用于检测人乳头瘤病毒的遗传标记的制作方法
【专利说明】用于检测人乳头瘤病毒的遗传标记 本申请是申请号为"200980153183. 8"，申请日为"2009年10月26日"，发明名称为"用 于检测人乳头瘤病毒的遗传标记"的申请的分案申请。 相关申请
[0001] 本申请要求于2008年10月31日提交的美国临时申请号61/197, 850的优先权和 利益。该申请的内容整体引入本文作为参考。 发明领域
[0002] 本发明涉及医学和分子生物学领域。更具体而言，本发明涉及乳头瘤病毒基因组 的El基因片段作为用于鉴别诊断的特异性标记的用途，其通过对照低危配对物检测最常 见的高危HPV基因型来实现。 发明背景
[0003] 根据最近的全球估计，每年在女性中发生493, 000个子宫颈癌新病例，并且每年 274, 000个女性死于该疾病（Jacques Ferlay等人，2002, GL0B0CAN)。因为该疾病在多年期 间进展，所以估计全世界140万女性伴随子宫颈癌生活，并且全世界2-5倍或最高达7百万 女性可能具有需要鉴定且治疗的癌前状况（Ferlay等人2002, GL0B0CAN ;Bosch等人2002， J Clin Pathol. 55:244-265)。有效筛选和治疗策略的缺乏是与发达国家相比在发展中国 家显著更高的子宫颈癌比率的主要原因。
[0004] 筛选努力在很大程度上依赖于巴氏涂片（Pap smear)，在20世纪四十年代开发的 实验室测试，以检测异常子宫颈细胞。该测试已在提供定期、高品质筛选的工业化国家中 达到巨大成功。但巴氏涂片程序是运行复杂且昂贵的，并且未能在其中健康系统和基础设 施薄弱的发展中国家延伸至显著比例的女性。重要的是，在一些国家中，由于文化限制，女 性不执行或不同意巴氏涂片程序。此外，存在与巴氏涂片测试相关的分析问题。巴氏涂片 不检测子宫颈发育不良或恶化前的所有病例。对于指导医生作出医学建议的测试的假阴 性的目前可接受比率是约5-10%，但近期研究暗示巴氏涂片的实际比率可能高得多（Nanda K.等人，2000，Ann Intern Med. 132:810-819 ;Kulasingam S.等人，2002，JAMA. 288: 1749-1757)。巴氏涂片将约7-8%病例定义为不明意义的非典型鳞状上皮细胞（AS⑶S)。在 另外20-30%病例中，由于炎症细胞的存在，巴氏涂片可能不足以解释。目前，为了克服与巴 氏涂片测试相关的缺点，正在进行更多研究以用于开发分析上更可靠的新测定用于早期检 测女性中的子宫颈恶化前状况。基于在子宫颈的一致HPV感染和侵袭性子宫颈癌发展之间 普遍公认的联系的方法之一涉及病毒的检测。 发明概述
[0005] 本发明提供了鉴别检测高危型HPV的组合物和方法。具体地，新近鉴定的HPV基 因组片段用作标记用于高危型病毒的这种鉴别检测。靶向这种标记片段的寡核苷酸引物和 探针组合物用于检测临床样品例如尿中的高危HPV。
[0006] 具体地，本发明提供了包括关于人乳头瘤病毒（HPV)的分离的遗传标记的组合 物，所述遗传标记包括由 SEQ ID NO :69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、 84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96或97编码的序列。可替代或另外地，本发明 提供了包括SEQ ID NO :69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、 88、89、90、91、92、93、94、95、96或97的互补序列的组合物。在优选方面，本发明提供了包 括关于高危人乳头瘤病毒（HPV)的分离的遗传标记的组合物，所述遗传标记包含由SEQ ID NO :69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84 或 85 编码的序列。
[0007] 本发明进一步提供了包括由 SEQ ID NO :1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14 或 15的序列编码的寡核苷酸的组合物。可替代或另外地，本发明提供了包括SEQ ID NO :1、2、 3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15的互补序列的组合物。
[0008] 此外，本发明提供了包括关于人乳头瘤病毒（HPV)的分离的遗传标记的组合物， 所述遗传标记包括与HPV的El基因同源的序列。在一个方面，序列包括HPV的El基因的 核苷酸 987 - 1135。在另一个方面，序列由SEQIDN0:69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、 79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96 或 97 编码。本发明包含与 HPV 的 El 基因至少 50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、100%或之间 的任何百分比点等同的序列。在优选实施方案中，序列与HPV的El基因至少70%等同。本 发明包含与 HPV 的 El 基因至少 50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、 100%或之间的任何百分比点同源的序列。在优选实施方案中，序列与HPV的El基因至少 70%同源。
[0009] 本发明提供了诊断患者中的人乳头瘤病毒（HPV)感染的方法，其包括步骤：(a)从 所述患者中获得尿样品；和（b)检测所述尿样品中HPV的El基因的一个或多个序列；其中 检测出HPV的El基因的一个或多个序列指示至少一种人乳头瘤病毒的存在，从而诊断患者 中的HPV感染。根据这种方法，核酸是DNA或RNA。在这种方法的优选实施方案中，DNA是 经肾（transrenal)DNA。这种方法检测包括经肾DNA的HPV DNA。可替代地，这种方法唯一 地检测经肾DNA。
[0010] 在这种方法的特定实施方案中，检测步骤包括选自下述的技术：杂交、聚合酶链反 应（PCR);嵌套引物PCR ;实时PCR ;NA杂交；环状探针反应；单链构象多态性（SSCP);链置 换扩增（STA);和限制性片段长度多态性（RFLP)。
[0011] 检测步骤包括聚合酶链反应，其使用足够互补的引物对，以与HPV的El基因中的 序列杂交。此外，检测步骤包括聚合酶链反应，其使用足够互补的引物对，以与由SEQ ID NO :69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、 93、94、95、96或97编码的序列杂交。可替代或另外地，检测步骤包括聚合酶链反应，其使用 足够互补的引物对，以与由SEQ ID NO :1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15编码的 序列或其互补序列杂交。
[0012] 当本文描述的方法使用基于聚合酶链反应（PCR)的方法检测HPV时，聚合酶链反 应使用SEQ ID NO :41和42的引物对。SEQ ID NO :41和42的引物对鉴别检测高危型HPV。 可替代地，聚合酶链反应使用下述由SEQ ID NOs :43和55、44和56、45和30、46和57、47和 58、48和33、49和34、50和36、51和59、52和38、53和39或54和40编码的引物对中的至 少一个。在特定实施方案中，聚合酶链反应使用选自SEQ ID N0s:43、44、45、46、47、48、49、 50、51、52、53和54的至少一个正向引物，和选自SEQIDN0s :55、56、30、57、58、33、34、35、 36、59、38、39和40的至少一个反向引物。聚合酶链反应进一步使用下述由SEQ ID NOs :43 和55、44和56、45和30、46和57、48和33、50和36、51和59以及52和38编码的引物对 中的至少一个。在特定方面，聚合酶链反应使用选自SEQ ID N0s:43、44、45、46、47、48、49、 50、51、52 和 54 的至少一个正向引物，和选自 SEQ ID N0s:55、56、30、57、58、33、35、36、59、 38和39的至少一个反向引物。
[0013] 在本发明的特定实施方案中，将多个引物对添加到在单管中包含的PCR反应中。 组PCR反应（group PCR reaction)包括 1-5、5-10、10-15、15-20、20-25个引物，或之间的任 何数目。组PCR反应用于鉴定在生物或临床尿样品中存在的所有可能的HPV形式。例如， 在单个PCR反应背景中，将表3、表4或表5中列出的引物应用于任何给定样品。
[0014] 根据这种方法的特定方面，所述尿样品中的核酸降解减少。减少核酸降解包括通 过增加的PH、增加的盐浓度、热灭活或通过用选自下述的化合物处理所述尿样品来抑制核 酸酶活性：乙二胺四乙酸、盐酸胍、异硫氰酸胍、N-月桂酰基肌氨酸和十二烷基硫酸钠。
[0015] 这种方法的检测步骤进一步包括基本上分离所述尿样品中的所述核酸。分离通过 沉淀或通过使用固体吸附剂材料来执行。
[0016] 这种方法进一步包括使尿样品过滤，以去除污染物。在一个方面，过滤去除包括超 过约1000个核苷酸的核酸。在另一个方面，过滤去除包括超过约300个核苷酸的核酸。 [0017] 另外地，这种方法进一步包括定量所述核酸的步骤。定量通过本领域已知的方法 来完成。
[0018] 除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语都具有与由本发明所属领域 普通技术人员通常理解的含义相同的含义。下文描述了合适方法和材料，尽管与本文描述 的那些相似或等价的方法和材料可以用于本发明的实践或测试中。本文提及的所有出版 物、专利申请、专利和其他参考文献都整体引入作为参考。在冲突的情况下，以本说明书包 括定义为准。另外，材料、方法和实施例仅是举例说明性的并且不意图是限制性的。
[0019] 本发明的其他特点和优点由于下述详述和权利要求将是显而易见的。 附图简述
[0020] 图1是HPV16的基因组中的可读框（ORFs)的示意图或图。
[0021] 图2是描述个别HPV基因型的PCR产物的凝胶电泳分析照片，其使用基因定位到 (mapped to) HPV的El基因的引物进行扩增。
[0022] 图3是描述个别HPV基因型的PCR产物的凝胶电泳分析照片，其使用基因定位到 HPV的El基因的单个引物对SEQ ID :41和SEQ ID :42进行扩增。
[0023] 图4是描述对从具有子宫颈癌的患者中收集的尿DNA进行的HPV PCR测试的PCR 产物的凝胶电泳分析照片，其使用基因定位到HPV的El基因的单个引物对SEQ ID :41和 SEQ ID :42进行扩增。
[0024] 图5是描述个别HPV基因型的PCR产物的凝胶电泳分析照片，其使用基因定位到 HPV的El基因的所有高危特异性引物进行扩增（参见表4)。
[0025] 图6是描述对从具有子宫颈癌的患者中收集的尿DNA进行的HPV PCR测试的PCR 产物的凝胶电泳分析照片，其使用在单管PCR反应中的所有高危特异性引物的混合物进行 扩增。引物基因定位到HPV的E1基因。
[0026] 图7是描述个别HPV基因型的PCR产物的凝胶电泳分析照片，其使用基因定位到 HPV的El基因的高危特异性引物亚群（参见表5)。 详述
[0027] 人乳头瘤病毒（HPVs)是与皮肤和粘膜上皮的良性和恶性损害相关的趋上皮 病毒（图1关于病毒的遗传学图）。在HPV感染和子宫颈癌的后续发展之间存在充分 证明的原因联系。还存在使HPV感染与头和颈癌、呼吸组织癌和乳腺癌相关的观察。 (Braakhuis 等人，2〇04，J. Natl. Cancer Inst. % (I3) :998_1006;Dahlstrand 等人，2〇04， Anticancer Res.24(3b) :1829-35 ;Daling 等人，2004，Cancer 101(2) :270-80 ;Ha 等人， 2004，Crit. Rev. Oral Biol. Med. 15(4) :188-96 ;Hafkamp等人，Acta Otolaryngol. 124(4): 520-6 ;Harwood 等人，2004，Br. J. Dermatol. 150(5) :949-57 ;Rees 等人，2004，Clin. Otolaryngol. 29 (4) : 301-6 ;Widschwendter 等人，2004, J. Clin. Virol. 31 (4) : 292-7) 〇
[0028] 迄今为止已鉴定了超过100种不同类型的HPV(Antonsson，A.等人，2000， J. Virol. 74 :11636-11641 ;Chan，S. Υ·等人 1995, J. Virol. 69:3074-3083 ;de Villiers， E.M.等人2004, Virology 324:17-27)，其中40种已在肛殖感染中报道（de Villiers Ε_Μ· 2001，Papillomavirus Rep. 12:57-63 ;Villiers EM 等人，2004，Virology. Jun 20 ; 324(1) : 17-27)。基于HPV的