人乳头瘤病毒的核酸检测试剂盒及其使用方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种核酸检测试剂盒及其使用方法和应用，特别是涉及一种人乳头瘤 病毒的核酸检测试剂盒及其使用方法和应用。
【背景技术】
[0002] 人乳头瘤病毒（HPV)是一种属于乳多空病毒科的乳头瘤空泡病毒A属，是球形DNA 病毒，具有高度的特异性，可定向感染皮肤黏膜的鱗状上皮并引起增殖。目前已分离出130 多种，不同的型别引起不同的临床表现，根据侵犯的组织部位不同可分为：
[0003] 皮肤低危型（HPV1、2、3、4、7、10、12、15等），其与寻常巧、扁平巧、妬巧等相关；
[0004] 皮肤高危型（HPV5、8、14、17、20、36、38);
[0005] 黏膜低危型（HPV6、11、13、32、：M、40、42、43、44、53、54 等）；
[0006] 黏膜高危型（HPV16、18、30、31、33、35、39)。
[0007] 2004年发布的HPV hanclbook中提出HPV高危型别中有18个型别（HPV16、18、26、 31、33、35、39、51、53、56、59、66、68、73、82)可导致宫颈癌，而低危型别中6、11型别的感染 概率也很高，能够导致尖锐湿巧等疾病。
[0008] 另外，目前发现的HPV型别中，约40多种可特异性的感染肛口生殖器部位的皮肤 和粘膜。按照HPV所导致皮肤损伤的性质，可将HPV型别分为高危型化i曲Risk, HR)和低 危型化0W Risk, LR)。同时，大量研究表明，宫颈HR-HPV感染是宫颈上皮内瘤变和宫颈癌 发病的必要条件。女性宫颈持续感染高危型HPV不但为宫颈癌的发生埋下隐患，而且增加 了病毒在性伴侣之间相互传播的机会。经研究，HPV的感染在人群中普遍存在，女性的一生 至少有80%感染HPV的风险，在临床观察中，注意控制HPV的持续感染，可控制宫颈癌的发 生。有研究发现，70% W上有性生活的妇女会感染HPV。因此，对预防和治疗性HPV疫苗的 研究在防治宫颈癌及其他恶性肿瘤方面具有极其重要的意义。虽然人们已经认识到HPV感 染的危害性，但是目前并没有一种被证实有效的方法来消除宫颈HPV的感染，提前注射HPV 部分亚型的疫苗，是目前唯一用于预防HPV感染的方法。因此，快速、准确、高效的对HPV亚 型进行检测，对预防和治疗HPV感染具有重要意义。
[0009] 另外，目前HPV的检测诊断方法有宫颈细胞学检测、病理检查、核酸杂交检测、杂 交捕获法、分子导流杂交法、液态芯片法、免疫色谱层析试纸检测、实时英光PCR法、PCR+基 因测序法、ELISA+杂交捕获法等，主要的几种如下：
[0010] 1)子宫颈细胞学检测；液基为主的细胞学检测如CCT，TCT，LCT，CCT-传统制片， 自动阅片系统；TCT -自动制片系统，人工阅片；LCT -自动制片系统+自动辅助阅片系统+ 人工阅片，其特点是镜下挖空细胞，检出率28 %。
[0011] 2)显微镜下病理检查；病理科制片后，镜下观察检出率34%，受病理制片因素影 响及病理科医师水平影响。
[001引扣第二代杂交捕获，HCII ;第1个抑A批准临床检测应用的方法，能区分高低危， 可W相对定量，缺点是；无内标，检测时间较长值NA分解45min、DNA-RNA杂交60min、抗体 捕获60min、化学发光30min、计算机判读15min)，灵敏度低，成本高，和检测范围外的HPV亚 型存在交叉反应，造成假阳性结果的产生。
[0013] 4)分子导流杂交（凯谱）：利用了小通量核酸芯片的原理，定性，能够一次性确定 单种或多种的具体型别HPV感染情况，有内标准，控制了 PCR的高敏感性及假阳性高的缺 点，而且检测型别可W根据平台要求有扩展空间。凯普生物使用该种技术已开发多种HPV 检测试剂盒，其中37种（HPV)分型检测试剂盒可对37种HPV型别精确分型，包括HPV6U1、 42、43、44、16、18、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68、81、26、34、40、54、55、57、 61、67、69、70、71、72、73、82、83及84。优点；可对型别具体分型。缺点；灵敏度低，开盖操作 易污染，价格昂贵。
[0014] 5)液态芯片法（luminex);利用液相芯片的原理可进行定性和定量分型，而且可 W具体分型。目前上海透景生命科技有限公司使用luminex平台已开发出HPV检测试剂 盒，可对 19 种高危亚型 16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66、26、53、55、68、82、8 和 7种低危亚型6、11、40、42、44、61、73进行有效扩增。优点：能够具体分型；缺点；手工操作 繁琐、开盖操作易污染、价格昂贵。
[0015] 6)英光PCR法：利用英光PCR法检测HPV病毒，所需的检测时间较短，灵敏度高， 可有效降低漏检的的可能，成本相对较低，无需PCR后开盖操作，防污染系统完善，可预防 由于污染产生假阳性结果。然而英光PCR法受到检测通道的限制，一般只对16、18、6、11进 行分型，其他型别不能具体分型。同时目前大多数PCR分型产品目标序列为L区，对某些型 别不能准确区分。
[0016] 综上所述，宫颈细胞学检测、病理学检查受主观因素影响较大，灵敏度也较低，所 W临床应用中存在一定的漏检率；核酸杂交法、杂交捕获法、分子导流杂交法、液态芯片法 相对于前者，灵敏度有所提高，对HPV型别检测的覆盖范围较大，但由于在操作过程中容易 产生污染，导致假阳性结果的产生；实时英光PCR法具有更高的灵敏度及特异性，可W极大 的降低假阳率和漏检率，检测过程可全自动化进行，降低人力的投入，但由于英光通道数量 的制约和多重PCR技术的难度，在HPV型别确定方面存在一定的限制。
[0017] 上述的检测方法均存在自身的缺陷，为临床HPV的诊断和治疗带来一定困难。因 此，对已有技术所存在的缺陷进行改进，使其在HPV临床检测时能够发挥更为有效的作用 至关重要。
【发明内容】
[0018] 本发明要解决的技术问题是提供一种人乳头瘤病毒（HPV)的核酸检测试剂盒及 其使用方法和应用。本发明利用多重实时英光PCR法作为技术平台，W HPV基因组E区基 因为目标序列进行引物探针设计，并综合HPV在中国的主要感染型别及最新相关疫苗的研 制情况进行试剂盒的开发，使其可对多种高危型别及低危型别进行检测，并同时对多种HPV 亚型进行分型鉴别，对于HPV感染跟踪监测、治疗W及HPV相关疫苗的注射起到一定的辅助 作用。同时，该试剂盒具有能对HPV相对病毒载量进行推算、避免污染、提高样本处理通量、 避免检漏等优点。
[0019] 为解决上述技术问题，本发明的人乳头瘤病毒（HPV)的核酸检测试剂盒，包括：核 酸扩增试剂；
[0020] 其中，所述核酸扩增试剂包括；引物对、与引物对相对应的探针；
[0021] 所述引物对包括；如沈Q ID NO. 1-2、3-4、5-6、7-8、9-10、11-12、13-14、15-16、 17-18、19-20、21-22、23-24、25-26、27-28、29-30、31-32、33-34、35-36、37-38、39-40、 41-42、43-44、45、46、47-48所示的引物对和如沈9 10^.73-74所示的内标（人类看家基 因目-globin)引物对；引物对中的引物浓度优选为80~140nmol/L ;
[0022] 所述与引物对相对应的探针包括；与如沈Q ID NO. 1-2、3-4、5-6、7-8、9-10、 11-12、13-14、15-16、17-18、19-20、21-22、23-24、25-26、27-28、29-30、31-32、33-34、 35-36、37-38、39-40、41-42、43-44、45、46、47-48 所示的引物对分别相对应的如沈Q ID NO. 49-72所示的探针，W及如SEQ ID NO. 75所示的内标（人类看家基因目-globin)探针； 探针的浓度优选为20~50nmol/L。
[0023] 所述探针的两端（5'端和3'端）还分别连接有英光基团和浑灭基团；其中，女口 SEQ ID NO. 49-72所示的探针的5'端的英光基团可W选用FAM、肥X、CY5或R0X，如SEQ ID NO. 49-72所示的探针3'端的浑灭基团可W选用非英光浑灭基因，包括；B册1或B册2 ;
[0024] 内标探针的5'端还可标记有TAMARA英光基团，3'端标记有B册1或B册2浑灭基 团。
[00巧]如SEQ ID N0.51-52、69-72所示的探针（针对低危型人乳头瘤病毒的特异性探 针）的5'端标记有FAM、R0X或CY5英光基团，3'端标记有B册1或B册2浑灭基团。
[0026] 如SEQ ID NO. 49-50、53-68所示的探针（针对高危型人乳头瘤病毒的特异性探 针）的5'端标记有FAM、R0X、CY5或肥X英光基团，3'端标记有B册1或B册2浑灭基团。
[0027] 在本发明中，如沈Q ID NO. 49、51、53所示的探针（分别针对HPV16、HPV6和HPV31 型的特异性探针）的5'端优选使用R0X英光基团标记；
[0028] 如沈Q ID NO. 50、52、54所示的探针（分别针对HPV18、HPV11和HPV33型的特异 性探针）的5'端优选使用CY5英光基团标记；
[0029] 如SEQ ID NO. 57、62所示的探针（分别针对HPV45和HPV58型的特异性探针）的 5'端优选使用肥X英光基团标记；
[0030] 如沈Q ID NO. 55-56、58-61、63-72 所示的探针（分