专利名称：人乳头瘤病毒16和18型l1蛋白在昆虫细胞中的表达及应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，且涉及人乳头瘤病毒16和18型Ll蛋白在昆虫细胞中的表达及其疫苗制备方法。
背景技术：
世界卫生组织(WHO)的统计资料表明，宫颈癌是严重危害妇女健康的侵染性疾病，其发病率仅次于乳腺癌，居全世界女性恶性肿瘤第二位，在一些发展中国家甚至居于首位。宫颈癌是最常见的妇科恶性肿瘤之一，全球每年约有50万名妇女罹患宫颈癌，且有将近30万名妇女死于宫颈癌，其中，80%的死亡病例发生在发展中国家。据不完全统计，我国现有宫颈癌病人约13. 8万，每年约有5万人死于宫颈癌，且发病率呈逐年上升、年轻化的趋势。在1995年，WHO已将人乳头瘤病毒(human papillomavirus,HPV)的感染确定为宫颈癌的致病病因。几乎所有的宫颈癌都由HPV引起，其中高达99. 7%的宫颈癌患者都存在HPV 感染，且超过2/3的宫颈癌病例由HPV 16型和18型引起。人乳头瘤病毒(Human papillomavirus，HPV)是一种嗜上皮性病毒，其具有高度的特异性。HPV是一组病毒的总称，其组成一个科，其中各病毒的形态类似，但DNA限制性内切酶图谱不同，核壳体蛋白质的抗原性不同。目前已经确定的HPV型别大约有160余种，依其感染的上皮所在的部位分为皮肤型HPV和生殖道上皮HPV，其中大约35种型别可感染妇女生殖道，大约20种与肿瘤相关。依据HPV导致肿瘤的危险性的高低，将HPV分为低危险型别HPV和高危险型别HPV。低危险型别HPV包括HPV6、11、42、43、44等型别，其通常引起外生殖器湿疣等良性病变，包括宫颈上皮内低度病变(CINI)。高危险型别HPV包括HPV16、 18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68 等型别。高危险型别 HPV，特别是 HPV16 和 18 型， 与宫颈癌及宫颈上皮内瘤变(CIN II/III)的发生相关。近十几年来，HPV疫苗研究可以分为两类，即预防性疫苗研究和治疗性疫苗研究。 预防性疫苗一般以HPV16主要衣壳蛋白Ll和次要衣壳蛋白L2为靶抗原，其作用在于诱发机体产生特异性的中和抗体和有效的局部免疫应答，以阻止HPV的长期感染和再感染。HPV 的衣壳蛋白在真核以及原核表达系统中表达时，能自我装配或形成病毒样颗粒(VLP)，其结构和抗原表位与天然的病毒颗粒十分相似。VLP能与细胞受体结合并进入细胞，从而有利于抗原的加工呈递以及诱发较强的细胞免疫。治疗性疫苗通常是以经修饰的HPV16早期蛋白(其转化活性被去除，但仍保留抗原性)作为靶抗原，它可诱导特异性的细胞免疫应答， 从而可用于控制或消除感染HPV的良性和恶性病灶，并可作为这类疾病的手术后的辅助治疗。在大多数与HPV16相关的宫颈癌及其癌前病变中，HPV16的E6和E7蛋白持续表达，而这种持续表达是肿瘤细胞转化和维持恶性特征所必需的，并且正常组织中不存在这两种蛋白。因此，E6和E7蛋白为用于HPV16相关宫颈癌及癌前病变的治疗性疫苗的理想靶抗原。 针对中晚期宫颈癌病人手术后残留的肿瘤细胞，可应用这种治疗性疫苗，以通过激发病人的细胞免疫来杀伤、清除这些肿瘤细胞和已感染的上皮细胞，从而防止或限制肿瘤的复发和扩散。预防性和治疗性HPV疫苗的作用也有交叉。例如，在良性疣和轻度CIN病变中存在HPV晚期蛋白的表达，因此，预防性疫苗对这些疾病也有一定治疗作用。近年来研制的一些疫苗，如嵌合性疫苗、HPV假病毒疫苗等，同时具备预防和治疗双重作用。HPV疫苗在预防导致宫颈癌的持续性感染方面，有效率达到100%，它能将宫颈癌发生率降低75%，安全性好。目前国际上已有多个HPV16候选疫苗进入I/II期临床试验， 这种疫苗将会拯救成千上万的妇女的生命，因此对妇女的健康产生重大影响。默克公司于1991年从澳大利亚CSL公司获得专利授权，通过使用酿酒酵母表达， 制备了针对HPV 6、11、16和18型的四价HPV疫苗。而葛兰素史克公司的HPV疫苗技术来源于Medlmmune公司，该疫苗为2价疫苗，商品名为“Cervarix”(预防16、18型)，其使用昆虫细胞进行表达。这两种疫苗均可以迅速使受试动物产生对HPV病毒的中和抗体，并且对人畜安全，能够有效预防治疗HPV病毒所导致的各种疾病，特别是梅毒和宫颈癌。这些技术已在国际权威专业杂志上公开发表、部分内容已经获得美国等多个国家专利保护。瑞士洛桑大学研究人员最近研究出一种治疗宫颈癌的喷雾剂疫苗，其效果与注射疫苗相同。通过吸入该喷雾剂疫苗，可以刺激并产生针对这种病毒的抗体，其效果与注射疫苗一样。这种喷雾剂使用方便，疗程短。病人只需使用两次，其间间隔2周，而注射疫苗需要注射3次，并且耗时6个月。2004年还报道，一种基于7种人乳头瘤病毒(HPV)的有效疫苗可以预防全球的多数宫颈癌。然而，它的费用很高，而且针对一些不太常见的HPV亚型，其提供的保护作用也很难清楚地证实。考虑到成本问题，针对2种(HPV16U8)或3种(HPV16、18和45)最常见亚型的疫苗可能更便宜，也更现实。特别地，抗HPV16和HPV18的疫苗非常有意义，因为其可以预防70%的宫颈癌。为此，本发明基于我国流行的高致病性HPV16/18型毒株的Ll蛋白氨基酸序列，开发了新的HPV16/18 二价疫苗的制备方法，其对于大规模生产HPV16/18 二价疫苗以及对于我国妇女的宫颈癌预防具有重要的现实意义。
发明内容
人乳头状瘤病毒的主要衣壳蛋白Ll基因在原核和真核表达后能够自我装配或形成病毒样颗粒(VLP)，从而能与细胞受体结合诱发细胞免疫。因此，Ll蛋白是预防宫颈癌的最有价值的靶抗原。本发明以我国流行的高致病性HPV 16和18两种亚型的主要衣壳蛋白 Ll基因作为研究对象，开发了新的HPV16/18 二价疫苗的制备方法。利用该方法，本发明实现了 HPV 16和HPV 18的主要衣壳蛋白Ll的高表达，并且获得了生物学性状较好的VLP，其具有优良的抗原性和免疫原性，对于大规模生产HPV16/18 二价疫苗以及对于我国妇女的宫颈癌预防有重要的现实意义。因此，在一个方面，本发明提供了制备针对人乳头瘤病毒HPV16和HPV18的二价疫苗的方法，其包括以下步骤1)分别优化HPV16和HPV18的Ll蛋白的基因序列；2)将步骤1)中优化后的基因序列分别克隆入杆状病毒表达载体，以获得重组质粒；3)用所述重组质粒，与相应的杆状病毒基因组一起，分别转染昆虫细胞，以获得重组杆状病毒；4)用所述重组杆状病毒分别感染新鲜培养的昆虫细胞；5)从步骤4)的昆虫细胞分别分离纯化HPV16和HPV18的Ll蛋白，并将其与佐剂混合制备成二价疫苗。在一个优选实施方案中，HPV16和HPV18的Ll蛋白的优化后的基因序列分别如SEQ ID NO. 1和2所示。在一个优选实施方案中，本发明的方法所使用的杆状病毒表达载体是PAcSG2，所使用的杆状病毒基因组是杆状病毒基因组AcNPV。在一个优选实施方案中，本发明的方法所使用的昆虫细胞选自Sf-9细胞、Sf-21 细胞和High Five细胞。在一个优选实施方案中，本发明的方法将分离纯化的HPV16和HPV18的Ll蛋白吸附至佐剂上，以制备二价疫苗。在一个优选实施方案中，本发明的方法所使用的佐剂优选选自氢氧化铝佐剂和磷酸铝佐剂。在一个方面，本发明提供了分离的核酸分子，其包含HPV16和HPV18的Ll蛋白的优化后的基因序列。优选，本发明的分离的核酸分子包含SEQ ID NO. 1或2所示的序列。在一个方面，本发明提供了包含本发明的分离的核酸分子的载体。优选，本发明的载体是表达载体。在一个优选实施方案中，本发明的载体适合于在昆虫细胞例如Sf-9细胞、Sf-21细胞或High Five细胞等中表达，其优选是杆状病毒表达载体，更优选是pAcSG2。在一个方面，本发明提供了包含本发明的分离的核酸分子或载体的细胞。在一个优选实施方案中，本发明的细胞是昆虫细胞，优选Sf-9细胞、Sf-21细胞或High Five细胞。在一个方面，还提供了本发明的分离的核酸分子用于制备二价疫苗的用途，所述二价疫苗用于预防HPV16和HPV18的感染。在一个方面，还提供了本发明的分离的核酸分子用于制备HPV16和HPV18的Ll蛋白的用途。发明的有益效果与现有技术相比，本发明的技术方案具有以下有益效果(1)所制备的疫苗针对我国流行的高致病性HPV16/18型毒株的Ll蛋白氨基酸序列，有助于对我国妇女的宫颈癌预防；(2)在疫苗的制备过程中，对HPV16/18L1蛋白的基因序列进行了优化，有助于提高Ll蛋白在昆虫细胞中的表达水平，从而对于大规模生产HPV16/18 二价疫苗以及对于HPV 疫苗的临床应用具有重要的现实意义。下面将结合附图和实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将理解，下列附图和实施例仅用于说明本发明，而不是对本发明的范围的限定。根据附图和优选实施方案的下列详细描述，本发明的各种目的和有利方面对于本领域技术人员来说将变得显然。附图概述
图1显示pVL16-Ll和pVL18_Ll的双酶切鉴定。其中，泳道1为DNA分子量标准； 泳道2为pVL16-Ll的Β ο I和Nco I双酶切产物；泳道3为pVL18_Ll的Β ο I和Nco I 双酶切产物。
图2显示重组病毒的PCR扩增产物的酶切鉴定。其中，泳道1为DNA分子量标准； 泳道2为rBV16的基因组PCR扩增产物；泳道3为rBV18的基因组PCR扩增产物。图3显示rBV16表达的HPV16 Ll蛋白的SDS-PAGE鉴定。其中，泳道1为Sf_9细胞裂解液对照；泳道2和3均为rBV16感染的Sf_9细胞的裂解液；泳道4为蛋白分子量标准。图4显示rBV18表达的HPV18 Ll蛋白的SDS-PAGE鉴定。其中，泳道1为Sf_9细胞裂解液对照；泳道2、3、4和5均为rBV18感染的Sf_9细胞的裂解液；泳道6为蛋白分子
量标准。图5显示纯化的HPV16/18 Ll蛋白的SDS-PAGE鉴定。其中，泳道1为蛋白分子量标准；泳道2为纯化的HPV16 Ll蛋白；泳道3为纯化的HPV18 Ll蛋白。图6是HPV16/18 Ll的透射电镜照片。其中，图6A显示HPV16 Ll的VLP ；图B显示 HPV18 Ll 的 VLP。图7显示HPV16/18 Ll蛋白的Western印迹鉴定。其中，泳道1为蛋白分子量标准；泳道2为HPV16 Ll蛋白；泳道3为Sf_9细胞对照；泳道4为HPV18 Ll蛋白；泳道5为 Sf-9细胞对照。图8显示制备的假病毒感染细胞后的细胞内荧光。
具体实施例方式现参照下列意在举例说明但不限定本发明的实施例来描述本发明。实施例1. HPV16/18的Ll蛋白的基因序列的优化我国流行的高致病性HPV16和HPV18型毒株的Ll蛋白的氨基酸序列分别如SEQ ID NO. 7和8所示。使用市售可得的软件OptimumGene 对HPV16和HPV18型的Ll基因序列进行优化，以提高Ll基因在昆虫细胞中的表达水平。其中，优化后的HPV16 Ll基因序列如SEQ ID NO. 1所示；优化后的HPV18 Ll基因序列如SEQ ID NO. 2所示。实施例2. PVL16-L1和pVL18_Ll转染质粒的构建利用引物对5' -CTC GAG GAA TTC AGG ATG CAA GTG ACG TTTATT-3 ‘ (SEQ ID NO. 3)禾口 5' -A GAG CTC CCA TGG AGG TTA CM CTTGCG TTT CTT-3 ‘ (SEQ ID N0. 4)，以及引物对 5' -CTC GAG GAA TTCAGG ATG TGC TTG TAC ACG CGC-3 ‘ (SEQ ID N0. 5)禾口 5' -A GAG CTCCCA TGG AGG TTA TTT GCG AGC TCT CAC G_3' (SEQ ID NO. 6)，通过PCR分别扩增人工合成的经优化的HPV16型和HPV18型Ll基因。PCR反应条件为95°C预变性5分钟；30 个循环的95°C变性30秒，55°C退火45秒，72°C延伸2分钟；最后72°C延伸10分钟。PCR扩增后，获得两端分别带有》ιο I和Nco I限制性内切酶酶切位点的Ll基因片段。使用商购可得的Bio I和Nco I (例如购自宝生物工程(大连)有限公司)对Ll 基因片段和杆状病毒载体pAcSG2 (来源于美国BD公司的试剂盒，BD BacuIoGoId , 560129) 分别进行双酶切，于37°C进行3小时(IygW Ll基因片段或pAcSG2载体，加入IOU Xho I 和lOUNco I)。将酶切后的Ll基因片段分别插入到同样经过Β ο I和NcoI酶切的杆状病毒载体pAcSG2中。连接的反应体系为L1基因片段100yg，pAcSG2载体150yg，T4DNA连接酶IU ；反应条件为16°C连接过夜。用连接后的载体分别转化大肠杆菌(E. coli)，然后经克隆筛选、增菌培养和质粒抽提获得包含目的基因片段的转染质粒。所获得的转染质粒通过Xho I和Nco I双酶切进行鉴定。如图1所示，获得了包含目的基因片段的重组质粒HPV16Ll_pAcSG2 (简称 PVL16-L1)和 HPV18Ll-pAcSG2 (简称 pVL18_Ll)。实施例3.重组杆状病毒的制备将pVL16-Ll和pVL18_Ll重组质粒分别与AcNPV基因组DNA(来源于美国BD公司的试剂盒，BD BaculoGold , 560129) 一起共转染Sf_9细胞(购买自美国hvitrogen公司)。在27°C下培养4天后，在镜下观察到转染后的细胞体积增大。培养5天后，收集细胞培养上清液(其中分别含有重组病毒rBV16和rBV18)。将细胞上清液分别接种到新鲜培养的 Sf-9细胞，在27°C下培养3天。取培养上清液再传代一次。之后，取培养上清液，加入等体积的2X沉淀液(含20% PEG6000UM NaCl)，在4°C混合过夜。然后在4°C下，以13000rpm 将混合物离心30分钟，并弃去上清液。所得的沉淀用100 μ 1无菌水重悬浮，并加入5U蛋白酶K，在50°C消化过夜。向消化物中加入等体积的酚/氯仿，振荡混和，并以13000rpm离心10分钟；取上清液，加入等体积的氯仿，振荡混和，再次以13000rpm离心10分钟；取上清液，加入1/10体积的3M NaAc和0.6X的异丙醇，并于_20°C放置15分钟。然后在4°C 下以13000rpm离心10分钟，并弃去上清液。所得的沉淀用预冷的70%乙醇洗涤2次，然后在室温下干燥10分钟。干燥后，沉淀用50 μ 1无菌水悬浮，从而获得重组病毒rBV16和 rBV18的基因组。取5 μ 1重组病毒基因组，并分别用特异性引物对SEQ ID NO. 3和SEQ ID NO. 4，以及SEQ ID N0. 5和SEQ ID N0. 6进行PCR鉴定。PCR反应条件如下95°C预变性5 分钟；30个循环的95°C变性30秒，55°C退火45秒，72°C延伸2分钟；最后72°C延伸10分钟。PCR鉴定的结果表明，重组病毒rBV16和rBV18的基因组中分别含有大小为1600bp的 HPV16 Ll和大小为1700bp的HPV18 Ll的目的片段(参见图2)。收集被感染的Sf-9细胞，加入细胞裂解液(50mmol/L Tris-HCl (pH8. 0) ； 15mmol/ L NaCl ；0. lmmol/L PMSF ；0. 1% NP40 ；5mmol/LEDTA)进行裂解。将 100 μ 1 细胞裂解物和 100 μ 1 2Χ 蛋白上样缓冲液(IOOmmol/L Tris HCl (ρΗ 6.8) ；200mmol/L DTT ；8 % SDS ； 0. 02%考马斯亮蓝R-250 甘油)混合，并沸水浴10分钟。然后取10 μ 1样品在10%聚丙烯酰胺凝胶上进行SDS-PAGE电泳，并进行考马斯亮兰染色，以检测目的蛋白是否表达。 结果显示，重组病毒rBV16和rBV18分别表达分子量为59. 4KD的HPV16 Ll蛋白和分子量为63. 7KD的HPV18 Ll蛋白(参见图3和4)。进一步通过软件Quatity 0ne(Bio_Rad公司)进行分析，结果表明，表达的HPV16 Ll蛋白占全部Sf-9细胞总蛋白的9. 8% (参见图 3)，表达的HPV18 Ll蛋白占全部Sf-9细胞总蛋白的6. 5% (参见图4)。实施例4. HPV16/18 Ll蛋白的分离纯化向培养96小时的感染重组杆状病毒的昆虫细胞中加入细胞裂解液(50mmol/L Tris-HCl (pH8. 0) ； 15mmol/L NaCl ；0. lmmol/L PMSF ；0. 1% NP40 ；5mmol/L EDTA)，超声波破碎细胞，并于4°C以IOOOOg离心15分钟，去除细胞碎片。以IOOOOOg 4°C离心上清液90 分钟。将所得的沉淀重悬于缓冲液A(50mM Tris,ρΗ 8.0 ；IM NaCl ；IOmMMgCl2 ；IOmM CaCl2 ； 2mM PMSF ； 10ug/ml Leupeptin)中，然后加入5. 2克的固体CsCl，并用缓冲液A将体积调整到13ml (CsCl终浓度为0. 4g/ml)，进一步以IOOOOOg 4°C离心22小时，得到经纯化的HPV16 和HPV18 Ll蛋白。所得的蛋白通过SDS-PAGE进行鉴定，结果示于图5中。
也可通过蔗糖密度梯度离心纯化HPV16和HPV18L1蛋白。重组蛋白带出现在 50-60%的蔗糖密度梯度上。具体的纯化方法如下将上清液铺于30%的蔗糖溶液(溶于 TBS中)上，以150000g，4°C离心6小时；获得的沉淀用50mM Tris-IOOmM NaCl重悬浮，并铺于20% -60%的蔗糖密度梯度溶液(溶于50mM Tris-IOOmM NaCl中)上，以150000g， 4°C离心22小时；吸出目的灰白区带，并用缓冲液A稀释，然后通过100000g，4°C离心90分钟来沉淀纯化的HPV16/18 Ll蛋白。实施例5. HPV16/18 Ll蛋白的形杰观察取经纯化的HPV16/18 Ll蛋白液，滴铜网，用2%磷钨酸染色，并通过透射电镜进行观察。结果表明，HPV16/18 Ll蛋白呈现为病毒样颗粒(Virus-like particles，VLP)，其直径约为52nm(参见图6)。实施例6.通过Western印迹来检测重组HPV16/18 Ll蛋白分别使用抗HPV16 Ll 抗体(来源于 SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY 公司，sc-18052) 和抗HPV18L1抗体(来源于abeam公司，ab31492)，通过^festern印迹来检测纯化后的HPV16 和HPV18 Ll蛋白。Western印迹结果显示，分子量为59. 4KD的HPV16 Ll和分子量为63. 7KD 的HPV18 Ll蛋白的特异性蛋白带(参见图7)，这表明所表达的HPV16和HPV18 Ll蛋白具有良好的抗原性。实施例7.用重组HPV16/18 Ll蛋白免疫动物用Bio-Rad Protein Assay试剂盒定量纯化的HPV16和HPV18 Ll蛋白。分别将 0. lyg、2yg或20yg的HPV16 Ll蛋白和HPV18 Ll蛋白吸附至0. 5mg Al (OH)3，以制备成三种剂量的HPV 二价疫苗。使用制备的HPV 二价疫苗，分别于0、2、4周通过肌肉注射来免疫Balb/c小鼠三次。最后一次免疫后三天，处死小鼠，并收集血清。实施例8. HPV16/18假病毒颗粒的制备分别将HPV16 和 HPV18 的 Ll 和 L2 基因(HPV16 L2 的 GeneBank 登录号 AF084952， HPV18 L2 的 GeneBank 登录号 DQ003068)克隆入 pcDNA3. 1 载体(购自 hvitrogen 公司)，以构建 pcDNA3. 1-16L1、pcDNA3. 1-16L2、pcDNA3. 1-18L1 和 pcDNA3. 1-18L2 重组载体。将pcDNA3. 1-16L1和pcDNA3. 1-16L2共转染细胞(购买于美国ATCC)；将 pcDNA3. 1-18L1和pcDNA3. 1-18L2共转染细胞。所得的细胞在37°C培养3-5天。收获细胞并反复冻融三次，进行氯仿抽提，并收集上清液。所得的上清液即为HPV16假病毒 (pseudovirus 16，psV16)和 HPV18 假病毒(pseudovirus 18，psV18)颗粒，冻存备用。在 96孔板培养的细胞上对制备的假病毒psV16和psV18进行滴度测定。简言之，取假病毒种子液进行10倍系列稀释，每个稀释度接种8个培养孔；接种后的细胞在37°C培养5 天，然后于荧光显微镜下观察每个培养孔的细胞内的荧光(参见图8)，计算假病毒的滴度。实施例9. HPV16/18 Ll蛋白的免疫原性分析用纯化的HPV16/18 Ll蛋白(于碳酸盐缓冲液中)过夜4°C包被96孔板。然后用PBST (PBS溶液+0. 5% Tween-20)溶液洗涤板三次，加入PBS稀释的小鼠血清，37°C孵育 1小时。孵育后，用PBST溶液洗涤板三次，加入HRP标记的抗小鼠IgG抗体(购买于KPL 公司)，37°C孵育1小时。孵育后，用PBST溶液洗涤板三次，加入OPD底物显色液(柠檬酸 0. 51%, Na2HPO4 ‘ 12H20 1.84%，邻苯二胺(OPD)0. 05%，Η2&50 μ 1)，避光显色 10 分钟。之后用2Ν H2SO4终止反应，并用酶标仪(BI0-RAD公司)测定492nm处的OD值。结果显示，HPV16/18 Ll蛋白可以诱导机体产生特异性抗体，这表明重组HPV16/18 Ll蛋白具有良好的免疫原性(参见表1)。将小鼠血清按1 500稀释，将稀释液分别与100PFU的假病毒psV16和psV18混和，并在37°C温育1小时。温育后，将假病毒加入到单层的细胞上，并在37°C吸附1 小时。吸附后，于37°C继续培养细胞7天。最后，通过荧光显微镜观察细胞内的荧光。结果显示，抗HPV16/18 Ll蛋白的小鼠血清可以与假病毒psV16和psV18结合，并抑制假病毒进入细胞内产生荧光，这表明小鼠血清中含有抗HPV16/18 Ll蛋白的中和抗体，其能够保护机体免受HPV16/18型病毒的感染(参见表2)。表1. HPV16 Ll疫苗的免疫原性测定
权利要求
1.制备针对人乳头瘤病毒HPV16和HPV18的二价疫苗的方法，其包括以下步骤1)分别优化HPV16和HPV18的Ll蛋白的基因序列，优选HPV16和HPV18的Ll蛋白的优化后的基因序列分别如SEQ ID NO. 1和2所示；2)将步骤1)中优化后的基因序列分别克隆入杆状病毒表达载体，以获得重组质粒，优选所述杆状病毒表达载体是pAcSG2 ；3)用所述重组质粒，与相应的杆状病毒基因组一起，分别转染昆虫细胞，以获得重组杆状病毒，优选所述杆状病毒基因组是杆状病毒基因组AcNPV，所述昆虫细胞优选选自Sf-9 细胞、Sf-21细胞和High Five细胞；4)用所述重组杆状病毒分别感染新鲜培养的昆虫细胞；5)从步骤4)的昆虫细胞分别分离纯化HPV16和HPV18的Ll蛋白，并将其与佐剂混合制备成二价疫苗，所述佐剂优选选自氢氧化铝佐剂和磷酸铝佐剂。
2.分离的核酸分子，其序列如SEQID NO. 1所示。
3.分离的核酸分子，其序列如SEQID NO. 2所示。
4.含有权利要求2或3的核酸分子的载体，所述载体优选是表达载体，更优选是杆状病毒表达载体，更优选是pAcSG2。
5.含有权利要求4的载体的细胞，所述细胞优选是昆虫细胞，更优选是Sf-9细胞、 Sf-21细胞或High Five细胞。
6.权利要求2和/或3的核酸分子用于制备二价疫苗的用途，所述二价疫苗用于预防 HPV16和HPV18的感染。
7.权利要求2的核酸分子用于制备HPV16的Ll蛋白的用途。
8.权利要求3的核酸分子用于制备HPV18的Ll蛋白的用途。
全文摘要
本发明提供了制备针对人乳头瘤病毒HPV16和HPV18的二价疫苗的方法，其包括下列步骤优化HPV16和HPV18的L1蛋白的基因序列；将优化后的基因序列克隆入杆状病毒表达载体并转染昆虫细胞，以获得重组的杆状病毒；用所述杆状病毒感染昆虫细胞；回收和纯化表达的HPV16和HPV18的L1蛋白，并将其与佐剂混和制备成二价疫苗。本发明还提供了经优化的HPV16和HPV18的L1蛋白的基因序列，含有此类基因序列的载体，以及含有此类载体的细胞。
文档编号C12N15/866GK102178944SQ201010284969
公开日2011年9月14日 申请日期2010年9月17日 优先权日2010年9月17日
发明者周蕾, 周长民, 张千, 李卫东, 李春明, 段广宇, 王敏文, 王玉峰, 王飞宇, 聂飞, 郭文军, 闫昆明, 高伟星 申请人:大连雅立峰生物制药有限公司