12种脑炎病毒核酸多重pcr检测试剂盒及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于基因检测领域，涉及一种利用通用引物介导的多重PCR扩增方法检测 12种脑炎病毒核酸的试剂盒及其应用。
【背景技术】
[0002] 病毒性脑炎是由多种病毒引起的中枢神经系统感染性疾病，因一年四季均可发 生，故又称为散发性脑炎，其发病率约为（3. 5~7. 4)/10万，近年来呈逐年上升趋势，病毒 性脑炎多发于儿童，该病往往缺乏特异性临床表现，病情严重者脑实质严重受损，可导致神 经系统后遗症，甚至死亡。目前认为，在脑脊液（Cerebrospinal fluids，CSF)中检出病毒、 病毒核酸或病毒特异性抗体则可明确中枢神经系统病毒感染的病因。用分子生物学检测方 法在CSF标本中检出病毒核酸，被认为是中枢神经系统病毒感染性疾病病因诊断的标准。
[0003] 引起病毒性脑炎的病毒较多，目前已知国内外报道的就有高达100多种病毒可导 致脑实质或脑膜炎症病变，并且不断发现新的病毒，脑炎发病率和发病人群有逐年增加的 趋势。临床统计数据表明，约20 %的病毒性脑炎是由DNA病毒感染所致，其余均由RNA病毒 感染引起。引起病毒性脑炎的病毒主要有肠道病毒、疱疹病毒（HSV1、HSV2、HHV6、EB、VZV、 HCMV)、流行性乙型脑炎病毒、西尼罗病毒、JC病毒、人T细胞白血病病毒（HTLV1、HTLV2)和 伯氏疏螺旋体。
[0004] 流行性乙型脑炎（Japanese encephalitis)是由流行性乙型脑炎病毒（Japanese encephalitis virus，JEV)，又称日本脑炎病毒，是RNA病毒，引起的以中枢神经系统损害为 特征的一种急性传染病，是一种自然疫源性人兽共患病，是病毒性脑炎中的重要一员，致死 率高达5%~35%，严重威胁人类的健康和生命安全。
[0005] 西尼罗病毒（WNV)属于黄病毒科、黄病毒属的重要成员，是RNA病毒。人感染WNV 后，通常表现为西尼罗热、西尼罗病毒性脑炎，极少数患者表现为严重的胰腺炎、肝炎、心肌 炎等。大约有1/300~1/150的西尼罗病毒感染者发展为脑炎、脑膜脑炎，一般称为西尼罗 病毒性脑炎，临床症状表现为发热、头痛、抽搐、意识障碍、脑膜刺激等。西尼罗病毒性脑炎 病死率大约为3~15%，多为老年人或免疫力低下病人。
[0006] 人T细胞白血病病毒（HTLV))是1980年美国人Gallo首先从皮肤型T细胞淋巴 瘤患者体内发现的第一种人类逆转录病毒，按基因组学及血清学反应可分为1型（HTLV-I) 和2型（HTLV-II)。该病毒为球型颗粒，内部由RNA核蛋白及围绕在外的20面体蛋白衣壳 组成，最外层具有包膜结构，表面镶嵌有糖蛋白。目前全世界大约有1000到2000万人感 染HTLV病毒，而在我国的北京、广西、江西、新疆、柳州、合肥和四川等10多个省市已发现了 HTLV感染病例，同时某些沿海地区也出现了局部小规模流行。HTLV感染细胞主要通过细胞 间感染的方式，游离病毒颗粒是没有感染能力的。HTLV感染细胞与未感染细胞建立突触，进 而使病毒蛋白和RNA染色体组进入革El细胞。通过逆转录酶使病毒RNA逆转录为cDNA，同时 这种前病毒DNA被整合到宿主细胞，最终引起成人T细胞白血病、热带痉挛性瘫痪及其他相 关神经系统疾病。
[0007] 伯氏疏螺旋体（Borrelia burgdorferi)属于原核生物界螺旋体目、螺旋体科疏螺 旋体属的一种，是一种单细胞疏松盘绕的左旋螺旋体。是由蜱虫传播的一种自然疫源性、人 畜共患疾病，通过肩突硬蜱感染人体宿主，可引起多系统器官损害，游走性红斑、神经炎、关 节炎、心肌炎等。伯氏疏螺旋体在细菌中是最复杂的一个，基因组包含950kb线性染色体， 由不同的线性质粒和环形质粒组成。对于伯氏疏螺旋体的分子生物学检测主要是PCR方 法，在大多数的研究中针对不同的基因序列设计引物，如〇spA、ospC、16S rRNA等。
[0008] 单纯性疱疹（Herpes Simplex)是一种由疱疹病毒所致的病毒性皮肤病。单纯疱 疹病毒包括单纯疱疹病毒I型（HSVI)和单纯疱疹病毒II型（HSVII)，其中HSVI首要引起 生殖器以外的皮肤、粘膜（口腔粘膜）和器官（脑）的感染；HSVII首要引起生殖器部位皮 肤粘膜感染，通常认为与宫颈癌发生有关。
[0009] 水痘一带状疱疹病毒（varicella-zoster virus，VZV)，在儿童初次感染引起水 痘，恢复后病毒潜伏在体内，少数病人在成人后病毒再发而引起带状疱疹。多见于成年人和 老年人。成人水痘症状较严重，常并发肺炎，死亡率较高。有免疫缺陷的儿童和无免疫力的 新生儿感染水痘，病情凶险，可能是一种致死性感染。如孕妇患水痘除病情严重，可导致胎 儿畸形、流产或死亡。
[0010] 人巨细胞病毒（human cytomegalovirus)又称为涎病毒，是人类疱疹病毒组中最 大的一种病毒。这种病毒进入细胞内以后会导致细胞增大，所以叫做巨细胞病毒。
[0011] ElB病毒（Epstein-Barr)是一种DNA病毒，呈球形，直径为180nm~200nm，在B淋 巴细胞中复制，为95%以上的成人所携带。它是传染性单核细胞增多症的病原体，还与鼻咽 癌、儿童淋巴瘤的发生有密切关系，被列为可能致癌的人类肿瘤病毒之一。
[0012] 人疱疹病毒6型（HHV-6)原发感染后多无症状，少数可引起幼儿丘疹或婴儿玫瑰 疹。常急性发病，先有高热（39°C数天）和上呼吸道感染症状，退热后颈部和躯干出现淡红 色斑丘疹。此外，感染可导致中枢神经系统症状，包括癫痫、脑膜炎和大脑炎等。
[0013] JC病毒为小双链DNA病毒，在人群中广泛感染，只有一种血清型，可分为30多个基 因型，JC病毒可垂直传播，也可通过呼吸道、消化道传播，严重免疫抑制患者感染JC病毒后 可引起进行性多灶脑白质病。
[0014] 在脑脊液（Cerebrospinal fluids，CSF)中检出病毒、病毒核酸或病毒特异性抗 体则可明确中枢神经系统病毒感染的病因。病毒分离阳性为中枢神经系统病毒感染性疾病 病原学诊断的标准，但费时、费力，且CSF中病毒含量低，分离的阳性率不高。急性期在CSF 中检测到病毒的特异性IgM抗体，可作为早期诊断的依据，但CSF中IgM含量低，且不同病 毒及其血清型需要选择相应的试剂盒，否则易漏诊。PCR的出现，极大的增加了检测手段的 敏感性，用分子生物学检测方法在CSF标本中检出病毒核酸，被认为是中枢神经系统病毒 感染性疾病病因诊断的金标准。但目前缺乏利用PCR方法检测CSF标本中病毒核酸的试剂 盒，尤其缺乏利用多重PCR方法在一个反应管中同时检测CSF标本中多种病毒核酸的试剂 盒。
[0015] 多重PCR(Multiplex PCR，M-PCR)是指在同一个反应体系中，加入多对特异性引 物，如果存在与各引物对特异性互补的模板，即可同时在一个反应管中扩增出一条以上的 目的DNA片段，实现了一次性检测多种病原体的目的。然而，由于多重PCR是在同一 PCR反 应体系里加入多对引物以扩增多个DNA片段的PCR反应，因此同一反应体系中的多对引物 易发生相互作用，如形成发卡结构，二聚体结构等，引物对和引物量越多，引物之间的相互 作用越明显，从而影响PCR扩增效率，进而影响了多重PCR的广泛应用。
【发明内容】
[0016] 本发明解决的技术问题：为了解决同一反应体系中的多对引物之间相互作用的问 题，本发明采用了通用引物多重PCR扩增技术。通用引物多重PCR扩增是指在特异性引物 的5'端添加一段与待测模板无任何扩增的寡核苷酸序列而进行的PCR扩增，5'端添加的寡 核苷酸序列为通用引物，PCR扩增时嵌合引物浓度通常是通用引物的1/10, PCR扩增的最初 几个循环中由嵌合引物的特异性序列进行扩增，富集核酸模板，随着PCR反应的进行，嵌合 引物逐渐消耗，通用引物由于浓度较大发挥主要作用，余下循环中，所有的扩增均通过通用 引物进行扩增，降低了普通多重PCR的扩增偏好性，使得低浓度的核酸模板得到有效扩增， 且由于嵌合引物浓度较低，避免了引物间二级结构的影响。
[0017] 鉴于此，本发明提供一种特异性强、灵敏度高、通量高的12种脑炎病毒核酸多 重PCR检测试剂盒，用于检测脑炎病毒患者脑脊液或血液样本中的流行性乙型脑炎病毒 (JeV)、人类T淋巴细胞白血病病毒I型（HTLVl)、西尼罗病毒（WNV)、单纯疱疹病毒I型 (HSVl)、单纯疱疹病毒II型（HSVII)、人疱疹病毒VI型（HHV6)、JC病毒（JCV)、人类T淋巴 细胞白血病病毒Π 型（HTLV2)、伯氏疏螺旋体（BBF)、人巨细胞病毒（