一种鼻咽癌相关eb病毒检测试剂盒及检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种生物技术领域，尤其涉及一种鼻咽癌相关EB病毒检测试剂盒及 检测方法。
【背景技术】
[0002] EB病毒（EBV)在世界各地感染比较普遍，成人超过90%均曾感染过。EB病毒感 染可引起传染性单核细胞增多症，与Burkitt淋巴瘤、Hodgkin病和鼻咽癌（NPC)等密切相 关。目前研究发现EBV感染与多种人类肿瘤发生相关。包括伯基特淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、 胃癌、鼻咽癌等。EBV在这些肿瘤发生中起到相当重要的作用，因此在1997年已经把EBV归 为第一类致癌物。近年来研究人员发现血浆游离EBV-DNA是一种可靠的监测指标，对鼻咽 癌的诊断、监测疗效及预后判断等方面都起到很好的作用。检测EBV-DNA含量对高危地区 NPC患者进行筛查和和辅助诊断有很高的实用价值。
[0003] 目前ELISA检测EBV各项抗体是临床诊断EBV感染的重要指标之一，但它实际上 检测的是人体对EBV感染的免疫反应状态，无法检测病毒自身，也就无法准确灵敏地反映 EBV感染的情况。由于鼻咽癌外周血循环的游离EBV-DNA的拷贝数随着全身化疗周期的 进行而呈现动态变化，所以检测鼻咽癌患者EBV-DNA的表达水平对判断病灶残留、复发、转 移、判断治疗的敏感性、综合治疗方案的及时更改、确认以及判断疗效、预后均具有重要的 指导意义，EBV目前已经成为鼻咽癌诊治中重要的血清分子标志物，可以作为诊断和治疗中 的一项参考依据。
[0004] 目前国外已经上市的检测EBV-DNA的试剂盒有几种，检测的方法主要是荧光免疫 杂交（HIGH)，国内检测EBV主要采用ELISA方法，未见有批准上市检测EBV-DNA的试剂盒。 基于EBV感染情况如此严重，开发一种简单、易行、成本较低的检测方法就显得尤为重要。
【发明内容】
[0005] 本发明旨在解决现有技术的不足，而提供一种鼻咽癌相关EB病毒检测试剂盒及 检测方法。
[0006] 本发明为实现上述目的，采用以下技术方案：一种鼻咽癌相关EB病毒检测试剂 盒，该试剂盒含有：
[0007] (1) EB-PCR 反应液：包括 buffer、dNTPs、taq 酶；
[0008] (2)第一 EB引物探针液：包括第一 EB引物、第一 EB探针；
[0009] (3)第二EB引物探针液；包括第二EB引物、第二EB探针；
[0010] (4)临界阳性质控品：为含有扩增目的基因片段的重组质粒；
[0011] (5)阳性质控品：为含有扩增目的基因片段的重组质粒；
[0012] (6)阴性质控品：DEPC水；
[0013] 所述第一 EB引物，序列如下：
[0014] 正向引物：TACGCITTGTTCCTTARA ;
[0015]反向引物：GTCAGGATAGCAAGAATR ;
[0016] 所述第一EB探针，序列如下：
[0017] TTACTGATTGTCGCTGGCATACTCT；
[0018] 由所述第一EB引物与第一EB探针扩增出的第一DNA序列为：TTACGCTTTG TTCCTTAGAT TTGTTCTGCA TGTTATTACT GATTGTCGCT GGCATACTCT TCATTCTTGC TATCCTGACC GAATG；
[0019] 所述第二EB引物，序列如下：
[0020]正向引物：CTGGACACTTATGITTCAA ;
[0021]反向引物：GGGACAATATCAGGCTAA ;
[0022] 所述第二EB探针，序列如下：
[0023] FAM-TATGGTCACTCAGGCACGGTC-BHQ1
[0024] 由所述第二EB引物与第二EB探针扩增出的第二DNA序列为：CTGGACACTT ATGTTTCAAG CAGCTCACCT ATGGTCACTC AGGCACGGTC GCCCCTCCGA GTGACCAGTC ACCTTCCAGA CTATGCATAC ACTGAATTTA GCCTGATATT GTCCC；
[0025] 本发明还提供一种利用上述试剂盒检测鼻咽癌相关EB病毒的检测方法：包括以 下步骤：
[0026] (1)标本提取：根据标本的不同选择不同的提取方式：咽拭子样本、组织及鼻咽部 石蜡切片，选择相应的试剂盒，按照其说明书和注意事项进行提取即可。EB病毒的阳性质控 品、阴性质控品和临界阳性质控品无需抽提，使用前室温融化混匀；
[0027] (2)试剂配置：
[0028] A、在试剂准备区内将盒内各组分取出，于室温充分融化之后，短暂震荡，瞬时离 心，算加到反应混合物中的量；
[0029] B、取1. 5mL离心管配置反应体系，试剂全部加入后震荡混勾，瞬时离心；
[0030] C、将上述混合液17 y L/管分装至PCR反应管中，将阴性质控品、临界阳性质控品、 定量标准品和已处理样本的提取产物8 y L分别加入PCR反应管中，盖紧管盖，瞬时离心将 管壁上的液体全部甩至管底，然后立即进行PCR扩增反应。
[0031] (3)PCR扩增：
[0032] 将各反应管放入荧光定量PCR仪器中，设置标记荧光基团种类、样本名称及类型， 按下列条件进行扩增：
[0033] 预变性94 °C 4分钟1个循环
[0034] 变性94°C 15秒45个循环
[0035] 退火、延伸、荧光信号采集60 °C 45秒45个循环
[0036] (4)分析判断：
[0037] 样品Ct值小于35,则表示为EB病毒感染阳性；样品的样品Ct值在35到38之间， FAM通道有比较明显的S型扩增曲线则要对样品进行复检；样品的样品Ct值大于38,则意 味EB病毒载量低于检测下限。
[0038] 本发明的有益效果是：本发明采用核酸扩增技术与Taqman荧光探针技术相结合， 提取过后的样本核酸在Taq-DNA聚合酶的作用下对靶区域进行扩增，同时利用Taqman荧光 探针技术实时监测扩增产物的累积。通过对扩增产物的检测判断EB病毒核酸的存在，并可 以通过定量标准曲线检测出病毒载量。根据病毒载量的多少可以判断出鼻咽癌发生的危险 性，本试剂盒具有特异、灵敏、快速、操作方便等优点。
【附图说明】
[0039] 图1为本发明第一EB引物的特异性实验结果图；
[0040] 图2为本发明第二EB引物的特异性实验结果图；
[0041] 以下将结合本发明的实施例参照附图进行详细叙述。
【具体实施方式】
[0042] 下面结合实施例对本发明作进一步说明：
[0043] -种鼻咽癌相关EB病毒检测试剂盒，该试剂盒含有：
[0044] (1) EB-PCR反应液：包括buffer、dNTPs、taq酶；
[0045] (2)第一EB引物探针液：包括第一EB引物、第一EB探针；
[0046] (3)第二EB引物探针液；包括第二EB引物、第二EB探针；
[0047] (4)临界阳性质控品：为含有扩增目的基因片段的重组质粒；
[0048] (5)阳性质控品：为含有扩增目的基因片段的重组质粒；
[0049] (6)阴性质控品：DEPC水；
[0050] 所述第一EB引物，序列如下：
[0051]正向引物：TACGCITTGTTCCTTARA ;
[0052]反向引物：GTCAGGATAGCAAGAATR ;
[0053] 所述第一EB探针，序列如下：
[0054] TTACTGATTGTCGCTGGCATACTCT ；
[0055] 由所述第一EB引物与第一EB探针扩增出的第一DNA序列为：TTACGCTTTG TTCCTTAGAT TTGTTCTGCA TGTTATTACT GATTGTCGCT GGCATACTCT TCATTCTTGC TATCCTGACC GAATG；
[0056] 所述第二EB引物，序列如下：
[0057]正向引物：CTGGACACTTATGITTCAA ;
[0058]反向引物：GGGACAATATCAGGCTAA ;
[0059] 所述第二EB探针，序列如下：
[0060] FAM-TATGGTCACTCAGGCACGGTC-BHQ1
[0061 ]由所述第二EB引物与第二EB探针扩增出的第二DNA序列为：CTGGACACTT ATGTTTCAAG CAGCTCACCT ATGGTCACTC AGGCACGGTC GCCCCTCCGA GTGACCAGTC ACCTTCCAGA CTATGCATAC ACTGAATTTA GCCTGATATT GTCCC；
[0062] 实施例1一种利用上述试剂盒检测鼻咽癌相关EB病毒的检测方法：包括以下步 骤：
[0063] (1)石蜡标本提取：
[0064] A、脱蜡：
[0065] ①、加入1ml的二甲苯，剧烈漩涡震荡10s ;
[0066]②、常温离心，12000rpm，2min ;
[0067]③、小心吸取上清液，弃掉，注意不要移走组织，如石蜡杂质过多，可重复一次；
[0068] ④、加入1ml的无水乙醇，剧烈震荡；
[0069]⑤、常温离心，12000rpm，2min ;
[0070]⑥.、小心吸取上清液，弃掉，注意不要移走组织；
[0071] ⑦.、放入金属浴中，37°C烘烤至完全干燥。
[0072] B、提取：
[0073]①、加入180yL的Buffer ATL，20yl proteinase K(蛋白酶K)，剧烈震荡混匀；
[0074] ②、56°C放置lh，或是放置到组织完全溶解；
[0075] ③、90°C放置lh，拿出凉至室温，如果使用同一个金属浴，先将样品取出，待金属浴 到90度之后再放进去；
[0076]④、加入200 y 1 Buffer AL，剧烈漩涡震荡混匀，然后加入200 y 1无水乙醇，再次 震荡混勾；
[0077] ⑤、小心的将液体转移到QIAamp MinElute column (离心柱下面套有2ml，收集废 液的EP管），8000rpm离心lmin，弃掉废液管中的液体；
[0078]⑥、向QIAamp MinElute column离心柱中加入500 y 1 Buffer AW1，8000rpm离心 lmin，弃掉废液管中的液体；
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