发热伴血小板减少综合症病毒检测试剂盒及制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，具体涉及一种发热伴血小板减少综合症病毒反转 录-重组酶多聚酶扩增（RT-RPA)检测试剂盒及其制备方法。
【背景技术】
[0002] 发热伴血小板减少综合征病毒（severefeverwiththrombocytopeniasyndrome virus，SFTSV)属于布尼亚病毒科，是近年来在我国新发现一种可引起出血性疾病的病毒。 该病毒基因组包括大（L)、中（M)、小（S) 3个单股负链RNA片段。其中L片段编码RNA依赖 的RNA聚合酶;Μ片段编码糖蛋白Gn和Gc;S片段以双向的方式编码病毒核蛋白N和非结 构蛋白NSs。病毒主要分布山区和丘陵地带的农村，呈散发，人群普遍易感。感染患者临床 表现为发热，伴乏力、恶心、呕吐等，部分病例有头痛、肌肉酸痛、腹泻等。绝大部分患者预后 良好，但部分病例病情危重，出现意识障碍、皮肤瘀斑、消化道出血、肺出血等，可因休克、呼 吸衰竭、弥漫性血管内凝血等多脏器功能衰竭死亡，重症死亡率高达15-30%。目前在我国 的河南、湖北、山东、安徽、辽宁、江苏、浙江等地都发现了SFTS病例。近期在日本、韩国和美 国都发现了由SFTS相关病毒引起的病例，表明病毒的分布范围较广，SFTS已成为威胁人类 健康和公共卫生的重要新发传染病。
[0003] SFTSV感染引起临床症状很难与其它病原（如汉坦病毒、无形体、流感病毒等）感 染相区别，因此实验室诊断具有重要意义。目前实验室诊断方法主要有病毒分离、血清学方 法和核酸检测方法等。病毒分离耗时费力，且试验操作的生物安全要求高，一般实验室难以 开展。检测特异性IgG抗体的血清学方法适合回顾性诊断和流行病学调查，不适合早期诊 断。目前核酸检测方法主要包括普通PCR法、Real-timetimePCR法和环等温扩增（LAMP) 法等。Real-timetimePCR法和LAMP法具有很好的特异性和敏感性，但前者依赖昂贵的仪 器和试剂；而后者由于交叉污染很容易出现假阳性。因此，需要建立一种快速、敏感、特异、 便于现场应用的核酸分子检测方法，以提高病毒监测和临床诊断水平。
【发明内容】
[0004] 本发明需要解决的问题是提供一种发热伴血小板减少综合症病毒反转录-重组 酶多聚酶扩增（RT-RPA)检测试剂盒及其制备方法。
[0005] 本发明提供的发热伴血小板减少综合症病毒RT-RPA检测试剂盒由RT-RPA反应体 系、L片段阳性质粒Puc-L、阴性质控品、L片段RPA引物和exo探针组成。
[0006] L片段RPA引物和exo探针为：
[0007] L-F，5'-TCTATAAACATAAACTCATCCAATGATGCCAAG-3' ；
[0008] L-S,5'-ATCAGATGACCTAGACTCAGATTTAGAACTGA-3' ；
[0009] L-exo-probe，5'-TTGGTTCATGCCAGCCAAATTCCACAGAT[dT-FAM]CA[THF]T[dT-BHQ] GGGCTGCCATTTCCATG[3'-block]-3'。
[0010] 本发明所述发热伴血小板减少综合征病毒RT-RPA检测试剂盒的制备方法：
[0011] (1)病毒核酸提取：采用酚氯仿法提取病毒RNA，具体步骤：取临床血清标本或病 毒培养物核酸100μL，加入含有200ul水饱和酚的1. 5mlEP中，剧烈震荡混匀，静置3min， 加入200ul氯仿，充分震荡混匀，12000g室温离心15分钟；吸取上清液，加入两倍上清体积 的异丙醇，再加入1/10上清体积3M醋酸钠约40ul，充分混匀后-20°C静置2h;取出于4°C 下，12000g，离心20min;弃上清，加入75%乙醇lml，4°C，12000g，离心20min;弃上清，室温 干燥，加入40ulDEPC水溶解RNA，-70°C冰箱放置备用；
[0012] (2)RT-RPA反应：采用英国TwistDx公司的TwistAmpRTexos试剂盒，取29.5yL 反应缓冲液，分别加入下列组分：引物L-RPAF(lOmM)和L-RPAR(lOmM)各2. 1yL，2. 6yL RPAexo探针（10mM)，1μLRNA酶抑制剂（5U)，7. 2μL超纯水，5μL标本RNA模板，涡旋震 荡，短暂离心，再加入2. 5μL醋酸镁（280mM)。混合离心后，放入Twista实时荧光检测仪 中，反应温度为40 °C，时间为20min。
[0013] 与现有技术相比，本发明的有益效果是：
[0014] 设计针对L片段RPA引物和exo探针，通过反转录-重组酶多聚酶扩增方法，反应 温度为40°C等温条件下，20min即可对临床上发热伴血小板减少综合症病毒标本和病毒分 离物进行核酸分子鉴定，无需昂贵仪器设备，便于操作，具有快速、敏感、特异等特点，为发 热伴血小板减少综合症病毒监测和临床救治提供一种新的检测方法。
【附图说明】
[0015] 图1检测SFTS病毒L片段RPA引物琼脂糖凝胶电泳筛选
【具体实施方式】
[0016] 下面提供具体实施例进一步阐述本发明的技术方案，但本发明技术的应用不限于 实施例。
[0017] 实施例1 :靶基因质粒构建
[0018] 设计L片段的特异性引物（F2705:5'TGGAAGGCAGTTCTGGATGACGG3' ；R3594 : 3'GTAAAGGTGTCCGTGAACCAATC5'），通过PCR法扩增获得890bp核苷酸片段，回收纯化后的 与T载体连接，获得靶基因阳性质粒，命名为Puc-L。
[0019] 实施例2 :引物探针设计与筛选
[0020] 通过序列分析软件分析，以SFTSV病毒较为保守的L片段2945-3154间序列为模 板，共设计8条正向引物和9条反向引物，引物长度为30-35bp;同时设计1条exo探针（命 名为L-exo-probe)，长度为52bp，其中30位碱基T标记荧光物质FAM，33位碱基T由四氢 呋喃代替，35位碱基标记荧光物质BHQ，同时封闭3'末端碱基。
[0021] 采用TwistAmpBasickit(TwistDx公司，英国），以革巴基因克隆质粒Puc-L为模 板，以琼脂糖凝胶电泳为结果指示手段，对上述设计的引物进行筛选。引物优劣的评价指标 包括特异性、敏感性、扩增效率和引物噪音等。取29. 5μL反应缓冲液，分别加入下列组分： 上下游引物（10mM)各2. 4yL，12. 2yL超纯水，lyL质粒Puc-L模板。再加入2. 5yL醋 酸镁（280mM)。混合离心后，放入40°C，温育5min。涡旋震荡8-10次，短暂离心，放入放入 40°C，反应20min。取反应产物2ul放入18ul水中，用酚-氯仿法对DNA进行纯化。1.5% 琼脂糖凝胶电泳检测纯化DNA产物，结果筛选到一组引物，命名为L-F和L-R(图1)。
[0022] 实施例3 :RT-RPA的敏感性
[0023] 将靶基因克隆质粒Puc-Ls稀释100倍，再按10倍梯度稀释成10 2-10 9共八个 浓度，以此为模板，进行RT-RPA反应：采用TwistAmpRTexos试剂盒（TwistDx公司，英 国）。取29. 5μL反应缓冲液，分别加入下列组分：引物L-RPAF(lOmM)和L-RPAR(lOmM)各 2. 1μL，2. 6μLRPAexo探针（10mM)，1μLRNA酶抑制剂（5U)，7. 2μL超纯水，5μL标本 RNA模板。涡旋震荡8-10次，短暂离心。再加入2.5yL醋酸镁（280mM)。混合离心后，放 入Twista实时荧光检测仪中，反应温度为40°C，时间为20min。
[0024] 本实验中所建立的RT-RPA方法可以检测下限是lOcopies/ μ L，具有较好的敏感 性。
[0025] 实施例4 :RT-RPA的特异性
[0026] 以汉坦病毒、登革热病毒、呼吸道冠状病毒、鼻病毒、呼吸道合胞体病毒、甲型流感 病毒和乙型流感核酸为模板，用设计的RPA引物和exo探针进行RT-RPA实验。结果对上述 毒核酸都没有荧光信号检出，表明建立的RT-RPA方法具有较好的特异性。。
[0027] 实施例5 :临床标本检测
[0028] 收集94份发热伴血小板减少综合征病毒感染临床样本，所有标本都通过细胞培 养进行病毒分尚。
[0029] (1)病毒RNA提取
[0030] 采用酚氯仿法提取病毒RNA，具体步骤：1.取血清标本100μL，加入含有200ul水 饱和酚的1. 5mlEP中，剧烈震荡混匀，静置3min，加入200ul氯仿，充分震荡混匀，12000g 室温离心15分钟。2.吸取上清液，加入两倍上清体积的异丙醇，再加入1/10上清体积3M 醋酸钠约40ul，充分混匀后-20°C静置2h;取出于4°C下，12000g，离心20min。3.弃上清， 加入75%乙醇lml，4°C，12000g，离心20min。4·弃上清，室温干燥，加入40ulDEPC水溶解 RNA〇
[0031] (2)RT-RPA反应：采用公司的TwistAmpRTexos试剂盒（TwistDx公司，英国）。取 29. 5yL反应缓冲液，分别加入下列组分：引物L-RPAF(lOmM)和L-RPAR(lOmM)各2.lyL， 2. 6μLRPAexo探针（10mM)，1μLRNA酶抑制剂（5U)，7. 2μL超纯水，5μL标本RNA模板。 涡旋震荡，短暂离心。再加入2.5yL醋酸镁（280mM)。混合离心后，放入Twista实时荧光 检测仪中，反应温度为40°C，时间为20min。
[0032] 结果94份临床样本，RT-RPA检测阳性的有76份，阴性18份，结果与病毒分离结 果完全一致。
【主权项】
1. 一种基于反转录-重组酶多聚酶扩增的发热伴血小板减少综合征病毒检测试剂盒， 其特征是试剂盒由RT-RPA反应体系、RNA酶抑制剂、L片段阳性质粒Puc-L、阴性质控品、L 片段RPA引物和exo探针组成，L片段RPA引物和exo探针为： L-F，5'-TCTATAAACATAAACTCATCCAATGATGCCAAG-3'； L-S,5'-ATCAGATGACCTAGACTCAGATTTAGAACTGA-3'； L-exo-probe,5'-TTGGTTCATGCCAGCCAAATTCCACAGAT[dT-FAM]CA[THF]T[dT-BHQ] GGGCTGCCATTTCCATG[3'-block]〇2.根据权利要求1所述一种基于反转录-重组酶多聚酶扩增的发热伴血小板减少综合 征病毒检测试剂盒的制备方法，其特征是由以下步骤构成： (1) 病毒核酸提取：采用酚氯仿法提取病毒RNA，具体步骤：取临床血清标本或病毒培 养物核酸100μL，加入含有200ul水饱和酚的1. 5mlEP中，剧烈震荡混匀，静置3min，加入 200ul氯仿，充分震荡混匀，12000g室温离心15分钟；吸取上清液，加入两倍上清体积的异 丙醇，再加入1/10上清体积3M醋酸钠35-45ul，充分混匀后-20°C静置2h;取出于4°C下， 12000g，离心20min;弃上清，加入75%乙醇lml，4°C，12000g，离心20min;弃上清，室温干 燥，加入40ulDEPC水溶解RNA，-70°C冰箱放置备用； (2) RT-RPA反应：采用TwistAmp RT exos试剂盒，取29. 5 μ L反应缓冲液，分别加入下 列组分：引物1-1?^卩1〇1111和1^-1?^1?1〇1111各2.141^，2.6 41^1?^61〇探针1〇1111，141^1?熟 酶抑制剂5U，7. 2 μ L超纯水，5 μ L标本RNA模板；涡旋震荡，短暂离心，再加入2. 5 μ L醋酸 镁280mM。混合离心后，放入Twista实时荧光检测仪中，反应温度为40°C，时间为20min。
【专利摘要】本发明属于生物技术领域，具体涉及一种发热伴血小板减少综合征病毒(SFTSV)反转录-重组酶多聚酶扩增(RT-RPA)检测试剂盒及其制备方法。本发明涉及的检测试剂盒由RT-RPA反应体系、RNA酶抑制剂、SFTS病毒L片段阳性质粒Puc-L、阴性质控品、L片段RPA引物和exo探针组成。用特异性引物和探针，通过配制RT-RPA反应体系，置入Twista实时荧光检测仪进行实时荧光检测，建立了一种快速、敏感、特异的发热伴血小板减少综合征病毒等温实时荧光核酸检测方法。本发明涉及特异性RPA引物和exo探针在发热伴血小板减少综合征病毒感染临床鉴别诊断和病毒分离株鉴定中的用途。
【IPC分类】C12Q1/70, C12R1/93, C12Q1/68
【公开号】CN105296674
【申请号】CN201510875067
【发明人】祁贤, 宋勇春, 邢铮, 焦永军, 李志锋, 汤奋扬, 鲍倡俊
【申请人】江苏省疾病预防控制中心
【公开日】2016年2月3日
【申请日】2015年12月3日