专利名称：一种添加剂控制的β-琼胶酶高效制备方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，更具体地涉及一种添加剂控制的β -琼胶酶高效制备方法。本发明方法可以显著提高β-琼胶酶的表达量和可溶性，并且制得的蛋白纯度高、稳定性好，可以结晶。
背景技术：
琼胶酶可以从海水、海底沉淀物、海藻、海洋微生物、一些软体动物、淡水以及泥沙等中分离得到。根据其作用方式的不同，可分为两类α-琼胶酶和β-琼胶酶。α-琼胶酶专一性地裂解α-(1，3)连接的琼脂糖，生成以β-D-半乳糖为非还原性末端和以3， 6-内醚- a -L-半乳糖为还原性末端的琼寡糖(agarooligosaccharides)系列；β -琼胶酶专一性地裂解β_(1，4)连接的琼脂糖，生成以β-D-半乳糖为还原性末端和以3，6-内醚-a-L-半乳糖为非还原性末端的新琼寡糖(neoagarooligosaccharides)系列。目前， 琼胶酶在食品工业、医药工业、日用化工、生物工程等许多方面有广泛的应用。AgaB蛋白是一种来源于海洋假别单胞菌CYM (Pseudoalterromonas sp. CY24)的 β-琼胶酶，它是目前已知的催化腔最大的一种琼胶酶，裂解琼脂糖的主要终产物是异头碳构型翻转的新琼八糖、十糖、十二糖和十四糖，比已报道的其他琼胶酶的主要水解产物聚合度都高。高效的制备AgaB蛋白将有助于新琼八糖、十糖、十二糖和十四糖这些市场上紧缺的高聚合度新琼寡糖的生产和制备。然而，本领域尚缺乏高效制备稳定的AgaB蛋白的方法。因此本领域迫切需要开发高效、稳定地生产β-琼胶酶的方法。
发明内容
本发明的目的就是提供一种高效生产β -琼胶酶的方法。在本发明的第一方面，提供了一种生产琼胶酶的方法，包括步骤(a)在适合表达β -琼胶酶的条件且葡萄糖浓度为0. 1-4. Owt%下，培养携带编码 β-琼胶酶的基因的质粒的宿主细胞或染色体中整合有编码β-琼胶酶的基因的宿主细胞工程菌，从而表达出β -琼胶酶；(b)从培养物中分离纯化出β-琼胶酶。在另一优选例中，所述的宿主细胞是大肠杆菌。在另一优选例中，所述的葡萄糖浓度为0. 2-3wt%。在另一优选例中，所述的步骤(a)包括二个阶段(i)培养阶段，其中葡萄糖浓度为0. 2-3wt% ；(ii)诱导阶段，其中葡萄糖浓度为0.2-3wt%，pH为5-8，并且用IPTG举行诱导。在另一优选例中，所述的β -琼胶酶包括海洋假别单胞菌的β -琼胶酶，及其保持 β-琼胶酶生物活性的突变体。在另一优选例中，所述的步骤(b)包括亲和层析、超滤、和/或阴离子交换层析。
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在另一优选例中，所述的步骤(b)包括诱导表达后，收集菌体进行细胞破碎，离心得上清，过镍金属亲和柱获目标蛋白原，TEV(烟草蚀纹病毒)蛋白酶酶切再通过镍金属亲和柱获得重组海洋假别单胞菌β -琼胶酶蛋白，再经阴离子交换层析去杂，浓缩定量，获得纯化的β-琼胶酶。在另一优选例中，还包括步骤将制备的海洋假别单胞菌琼胶酶用于制备蛋白晶体。在另一优选例中，所述的β-琼胶酶的氨基酸序列如SEQ ID NO :1所示，其编码序列如SEQ ID NO 2所示。在另一优选例中，所述的葡萄糖是以选自下组的形式加入葡萄糖、或葡萄糖的可溶性盐。在本发明的第二方面，提供了一种葡萄糖或其可溶性盐的用途，它(们)用作提高发酵培养过程中琼胶酶表达量的添加剂。在本发明的第三方面，提供了一种葡萄糖或其可溶性盐的用途，它(们)用作提高发酵培养过程中β-琼胶酶表达可溶性的添加剂。应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再
--累述。
图1显示了大肠杆菌重组株BL21(DE3)-pSJ2-agaB诱导表达蛋白电泳图；图中， “标”为蛋白 Mark,由上到下依次为 97. 2KDa、66. 4KDa、44. 3KDa、29. 0KDa、20. IKDa0 1 为不加诱导剂IPTG时全菌蛋白电泳图；2、3为37°C下IPTG浓度为1. OmM诱导下的全菌蛋白电泳图。图2显示了不同诱导温度下AgaB蛋白表达电泳图。图中，“标”为蛋白Mark，由上到下依次为97. 2KDa、66. 4KDa、44. 3KDa、29. OKDa0 1为不加诱导剂IPTG时全菌蛋白电泳图； 2为不加诱导剂IPTG时上清蛋白电泳图；3为37°C下0. 4mM IPTG诱导下的全菌蛋白电泳图；4为37°C下0. 4mM IPTG诱导下的上清蛋白电泳图；5为25°C下0. 4mM IPTG诱导下的全菌蛋白电泳图；6为25°C下0. 4mM IPTG诱导下的上清蛋白电泳图；7为16°C下0. 4mMIPTG 诱导下的全菌蛋白电泳图；8为16°C下0.4mM IPTG诱导下的上清蛋白电泳图。图3显示了 16°C不同浓度IPTG诱导AgaB蛋白表达电泳图。图中，“标”为蛋白 Mark,由上到下依次为97. 2KDa、66. 4KDa、44. 3KDa、29. OKDa。1为不加诱导剂IPTG时全菌蛋白电泳图；2为不加诱导剂IPTG时上清蛋白电泳图；3为16°C下O.OlmM IPTG诱导下的全菌蛋白电泳图；4为16°C下O.OlmM IPTG诱导下的上清蛋白电泳图。图4显示了 16°C在葡萄糖浓度下不同浓度IPTG诱导AgaB蛋白表达电泳图。 图中，“标”为蛋白Mark，由上到下依次为97. 2KDa、66. 4KDa、44. 3KDa、29. OKDa。1为不加诱导剂IPTG时全菌蛋白电泳图；2为不加诱导剂IPTG时上清蛋白电泳图；3为16°C下0. OlmM IPTG诱导下的全菌蛋白电泳图；4为16°C下O.OlmM IPTG诱导下的上清蛋白电泳图；5为 16°C下0.05mM IPTG诱导下的全菌蛋白电泳图；6为16°C下0. 05mM IPTG诱导下的上清蛋白电泳图；7为16°C下0. ImM IPTG诱导下的全菌蛋白电泳图；8为16°C下0. ImM IPTG诱导下的上清蛋白电泳图；9为16°C下0.2mM IPTG诱导下的全菌蛋白电泳图；10为16°C下 0. 2mM IPTG诱导下的上清蛋白电泳图；11为16°C下0.5mM IPTG诱导下的全菌蛋白电泳图； 12为16°C下0. 5mM IPTG诱导下的上清蛋白电泳图；13为16°C下1. OmM IPTG诱导下的全菌蛋白电泳图；14为16°C下l.OmM IPTG诱导下的上清蛋白电泳图。图5显示了 16°C不同浓度葡萄糖存在下AgaB蛋白表达电泳图。图中，“标”为蛋白Mark，由上到下依次为97. 2KDa、66. 4KDa、44. 3KDa、29. OKDa0 1为0. 1 %葡萄糖存在下全菌蛋白电泳图；2为0. 葡萄糖存在下上清蛋白电泳图；3为0. 5%葡萄糖存在下全菌蛋白电泳图；4为0.5%葡萄糖存在下上清蛋白电泳图；5为1.0%葡萄糖存在下全菌蛋白电泳图；6为1.0%葡萄糖存在下上清蛋白电泳图；7为2.0%葡萄糖存在下全菌蛋白电泳图； 8为2. 0%葡萄糖存在下上清蛋白电泳图；9为5. 0%葡萄糖存在下全菌蛋白电泳图；10为 5. 0 %葡萄糖存在下上清蛋白电泳图。图6显示了 16°C不同添加剂存在下AgaB蛋白表达电泳图。图中，“标”为蛋白 Mark,由上到下依次为97. 2KDa、66. 4KDa、44. 3KDa、29. OKDa0 1为LB培养基中不加诱导剂 IPTG时上清蛋白电泳图；2为LB培养基中0. ImMIPTG诱导时上清蛋白电泳图；3为含
葡萄糖的LB培养基中0. ImM IPTG诱导时上清蛋白电泳图；4为含乙醇的LB培养基中 0. ImM IPTG诱导时上清蛋白电泳图；5为含蔗糖的LB培养基中0. ImM IPTG诱导时上清蛋白电泳图；6为LB培养基中1. OmM IPTG诱导时上清蛋白电泳图；7为含1 %葡萄糖LB培养基中l.OmM IPTG诱导时上清蛋白电泳图；8为含1 %乙醇的LB培养基中l.OmM IPTG诱导时上清蛋白电泳图；9为含蔗糖的LB培养基中l.OmMIPTG诱导时上清蛋白电泳图。图7显示了经第一根Ni 2+柱纯化后AgaB的12% SDS-PSGE电泳图。图中，“标” 为蛋白 Mark，由上到下依次为 97. 2KDa、66. 4KDa、44. 3KDa、29. OKDa0 泳道 1-8 为 100_200mM 咪唑梯度淋洗后收集到的洗脱液电泳图。图8显示了 TEV酶切后AgaB的12% SDS-PSGE电泳图。图中，“标”为蛋白Mark， 由上到下依次为97. 2KDa、66. 4KDa、44. 3KDa。泳道1为TEV酶切前的蛋白电泳图，泳道2为 TEV酶切后的蛋白电泳图。图9显示了第二根Ni2+柱纯化后AgaB的12% SDS-PSGE电泳图。图中，“标”为蛋白Mark，由上到下依次为97. 2KDa、66. 4KDa、44. 3KDa。泳道1为TEV酶切后蛋白的电泳图，泳道2为第二根Ni2+柱流穿液的蛋白电泳图，泳道3、4为经第二根Ni2+柱Buffer A 洗脱液的蛋白电泳图。图10显示了经阴离子交换柱纯化后AgaB的蛋白12% SDS-PAGE电泳图。图中， “标”为蛋白Mark，由上到下依次为97. 2KDa、66. 4KDa、44. 3KDa、29. OKDa。泳道1_6为经ImL 的HiTrap DEAE柱纯化后收集液的蛋白电泳图。1为经IOOmM NaCl的洗脱液蛋白电泳图； 2为经200mM NaCl的洗脱液蛋白电泳图；3为经300mM NaCl的洗脱液蛋白电泳图；4为经 400mMNaCl的洗脱液蛋白电泳图；5为经500mM NaCl的洗脱液蛋白电泳图；6为经600mM NaCl的洗脱液蛋白电泳图。图11显示了 AgaB蛋白单晶。图12显示了不同单糖作为添加剂对AgaB蛋白表达的影响。图中，“标”为蛋白 Mark,由上到下依次为 116kD、66. 2kD、45. OkD,35. OkD,25. 0kD、18. 4kD、14. 4kD。U 为 LB 培养基中不加诱导剂IPTG时蛋白全菌电泳图；1为含葡萄糖的LB培养基中1. OmM IPTG诱导时蛋白表达电泳图，T为全菌，S为上清；2为含果糖的LB培养基中1. OmM IPTG诱导时蛋白表达电泳图，T为全菌，S为上清；3为含半乳糖的LB培养基中1. OmM IPTG诱导时蛋白表达电泳图，T为全菌，S为上清。图13显示了成熟AgaB蛋白序列(SEQ ID NO 1)。图14显示了 β -琼胶酶基因agaB的核苷酸序列(SEQ ID NO 2)。
具体实施例方式本发明人通过深入而广泛的研究，意外地发现在β-琼胶酶的生产过程中，通过选用特定的添加剂葡萄糖，并控制其浓度处于0.范围内，可以大幅提高β-琼胶酶的表达，并且提高其可溶性。在此基础上完成了本发明。适用于本发明的琼胶酶包括海洋假别单胞菌琼胶酶(包括全长多肽以及成熟)及其保持琼胶酶的生物学活性的突变体。突变体包括琼胶酶的N端或C端缺失、增加或改变1-15个氨基酸，分子内部变更部分氨基酸，但保持β -琼胶酶的生物学活性的突变蛋白。一种优选的β-琼胶酶是具有SEQ IDNO :1所示的氨基酸序列的成熟多肽。适用于本发明的表达β-琼胶酶的宿主细胞，可以是现有的生产β-琼胶酶的工程菌，也可用常规方法构建。宿主细胞可以是原核(如大肠杆菌)或真核(如酵母)，较佳的是大肠杆菌。在构建时，可根据文献报道的琼胶酶的氨基酸序列，全基因合成或天然来源得到β-琼胶酶的cDNA。期间，可以根据不同宿主对不同密码子的偏爱性，选择性突变天然β-琼胶酶的部分碱基(氨基酸序列不变)。用分子克隆的常规方法，在cDNA 5'端与3'端分别引进特异性酶切位点，克隆入表达质粒，转化宿主菌，筛选鉴定，得到工程菌。在获得了表达β-琼胶酶的宿主细胞后，便可在常规的适合表达β-琼胶酶的条件下培养，以表达β-琼胶酶。其中通过添加剂葡萄糖，并控制其浓度处于范围内，便可大幅提高β-琼胶酶的产量并获得高可溶性和稳定的β-琼胶酶。 在本发明中，葡萄糖可以来自葡萄糖、以及水解后产生葡萄糖的物质。当然，优选葡萄糖。在本发明方法中，葡萄糖的浓度通常为0. 1-4. Owt %，较佳的为0. 2-3wt %，更佳的为 0. 3-2wt%0用于本发明的培养基没有特别限制，可以是各种常规的培养基。例如对于大肠杆菌而已，代表性的培养基包括(但并不限于)LB、2YT培养液等。另一方面，本发明还对发酵条件进行了进一步优化1.温度的控制β-琼胶酶的发酵温度宜保持在33-39°C，较佳地为37 士 2°C，诱导温度保持在16-20°C。2.诱导期的PH值pH通常为pH6_8。在本发明中，对于表达的琼胶酶，可以用常规方法进行纯化。一种优选方法是对发酵样品以离心、过滤等方式去除菌体，获得含目的蛋白质琼胶酶的发酵清液。然后，对发酵清液通过盐析、超滤等方法进行初步纯化后再进行层析纯化，也可直接进行层析纯化。代表性的层析技术包括(但并不限于)阳离子交换层析、阴离子交换层析、凝胶过滤层析。
用本发明方法，可得到β -琼胶酶纯品，纯化得率85%以上，纯度95%以上，纯品得率约27mg/L发酵液。在本发明的一个实例中，发酵生产海洋假别单胞菌β-琼胶酶蛋白的工艺流程如下挑选单菌落基因工程菌，进行种子液和放大培养(含用于控制表达的添加剂)，诱导表达，收集菌体进行细胞破碎，离心得上清，过镍金属亲和柱获目标蛋白原，TEV(烟草蚀纹病毒)蛋白酶酶切再通过镍金属亲和柱获得重组海洋假别单胞菌琼胶酶蛋白，再经阴离子交换层析去杂，浓缩定量，分装后将蛋白冻存于-80°C以备用。本发明的主要优点在于(a)重组蛋白不仅表达量高，而且表达可溶性也显著提高，可达到95%以上；(b)建立了一条简洁、高效的琼胶酶分离纯化和结晶技术路线，目的蛋白稳定性好、纯度达到95%以上。本发明方法避免了采用繁锁的包涵体变复性工艺。(c)本发明方法可以大量、廉价地生产β -琼胶酶。下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人《分子克隆实验室手册》(NewYork =Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则份数和百分比按重量计。实施例1 β -琼胶酶基因agaB的制备根据对全长CYM-AgaB的信号肽序列的分析，设计和合成一对用于PCR扩增成熟 AgaB蛋白(氨基酸39-478，见图13)编码基因的引物AgaB-5p :GACTGGATCCGCTAACTATACGGCCAGCAATGC (SEQ ID NO :3)AgaB-3p :GGGTCTCGAGCTATTGGCAAGTATAACCTGACACAACG (SEQ ID NO :4)以 pET_24a(+)-agaB 质粒(获自中国海洋大学；Ma C.，et al. J BiolChem. 2007， 282 :3747-54.)为模板，进行PCR反应。PCR反应组成如下10 X PCR缓冲液10 μ L
dNTP混合液GmM)10 μ L
ddH20 73 μ L
AgaB-5p(40 μ M)2μ L
AgaB-3p(40 μ Μ)2μ L
Taq DNA 聚合酶(5u/ μ L)1 μ L
pET-24a (+)-agaB(0. 2 μ Μ)2μ L
总计100 μ L
反应条件为
权利要求
1.一种生产β-琼胶酶的方法，其特征在于，它包括步骤(a)在适合表达琼胶酶的条件且葡萄糖浓度为0.l-4.0wt%下，培养携带编码 β-琼胶酶的基因的质粒的宿主细胞或染色体中整合有编码β-琼胶酶的基因的宿主细胞工程菌，从而表达出β -琼胶酶；(b)从培养物中分离纯化出琼胶酶。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的宿主细胞是大肠杆菌。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的葡萄糖浓度为0.2-3wt%。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步骤(a)包括二个阶段(i)培养阶段，其中葡萄糖浓度为0. 2-3wt% ；( )诱导阶段，其中葡萄糖浓度为0. 2-3wt%，pH为5-8，并且用IPTG举行诱导。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的琼胶酶包括海洋假别单胞菌的 β -琼胶酶，及其保持β -琼胶酶生物活性的突变体。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步骤(b)包括亲和层析、超滤、和/或阴离子交换层析。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的β-琼胶酶的氨基酸序列如SEQ ID NO 1所示，其编码序列如SEQ ID NO 2所示。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的葡萄糖是以选自下组的形式加入葡萄糖、或葡萄糖的可溶性盐。
9.一种葡萄糖或其可溶性盐的用途，其特征在于，用作提高发酵培养过程中琼胶酶表达量的添加剂。
10.一种葡萄糖或其可溶性盐的用途，其特征在于，用作提高发酵培养过程中β-琼胶酶表达可溶性的添加剂。
全文摘要
本发明提供了一种添加剂控制的β-琼胶酶高效制备方法。具体地，本发明提供一种生产β-琼胶酶的方法，包括步骤(a)在适合表达β-琼胶酶的条件且葡萄糖浓度为0.1-4.0wt％下，培养携带编码β-琼胶酶的基因的质粒的宿主细胞或染色体中整合有编码β-琼胶酶的基因的宿主细胞，从而表达出β-琼胶酶；(b)从培养物中分离纯化出β-琼胶酶。本发明方法可大幅提高β-琼胶酶的表达量和可溶性。
文档编号C12R1/19GK102399765SQ20101028510
公开日2012年4月4日 申请日期2010年9月17日 优先权日2010年9月17日
发明者任艾明, 周佳海 申请人:中国科学院上海有机化学研究所