类分析结果得到Unigenes，仅含有一个EST 的Unigenes称之为Singletons，含有两个以上的Unigenes称之为contigs。本发明中共得到四15个EST序列，共计产生了 1423个Unigenes，其中包含1208个Singletons,占所有Unigenes的84. 9%。根据OBI3s蛋白氨基酸序列中都含有6个保守的半胱氨酸的特征， 设计程序从1423个Unigenes中鉴定气味结合蛋白基因，同时结合BLASTX和BLASTN比对结果对鉴定结果进行人工确认。气味结合蛋白OBI^s基因的鉴别程序如下其中“Classical OBPs"的鉴别程序为Cl-X20_66-C2-X3-C3-X21_43-C4-X8_14-C5-X8-C6 ；Cl-X15_39-C2-X3-C3-X21_44-C4-X7_12-C5-X8-C6 ；"Plus-C OBI^s” 的鉴别程序为Cl-X20_41-C2-X3-C3-X41_46-C4-X19_29-C4a-X9-C5-X8-C6-P-X9_10-C6a-X9_10 ；α-Α-Μ-ΟΖ-Α-ΟΒ- ^-^-ΟΑ-Χ^^ΟΑΒ-Χ^Οδ-Χ τΟΘ-Ρ-Χρη-ΟθΒ。最终从苜蓿盲蝽触角cDNA文库中得到14个OBI3s基因，所有的OBI3s基因都为全长，包含有完整的开放阅读框。其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1 SEQ ID N0. 14其中一项所示。编码的气味结合蛋白的一级结构的氨基酸序列如SEQ ID N0. 15 SEQ ID N0.观其中一项所示。本发明的方法利用SMART技术构建触角cDNA文库，同时结合生物信息学方法从触角文库中鉴定昆虫气味结合蛋白基因，与通过RACE设计兼并引物扩增得到基因全长的方法相比，本发明方法具有成本低、时间快、易操作的优点，更为重要的是，利用本发明方法可以同时鉴定多个气味结合蛋白基因，大大提高了鉴定气味结合蛋白的效率。同时也为从其他昆虫种类中鉴定气味结合蛋白基因提供了一条更为简便有效的方法。通过对鉴别的气味结合蛋白进行生化特征、蛋白结构、生物功能方面的研究，无疑会有助于阐明昆虫嗅觉的识别机制，同时为利用昆虫的嗅觉来进行害虫的生物防治提供理论上的依据。
图1为苜蓿盲蝽触角RNA电泳图；
图2为SMART技术的原理； 图3为LD-PCR产物电泳图，其中1代表LD-PCR的产物；2代表DNA Marker 2000， 自下向上依次为 100bp, 250bp, 500bp, 750bp, IOOObp, 2000bp ；
图4为CHROMA SPIN-400柱子对ds cDNA按大小进行片段的分离电泳图，其中M代表 Wide Range DNA Marker，自下向上依次为 IOObp, 250bp, 500bp, 750bp, IOOObp, 1500bp, 2000bp，2500bp，3000bp，4000bp，6000bp，泳道 1-16 为按片段大小分离的 ds cDNA ；图5为原始文库滴度的测定；图6为菌液PCR鉴定文库重组率和插入片段的大小，其中M代表DNA Marker 2000，自下向上依次为 100bp，250bp，500bp，750bp，1000bp，2000bp，泳道 1_12 代表随机挑选的单克隆；图7为鉴定的12个“Classical OBI^s”序列比对图，阴影标记的为6个保守的半
胱氨酸；图8为鉴定的两个“Plus-C OBI^s”和其他昆虫的“Plus-C OBI^s”序列比对图，阴
影标记的为6个保守的半胱氨酸和脯氨酸。
具体实施例方式下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式
作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。需特别指出的是，尽管在实施例中详尽描述了在苜蓿盲蝽中鉴定气味结合蛋白的方法，然而这并不意味本发明的方法只限于苜蓿盲蝽这一种昆虫，因此，使用本发明所描述的方法来鉴定其他昆虫种类中的气味结合蛋白基因，均包括在本发明所要求的权利范围之内。实施例1 触角RNA的提取、反转录合成第一链cDNA及LD-PCR合成ds cDNA取刚羽化的苜蓿盲蝽触角200对，利用Trizol法进行RNA的提取，电泳检测RNA质量(见图1)，同时分光光度计测定RNA的浓度为618. 8ng/ μ 1。利用SMART技术和LD-PCR 方法合成第一链cDNA和ds cDNA。最后1. 5%琼脂糖凝胶电泳检测LD-PCR产物的分布。 SMART的原理如图2。LD-PCR产物的电泳图如图3。分析结果表明LD-PCR产物的大小从 200bp-2000bp，分布范围比较广泛，说明产物包括了不同基因的mRNA，其中有几条比较亮的条带，代表了在触角中表达量比较高的基因。实施例2 :Sfi I 酶切 ds cDNA 及 CHROMA SPIN-400 柱子分离 ds CDNA为了将LD-PCR扩增得到的ds cDNA和pDNR-LIB载体(商购)连接，用Sf i I内切酶对ds cDNA进行酶切，同时用CHR0MASPIN-400柱子对ds cDNA按大小进行片段的分离， 分别装在16个无菌离心管中，每管一滴。最后1.5%琼脂糖电泳检测得到的ds cDNA片段的大小分布，如图4，最后根据电泳结果取其中的7，8，9，10四管中的ds cDNA和pDNR-LIB 载体进行连接。实施例3 重组质粒电转化DH5 α大肠杆菌细胞为了得到较高的转化效率，采用电转化。电转化仪为Bio-Rad公司产品，电击参数设置为2000ν，200Ω。电击时间为2-3秒。实施例4 初始化cDNA文库滴度的测定为了评估所建cDNA文库的质量，需要对文库进行滴度测定。方法如下分别取 0. 5μ 1,0. 25 μ 1,0. 05 μ 1,0. 025 μ 1,0. 005 μ 1 原始文库涂于 200 μ 1 LB 平板中，混勻， 37°C共培养IOh左右，待出现单克隆，如图5，计数。
结果为0. 5 μ 1 οο0. 25μ 1 1707 4. 8 X 106plaques/Library0. 05μ 1 2954. 1X 106plaques/Library0. 025 μ 1 1825. O X 106plaques/Library0. 005 μ 1 476. 6 X 106plaques/Library> 2. OOX 106plaques/Library 平均为5. 1 X 106plaques/Library以上结果表明所建文库质量较高，比较有代表性。原始cDNA文库不稳定，并且低丰度cDNA的数量极少，因此对初建成的原始cDNA文库要立即进行扩增，以便长久保存。实施例5 菌液PCR检测插入片段的大小和重组率为了检测文库中单克隆插入片段的大小和文库重组率，利用菌液PCR随机检测 1000个单克隆插入片段的大小。菌液PCR引物序列如下M13-Forward primer (5‘ -3，) TGTAAAACGACGGCCAGT (如 SEQ ID NO. 29 所示)；M13-Reverse primer (5‘ -3，) :AACAGCTATGACCATG (如 SEQ IDN0. 30 所示)；1. 5%琼脂糖电泳检测PCR产物，如图6。结果表明，插入片段都在500bp以上，重组率为98%，表明所建文库质量较高，可以进行下一步分析。实施例6 利用生物信息学方法从cDNA文库中鉴别气味结合蛋白OBI5s基因利用M13引物对从文库中挑选的单克隆进行测序，为了得到基因的全长，测序方向为5’端测序。共计得到EST序列四15个，通过对这些EST序列进行载体序列的剔除，聚类分析，最终得到1423个Unigenes。根据OBI^s蛋白氨基酸序列中都含有6个保守的半胱氨酸的特征，设计程序从1423个Unigenes中鉴定气味结合蛋白基因，同时结合BLASTX和 BLASTN比对结果对鉴定结果进行人工确认。气味结合蛋白OBI^s基因的鉴别程序如下其中“Classical OBPs"的鉴别程序为Cl-X20_66-C2-X3-C3-X21_43-C4-X8_14-C5-X8-C6 ；Cl-X15_39-C2-X3-C3-X21_44-C4-X7_12-C5-X8-C6."Plus-C OBI^s” 的鉴别程序为Cl-X20_41-C2-X3-C3-X41_46-C4-X19_29-C4a-X9-C5-X8-C6-P-X9_10-C6a-X9_10 ；α-Α-Μ-ΟΖ-Α-ΟΒ- ^-^-ΟΑ-Χ^^ΟΑΒ-Χ^Οδ-Χ τΟΘ-Ρ-Χρη-ΟθΒ。最终从苜蓿盲蝽触角cDNA文库中得到14个OBI3s基因，所有的OBI3s基因都为全长，包含有完整的开放阅读框。所有的这14个OBI^s基因的氨基酸的同源性比较见表1。表1 14个OBf3S的氨基酸同源性比较
权利要求
1.一种从昆虫触角中分离鉴定气味结合蛋白基因的方法，其特征在于，包括步骤(1)利用SMART技术获得触角全长CNDA序列；(2)Sfi酶双酶切所述ds cDNA ；(3)利用凝胶层析柱对酶切产物按片段大小进行分离，收集片段长度最长的dscDNA ；(4)步骤(3)的dscDNA和pDNR-LIB载体连接，得重组质粒；(5)所述重组质粒转化ElectroMAXDH5 α -E感受态细胞，得到未扩增的初始化cDNA文库；(6)采用生物信息学的方法从cDNA文库中鉴别气味结合蛋白基因。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(6)中采用生物信息学的方法鉴别气味结合蛋白基因时，其中“Classical OBI^s”的鉴别程序为Cl-Ao-66_C2-X3-C3_X21—43-C4_X8—14-C5_X8-C6 ；Cl_Xi5-39_C2_X3_C3_X2i-44_C4_X7-i2_C5_Xg_C6 ；"Plus-c OBPs"的鉴别程序为Cl-X2o-4i—C2—X3-C3—X41-46—C4—Χ19_29_ -C4a-X9-C5-X8-C6-P-X9_10-C6a-X9_10 ； Cl-X8-4i—C2—X3-C3—X3g_47—C4—X17_2g"—n-C6a。
全文摘要
本发明公开了一种利用SMART技术构建触角cDNA文库和生物信息学方法从苜蓿盲蝽触角中有效分离鉴定气味结合蛋白(Odorant binding proteins，OBPs)基因的方法，利用此方法筛选出了14条苜蓿盲蝽气味结合蛋白基因的核苷酸序列。鉴于气味结合蛋白在昆虫嗅觉识别中的重要作用，本发明所涉及的这些基因可以在昆虫的生物防治中发挥重要的作用。
文档编号C12Q1/68GK102399773SQ20101028547
公开日2012年4月4日 申请日期2010年9月16日 优先权日2010年9月16日
发明者吴孔明, 张永军, 张雪莹, 谷少华, 郭予元 申请人:中国农业科学院植物保护研究所