西瓜花叶病毒rt-lamp检测试剂盒及检测方法
【专利摘要】一种西瓜花叶病毒RT?LAMP检测试剂盒及检测方法，所述检测方法包括以下步骤：S1使用由二甲基亚砜和1M Tris?HClpH7.5构成的快速提取液，从待测样品中提取总RNA，并作为RNA模板；S2使用设计的上游引物、下游引物及环引物，构建RT?LAMP反应体系；S3将所述RT?LAMP反应体系，置于59℃水域中，反应60分钟，得到反应液；S4对所述反应液进行检测。
【专利说明】
西瓜花叶病毒RT-LAMP检测试剂盒及检测方法
技术领域
[0001] 本发明设及一种西瓜花叶病毒RT-LAMP检测试剂盒及检测方法，具体设及西瓜花 叶病毒(Watermelon mosaic virus，WMV)RT-LAMP引物组的筛选，WMV RT-LAMP检测试剂盒 的应用。
【背景技术】
[0002] 西瓜花叶病毒（WMV)是马铃馨Y病毒属的一员，为正单链RNA病毒，病毒全长约 lOkb，主要侵染西瓜、甜瓜等葫芦科科作物，在作物上部叶片产生轻花叶，是运些作物上的 主要病毒之一。WMV主要通过摩擦接种、晒虫W非持久性方式传播。西瓜花叶病毒(WMV)在我 国各葫芦科作物产区的发生呈现逐年上升趋势，已经成为影响我国瓜类生产的重要问题。
[0003] 环介导的等溫扩增技术(Xoop-mediated isothermal amplification,LAMP)是根 据目的基因的6个特异区域，设计4-6条特异性引物，利用Bst DM聚合酶在60~65°C等溫条 件下特异地扩增目的基因。LAMP扩增反应可在60分钟之内完成，其扩增产物是和祀标反向 重复的茎环结构W及多环的菜花样结构，反应过程中产生大量焦憐酸根离子，并形成焦憐 酸儀白色沉淀。LAMP方法可W通过多种方法判断结果，如反应后体系内是否存在白色沉淀 物、电泳结果是否具有梯状条带、加入SYBR Green I是否变成绿色等，具有检测灵敏度高， 检测方法简单快速、仪器要求不高等特点。然而就引物设计方面，目前报道的文献多是W在 线方式(Primer E邱lore)设计引物，应用范围受到限制，根据LAMP原理自行设计多组引物 组，通过实验结果选取最适引物组，构建LAMP检测方法，运样将会大大增加 LAMP的适用范 围，具有更为广泛的应用前景。
[0004] 自LAMP技术建立W来，该技术已经广泛应用于对病菌、寄生虫等的检测，近年来在 动物病毒的检测研究中逐渐推广起来，然而对于植物病毒如西瓜花叶病毒还没有相应的检 巧聯剂盒的报道，因此开发一种针对西瓜花叶病毒的RT-LAMP试剂盒具有重要的应用价值。
【发明内容】
[0005] WMV检测主要有DTBIA、化SA、RT-PCR、RT-nested PCR、real-time RT-PCR等方法。 DTBIA灵敏度较低；而RT-PCR、RT-nested PCR和real-time RT-PCR核酸检测技术需要昂贵 的专业仪器，且核酸扩增的时间较长。
[0006] 本发明要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种快速西瓜花叶病毒 RT-LAMP检测方法。本发明人在坚持不懈的努力之下，发明了一种快速提取RNA待测样品的 方法，并结合自己设计的引物，使用RT-LAMP检测方法，能够快速有效地检测出西瓜花叶病 〇
[0007] 本发明提供
[000引 （1) 一种西瓜花叶病毒RT-LAMP检测试剂盒，其特征在于，包括RT-LAMP引物，所述 RT-LAMP引物为：
[0009]
[0010] (2)如（1)所述的试剂盒，还包括西瓜花叶病毒的RNA的快速提取液，所述快速提取 液由二甲基亚讽、和1M化is-肥1(抑7.5)构成。
[0011] (3)如(2)所述的试剂盒，其中，所述二甲基亚讽的体积浓度为2~10%。
[0012] 本发明还提供如下检测西瓜花叶病毒的方法，
[0013] (4)-种西瓜花叶病毒RT-LAMP检测方法，其特征在于，包括W下步骤
[0014] S1使用由二甲基亚讽和1M Tris-HCl(pH7.5)构成的快速提取液，从待测样品中提 取总RNA，并作为RNA模板；
[00巧]S2使用如（1)所述试剂盒，构建RT-LAMP反应体系，所述反应体系为20化，包括:2 X 反应缓冲液(RM)lOyL，酶溶液(EM)0.祉L，40pmol/化上游引物FIP 0.祉L，40pmolAiL上游引 物BIP0.祉L，lOpmo 1/化下游引物F30.4化，lOpmo 1/化下游引物B3 0.化L，浓度均为20pmol/ 化的环引物LB0.祉L，RNA模板1.化L，及去离子水(DW) 4.
[0016] S3将所述RT-LAMP反应体系，置于59°C水域中，反应60分钟，得到反应液；
[0017] S4对所述反应液进行检测。
[001引（5)如(4)所述的RT-LAMP检测方法，其中，所述二甲基亚讽的体积浓度为2~10 %。
[0019] (6)如(4)所述的RT-LAMP检测方法，其中所述S4步骤中是在所述反应液中加入加 入巧黄绿素巧光染料，通过反应管内所产生的颜色变化判断检测结果。
[0020] 本发明根据WMV的基因序列设计RT-LAMP引物，通过实验最终建立了 WMV的RT-LAMP 检测方法，为WMV的检测提供了一种快速高效、特异灵敏的新方法，灵敏度高，比普通RT-PCR 灵敏度高10倍;并可通过肉眼观察浊度或颜色反应直接进行结果判断。该方法适用于现场 WMV的快速检测。本研究的目的就是研制该病毒的快速高效、灵敏特异的检测技术，与W往 研究的方法形成一个不同层次的检测体系，使检测人员根据不同条件和目的可W进行广泛 有效的选择，为西瓜、甜瓜苗检验检疫及生产田的病害监测提供有效的技术支持。
【附图说明】
[0021] 图1 RT-LAMP反应体系中，W本发明的RNA提取方法2提取的总RNA为模板，本发明 设计的4组引物反应后，反应液的凝胶电泳图。
[0022 ]图2最佳反应溫度扩增曲线。
[0023] 图3特异性实验中扩增曲线结果。
[0024] 图4特异性试验中颜色反应结果。
【具体实施方式】
[0025] 为解决上述技术问题，设计4套用于检测WMV的引物组，包括引物组1的正向外引物 F3-1的序列为SEQ ID NO.l，反向外引物B3-1的序列为SEQ ID ^.2;正向内引物尸1口-1的序 列为569 10^.3，反向内引物81口-1的序列为569 10^.4;引物组2的正向外引物尸3-2的 序列为SEQIDN0.5，反向外引物B3-2的序列为SEQIDN0.6;正向内引物FIP-2的序列为 SEQIDN0.7，反向内引物BIP-2的序列为SEQIDN0.8;引物组3的正向外引物F3-3的序列 为SEQIDN0.9，反向外引物B3-3的序列为SEQIDN0.10;正向内引物FIP-3的序列为SEQ 10^.11，反向内引物61口-3的序列为569 10^.12;引物组4的正向外引物尸3-4的序列为 沈QIDN0.13，反向外引物B3-4的序列为沈QIDN0.14;正向内引物FIP-4的序列为沈QID ^.15，反向内引物81口-4的序列为56〇10^.16，^及环引物1^8，具体序列见表1。
[0026] 表1引物序列 [0027]
[00巧]Loopamp RNA扩增反应试剂盒、Loopamp反应管、Loopamp FD巧光检测试剂购自日 本荣研化学株式会社，RNA提取试剂盒购自北京百泰克生物技术有限公司，其他试剂均为常 规分析纯试剂。采用日本荣研化学株式会社生产的LA-320C实时浊度仪。
[0029] 试验例1核酸提取
[0030] 分别称取感染WMV病毒或未感染的（对照用）的西瓜上部叶片O.lg，或者用綴子获 取相当于o.lg大小的西瓜上部叶片作为实验用材料。
[0031] RNA提取方法1:使用RNA快速提取试剂盒（离屯、柱型）提取样品总RNA，具体操作按 试剂盒说明进行。本试验具体使用了QIAGEN化easy Mini kit提取RNA，也可W采取其它试 剂盒进行提取，或者通常实验室提取方法提取RNA。
[0032] RNA提取方法2:采用本发明的试剂盒，更加快速简便地提取RNA粗提液。具体是用 綴子取西瓜上部叶片约0.1 g，迅速置于研林中，研林中预先加入含有2~10%二甲基亚讽的 1M化iS-HC1 (pH7.5)5mL，并迅速研磨3min，然后静置2min，取1.6化作为RNA模板。所述綴 子、研林、研磨棒及其它试验用具需要在DEPC水中浸泡12小时后，150度烘烤6小时，然后取 出放置于4°C冷藏备用。含有2~10%二甲基亚讽的1M Tris-HCl(pH7.5)为事先配好，高溫 高压消毒处理后，放置于4 °C冷藏备用。移液抢的枪头W及各种反应管均使用RNA酶free产 品。
[0033] 试验例2RT-LAMP体系的建立及优化
[0034] RT-LAMP反应体系按照Loopamp RNA扩增试剂盒说明，反应体系为20化，包括:2X 反应缓冲液（RM)lOyL，酶溶液化M)0.祉L，40pmolAiL引物FIP0.祉L，40pmolAiL BIP0.祉L， lOpmol/yL F3 0.化LaOpmol/yL B3 O.^ULB(浓度均为20pmolAiL)0.祉L，RNA模板 1.化 L，及去离子水(DW)4.4化。反应溫度分别设为59 °C、6rC、63 °C和65 °C，反应时间为60min。扩 增反应在实时浊度仪上进行，根据60min内出现扩增曲线的最短时间确定最佳反应溫度。
[0035] 西瓜花叶病毒(WMV)、马铃馨Y病毒(PVY)、黄瓜花叶病毒(CMV)、烟草脉带花叶病毒 (TVBMV)及阴性对照(NC)的总RNA和水(作为空白对照，用BC表示)为模板进行RT-LAMP反应， 体系中同时加入1.化L巧黄绿素巧光染料（目化oopamp FD巧光检测试剂），验证该方法的特 异性。
[0036] RT-LAMP扩增产物（1)实时扩增曲线检测:扩增进行时，如果有产物出现，反应液会 产生一定的浊度；浊度仪会将浊度信号收集，W扩增曲线的形式反映，从而对结果进行判 断。（2)染料颜色反应检测:在LAMP反应体系中加入化L Loopamp抑试剂，反应结束后，肉眼 观察反应液的巧光颜色反应。显绿色判断为阳性反应;若显澄色判断为阴性反应。
[0037] 结果与分析
[003引1. RNA提取方法的确定
[0039] 分别配制二甲基亚讽浓度为2%、4%、6%、8%、10%的謹化13-肥1(抑7.5)溶液， 配制方法为在lOOmL的容量瓶中，加入lOg二甲基亚讽，然后加入已经配好的1M化is-HCl (抑7.5)并定容，得到二甲基亚讽浓度10%的1M化iS-肥1 (抑7.5)溶液。其它浓度可使用1M Tris-肥1(抑7.5)进行稀释，也可W重新配制。跟RNA提取方法2进行提取，并使用分光光度 计测量A260和A280的值，计算A260/A280比值，化easy Mini kit提取RNA作为阳性对照，其 结果见表2。
[0040] 表2不同方法得到的RNA溶液的A260/A280比值
[0041]
[0042] 因此，本实施例中均使用二甲基亚讽浓度为6%的謹化13-肥1(抑7.5)溶液提取 样品RNA，但运并不限定于该浓度，本领域技术人员应该理解，其它浓度的溶液所提取到的 RNA同样可W用于本发明的检测，并取得同样检测效果。
[0043] 2.最佳引物组的确定
[0044] 分别WRNA提取方法1和RNA提取方法2得到的RNA粗提液为模板，使用表1中4个引 物组，加入到试验例2中的RT-LAMP反应体系，反应溫度设为6rC，反应60分钟。结果无论是 巧剛方法提取的RNA作为模板，引物组2扩增的梯状条带最清晰、最亮，因此选用引物组2为 最佳引物组，图1显示的是RNA提取方法2得到的RNA粗提液为模板得到的结果，图1中符号Μ 是标记；1至4分别表示第1至4引物组。
[0045] 3.最佳反应溫度的确定
[0046] WRNA提取方法2得到的总RNA为模板，进行RT-LAMP反应，实时浊度仪输出的扩增 时间曲线结果如图2。由图中曲线可W看出，RT-LAMP在59、61、63和65°C的反应溫度下，分别 在约34、36、48和42min时产生了扩增曲线。根据现场检测时间尽可能短的要求，确定59°C为 最佳反应溫度。
[0047] 3.RT-LAMP特异性实验
[0048] 西瓜花叶病毒病毒(WMV)、马铃馨Y病毒(PVY)、黄瓜花叶病毒(CMV)、烟草脉带花叶 病毒(TVBMV)阳性材料及健康西瓜植株上部叶片（阴性对照，用NC表示)为临巧大学生物试 验中屯、保存的标本，从-30°C冰箱中取出运些标本，直接用綴子取出约O.lg叶片，按照本发 明的RNA提取方法2得到总RNAdW总RNA为模板进行RT-LAMP反应，溫度为59°C，时间为 60min。体系中加入巧黄绿素巧光染料W使得反应结束后可W通过反应管内所产生的颜色 变化判断是否扩增，结果如图3所示。由图3可W看出，只有WMV能够检测到扩增曲线，其他样 品在反应时间内都未检测到扩增曲线。反应结束后，加入WMV总RNA的反应管显绿色，判断为 阳性;而其他反应管均显澄色，判断为阴性，结果如图4所示。扩增曲线结果与颜色反应的结 果一致，表明本研究所建立的RT-LAMP检测方法具有高度的特异性，检测结果十分准确。
[0049] 本发明在建立WMV的RT-LAMP检测方法过程中，采用了日本Eiken化emical公司研 发配制的LoopampRNA扩增试剂盒，简化了实验反应前的准备工作，同时保证了实验的质量。 在结果分析方面，研究使用了LA-320C实时浊度仪，可对实验结果定量分析。另外，通过在 RT-LAMP反应体系中加入试剂盒配套的巧黄绿素巧光染料，使得不开盖也可观察到反应所 产生的颜色变化，避免了二次污染，保证了结果的准确性。另外，使用本发明的RNA快速提取 液，可W在现场快速检测，并现场得到结果，而不需要进入实验室使用化easy Mini kit提 取RNA。本发明的RNA快速提取液中含有2~10 %二甲基亚讽，虽然在本发明中能够快速提取 WMV病毒RNA的机理还不明确，但是根据分析，由于其具有高极性，能够使WMV病毒RNA快速释 放，并在RNA分解前加入到RT-LAMP反应体系，从而能够顺利作为模板，进行RT-LAMP扩增。该 机理将在今后的试验中作进一步的阐明。
[0050] 在建立针对某种病毒LAMP检测方法时，最重要的是特异引物的设计，而引物是否 特异决定于所选序列的比对结果是否特异。因此，一定要在引物设计的前期做好充足的准 备工作，利用序列分析软件将目的序列筛选好，然后将序列进行手动处理后再上传至引物 设计服务器设计引物，才能够得到较为理想的引物组。在进行结果检测方面，若有条件尽量 使用实时浊度仪，可W对结果进行定量分析，保证结果的准确性;同时，在进行结果检测时， 一定尽量避免开盖检测，防止产生二次污染导致假阳性结果出现。
【主权项】
1. 一种西瓜花叶病毒RT-LAMP检测试剂盒，其特征在于，包括RT-LAMP引物，所述RT-LAMP引物为： 上游外引物FIP序列SEQ ID N0.7; 上游内引物BIP序列SEQ ID N0.8; 下游外引物F3序列SEQ ID NO.5; 下游外引物B3序列SEQ ID NO.6; 以及环引物LB序列SEQ ID NO. 17。2. 如权利要求1所述的试剂盒，还包括西瓜花叶病毒的RNA的快速提取液， 所述快速提取液由二甲基亚砜和1M Tri s-HCl (pH7.5)构成。3. 如权利要求2所述的试剂盒，其中，所述二甲基亚砜的体积浓度为2~10 %。4. 一种西瓜花叶病毒RT-LAMP检测方法，其特征在于，包括以下步骤 S1使用由二甲基亚砜和1M Tris-HClpH7.5构成的快速提取液，从待测样品中提取总 RNA，并作为RNA模板； S2使用如权利要求1所述试剂盒，构建RT-LAMP反应体系，所述反应体系为20yL，包括:2 X反应缓冲液10yL，酶溶液0.8yL，40pmo 1/yL上游引物FIP 0.8yL，40pmo 1 AxL上游引物 BIP0 · 8yL，1 Opmo 1 /yL下游引物F3 0 · 4yL，1 Opmo 1 /VL下游引物B3 0 · 4yL，20pmo 1 /VL环引物 LBO. 8yL，RNA 模板 1.6yL，及去离子水4.4yL; S3将所述RT-LAMP反应体系，置于59 °C水域中，反应60分钟，得到反应液； S4对所述反应液进行检测。5. 如权利要求4所述的RT-LAMP检测方法，其中，所述二甲基亚砜的体积浓度为2~ 10%〇6. 如权利要求4所述的RT-LAMP检测方法，其中，所述S4步骤中是在所述反应液中加入 加入钙黄绿素荧光染料，通过反应管内所产生的颜色变化判断检测结果。
【文档编号】C12Q1/68GK106011311SQ201610486394
【公开日】2016年10月12日
【申请日】2016年6月28日
【发明人】王莹
【申请人】临沂大学