一种发热伴血小板减少综合症布尼亚病毒检测试剂盒的制作方法
【专利摘要】本实用新型公开了一种发热伴血小板减少综合症布尼亚病毒检测试剂盒，属于生物医学检测设备领域，为解决现有技术中发热伴血小板减少综合症布尼亚病毒的检测设备结构复杂，检测速度慢、操作不便的问题。本实用新型包括盒体，盒体内水平设置反应池容置腔，反应池容置腔与盒体滑动连接；盒体内固定设置有八块互不连接的试剂瓶固定板，试剂瓶固定板水平设置并位于反应池容置腔的上方；相邻两个试剂瓶固定板之间均设置有试剂瓶，试剂瓶固定板与试剂瓶相接的侧面设置有凹槽，凹槽内设置有内螺纹；试剂瓶外壁相对的两侧固定设置螺杆，螺杆与凹槽配合连接。本实用新型结构简单、使用方便、成本低，利于广泛适用。
【专利说明】一种发热伴血小板减少综合症布尼亚病毒检测试剂盒
【技术领域】
[0001]本实用新型涉生物医学检测设备【技术领域】，特别涉及一种发热伴血小板减少综合症布尼亚病毒检测试剂盒。
【背景技术】
[0002]自2004年以来，我国多省份陆续发生了发热伴出血，白细胞减少及血小板减少，多脏器受损的病例。病人多来自华中山区，农业区，流行时间为每年4到8月份，与节肢动物活动繁殖期相吻合。病例都有明确的蜱虫叮咬历史，其发病死亡率达到129Γ30 %。在2009年，在河南一份发热伴血小板减少综合征病例标本中分离到一株新型布尼亚病毒。后又在2010年分离到20株同种病毒。经相关基因组生物信息学分析和电子显微镜形态学研宄，该新型病毒属于布尼亚病毒科白蛉病毒属的一种新病毒，命名为发热伴血小板减少综合症布尼亚病毒，即SFTSV。
[0003]必须尽可能的以最快速度获得精确的定性诊断结果，及时为患者制定正确的治疗方案，否则，误诊，延误，就会导致病情的延误和错误的治疗方案，甚至错过治疗时机，造成病人死亡。所以，目前急需能快速、精确的检测这些主要病原体的方法，并且要求这种检测方法操作简便，成本低廉，适于农村，山区等欠发达地区有限的医疗资源和人员、设备条件，还要具有良好的灵敏度和高度的特异性。
[0004]根据卫生部2010年发布的《发热伴血小板减少综合征诊疗方案》，我国检测新型布尼亚病毒SFTSV的检测方法主要有:(1)血清中特异性抗体的检测；(2)病原体核酸的PCR检测；(3)病毒分离培养等方法。传统的血清学检测方法和病毒分离培养法。这些检测法本身大都需要数周时间才能获得准确的结果，完全无法及时对发病病患做出及时的诊断，且大都要求据有相当水准的实验技能和一些精密的诊断仪器。因此无法满足在农村，山区等条件艰苦地区开展。此外，由于患者血清中病毒血症的发生要大大早于病毒的特异性抗体的出现，因此相比于传统的血清学检测方案，基于核酸检测的PCR技术可以在更早的阶段对病原体做出精确的诊断。但是，PCR检测技术需要需要昂贵的设备和试剂，荧光定量PCR更是需要昂贵的探针和复杂的操作步骤，对人员的操作水平也有较高的要求，不适于在乡村，山区，县一级卫生院等一线采用。
实用新型内容
[0005]为了解决现有技术中发热伴血小板减少综合症布尼亚病毒的检测设备结构复杂，检测速度慢、操作不便的问题，本实用新型提供了一种发热伴血小板减少综合症布尼亚病毒检测试剂盒。
[0006]本实用新型的技术方案为:
[0007]一种发热伴血小板减少综合症布尼亚病毒检测试剂盒，包括盒体，所述盒体内水平设置反应池容置腔，所述反应池容置腔与所述盒体滑动连接；所述盒体内固定设置有八块互不连接的试剂瓶固定板，所述试剂瓶固定板水平设置并位于所述反应池容置腔的上方；相邻两个所述试剂瓶固定板之间均设置有试剂瓶，所述试剂瓶固定板与试剂瓶相接的侧面设置有凹槽，所述凹槽内设置有内螺纹；试剂瓶外壁相对的两侧固定设置螺杆，所述螺杆与所述凹槽配合连接。
[0008]作为优选，所述反应池容置腔上设置有把手。便于拉出所述反应池容置腔，以便各试剂瓶中的试剂落入反应池中。
[0009]优选的，各所述试剂瓶固定板位于同一水平位置。
[0010]优选的，试剂瓶一中放置有2.5uL的扩增检测反应液；试剂瓶二中放置有2uLdNTP ;试剂瓶三中放置有扩增检测用引物；试剂瓶四中放置有luL浓度为8U/y 1的BstDNA聚合酶:试剂瓶五中放置有luL反转录酶；试剂瓶六中放置有luL荧光染料；试剂瓶七中放置有12.5uL ddH2Oo其中扩增检测反应液由水、200 mmol/L Tris-HCl (pH 8.8),100mmol / L KCl、80mmol/ L MgS04、100 mmol / L (NH4)2S04和 8 mol/ L Betaine 组成；试剂瓶三种的扩增检测用引物由5pmol的F3/B3外引物、40pmol的FIP/BIP内引物和20pmol的LF/LB环引物组成.试剂瓶六中的荧光染料为1/1000倍浓度的SYBR GREEN I荧光染料或3 mmol / L轻基萘酸蓝(Hydroxy naphthol blue, HNB)。另外，各试剂瓶密封。
[0011]优选的，所述盒体由透明材料制备而成。
[0012]本实用新型试剂盒的主要测试原理为:
[0013](1)针对特征保守序列设计了特异性检测引物:以SFTSV病毒Μ片段上的高度保守序列为检测目标，设计了一套特异性引物组，引物组内含6条引物(包括F3/B3外引物、FIP/ΒΙΡ内引物、LF/LB内引物)，用于识别检测目标片段序列上的8段特征序列(分别是F3c/B3c片段、F2c/B2c片段、F1/B1片段、LFc /LBc片段)。由于本检测方法为引物组内的6条引物针对8段目标序列进行共同识别后才能启动扩增反应，因此其检测特异性比基于PCR技术的检测法更高。
[0014](2)环介导扩增反应机制为:如果引物组内所有引物都与目标靶片段实现特异性结合，则在具有高度链置换活性的DNA聚合酶的参与下，链置换延长反应就得以启动，释放出单链DNA，随即成为进一步的DNA合成的模板，并形成初始的茎环DNA结构。随后，一系列的链置换反应和颈环结构逐次启动，实现了高速的特征性DNA扩增。极微量的模板DNA可以在很短时间内，模板量可达到109拷贝数的数量级。整个反应过程都在60°C?65°C内的恒温条件下进行。
[0015](3)通过在反应体系中添加荧光染料，使扩增检测的结果可以通过肉眼直接观察:在反应体系中添加1/1000倍浓度的SYBR GREEN I荧光染料或3 mmol / L羟基萘酚蓝(Hydroxy naphthol blue, HNB)，则随着特异性扩增反应的进行，双链DNA等扩增产物不断积累，这些积累的扩增反应产物可以使SYBR GREEN I染料在可见光下由暗黄色变为亮绿色，颜色变化显著，因此本检测方法的检测结果可在可见光下直接由肉眼判断反应结果。
[0016]使用本实用新型发热伴血小板减少综合症布尼亚病毒检测试剂盒进行测试时，首先由待检测血清标本中提取RNA溶液，并将5uLRNA溶液放入反应池；将所述反应池容置腔从盒体中拉出，向所述反应池容置腔中放入冰块并将装有RNA溶液的反应池放入反应池容置腔中，然后将反应池容置腔推入盒体至反应池位于试剂瓶一的正下方，旋转试剂瓶一至其开口端朝下，将密封盖(或密封片)打开，试剂瓶一中的扩增检测反应液进入反应池，待试剂瓶一中的溶液不再滴下时，继续拉出反应池容置腔，使得反应池位于试剂瓶二的正下方，依此类推，直至试剂瓶七中的试剂进入反应池。将反应池由反应池容置腔拿出并放入60°C?65°C的水浴中恒温处理40min，升温至80°C?85°C以终止反应，可见光目视观察反应体系的颜色，进行以下判断:若反应体系的颜色变成略混浊的亮绿色，则是阳性；若反应体系的颜色不变，仍保持清澈透明的暗黄色，则为阴性。
[0017]本实用新型的有益效果为:
[0018]本实用新型的发热伴血小板减少综合症布尼亚病毒检测试剂盒，结构简单、使用方便、成本低，利于广泛适用。
【专利附图】
【附图说明】
[0019]为了更清楚地说明本实用新型实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本实用新型的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0020]图1为本实用新型发热伴血小板减少综合症布尼亚病毒检测试剂盒的立体结构示意图；
[0021]图2为图1的纵切截面结构示意图；
[0022]图3为本实用新型发热伴血小板减少综合症布尼亚病毒检测试剂盒中试剂瓶固定板的结构示意图；
[0023]图4为本实用新型发热伴血小板减少综合症布尼亚病毒检测试剂盒中试剂瓶的结构示意图；
[0024]其中，1-试剂瓶固定板；11_凹槽；21_试剂瓶一 ；22_试剂瓶二 ；23_试剂瓶三；24-试剂瓶四；25_试剂瓶五；26_试剂瓶六；27_试剂瓶七；28_螺杆；3-盒体；4_反应池容置腔；41把手。
【具体实施方式】
[0025]实施例
[0026]如图1、图2、图3、图4所示，一种发热伴血小板减少综合症布尼亚病毒检测试剂盒，包括盒体3，盒体3整体呈长方体型，盒体3由透明材料制备而成。
[0027]盒体3内部水平设置反应池容置腔4，反应池容置腔4与盒体3的内壁滑动连接，反应池容置腔可以推入或拉出盒体3，为了方便拉出或推入，在反应池容置腔4上设置把手41ο
[0028]盒体3内部设置有七个试剂瓶，分别是试剂瓶一 21、试剂瓶二 22、试剂瓶三23、试剂瓶四24、试剂瓶五25、试剂瓶六26、试剂瓶七27，每个试剂瓶均由密封盖或密封片密封，每个试剂瓶相对的设置两根螺杆28。试剂瓶一 21中放置有2.5uL的扩增检测反应液；试剂瓶二 22中放置有2uLdNTP ;试剂瓶三23中放置有扩增检测用引物；试剂瓶四24中放置有luL浓度为8U/ μ 1的Bst DNA聚合酶:试剂瓶五25中放置有luL反转录酶；试剂瓶六26中放置有luL荧光染料；试剂瓶七27中放置有12.5uL ddH20。其中扩增检测反应液由水、200 mmol/L Tris-HCl (pH 8.8),100 mmol/ L KCl、80mmol/ L MgS04、100 mmol/ L(NH4)2S0jP8 mol/ L Betaine组成；试剂瓶三种的扩增检测用引物由5pmol的F3/B3外引物、40pmol的FIP/BIP内引物和20pmol的LF/LB环引物组成.试剂瓶六中的荧光染料为1/1000倍浓度的SYBR GREEN I焚光染料或3 mmol / L轻基萘酸蓝(Hydroxy naphtholblue, HNB)ο
[0029]盒体3内部间隔设置八块试剂瓶固定板1，试剂瓶固定板1与盒体内壁固定连接。八块试剂瓶固定板1位于同一水平位置并均处于反应池容置腔4的上方。相邻两块试剂瓶固定板1中间放置试剂瓶，试剂瓶固定板1与试剂瓶相接的侧面上设置凹槽11，凹槽11内设置内螺纹，该凹槽11与试剂瓶上的螺杆28配合连接。各试剂瓶被架设，且每个试剂瓶均可旋转至少180°。
[0030]使用本实用新型发热伴血小板减少综合症布尼亚病毒检测试剂盒进行测试时，首先由待检测血清标本中提取RNA溶液，并将5uLRNA溶液放入反应池；将反应池容置腔4从盒体3中拉出，向反应池容置腔4中放入冰块并将装有RNA溶液的反应池放入反应池容置腔4中，然后将反应池容置腔4推入盒体3至反应池位于试剂瓶一 21的正下方，旋转试剂瓶一 21至其开口端朝下，将密封盖(或密封片)打开，试剂瓶一 21中的扩增检测反应液进入反应池，待试剂瓶一 21中的溶液不再滴下时，继续拉出反应池容置腔4，使得反应池位于试剂瓶二 22的正下方，依此类推，直至试剂瓶七中的试剂进入反应池。将反应池由反应池容置腔4拿出并放入60°C?65°C的水浴中恒温处理40min，升温至80°C?85°C以终止反应，可见光目视观察反应体系的颜色，进行以下判断:若反应体系的颜色变成略混浊的亮绿色，则是阳性；若反应体系的颜色不变，仍保持清澈透明的暗黄色，则为阴性。
【权利要求】
1.一种发热伴血小板减少综合症布尼亚病毒检测试剂盒，包括盒体，其特征在于:所述盒体内水平设置反应池容置腔，所述反应池容置腔与所述盒体滑动连接；所述盒体内固定设置有八块互不连接的试剂瓶固定板，所述试剂瓶固定板水平设置并位于所述反应池容置腔的上方；相邻两个所述试剂瓶固定板之间均设置有试剂瓶，所述试剂瓶固定板与试剂瓶相接的侧面设置有凹槽，所述凹槽内设置有内螺纹；试剂瓶外壁相对的两侧固定设置螺杆，所述螺杆与所述凹槽配合连接。
2.如权利要求1所述的发热伴血小板减少综合症布尼亚病毒检测试剂盒，其特征在于:所述反应池容置腔上设置有把手。
3.如权利要求1所述的发热伴血小板减少综合症布尼亚病毒检测试剂盒，其特征在于:各所述试剂瓶固定板位于同一水平位置。
4.如权利要求1所述的发热伴血小板减少综合症布尼亚病毒检测试剂盒，其特征在于:试剂瓶一中放置有2.5111的扩增检测反应液；试剂瓶二中放置有2111x1^1？；试剂瓶三中放置有扩增检测用引物；试剂瓶四中放置有1此浓度为8口/ V 1的8社0嫩聚合酶:试剂瓶五中放置有1此反转录酶；试剂瓶六中放置有1此荧光染料；试剂瓶七中放置有12.5111細20。
5.如权利要求1所述的发热伴血小板减少综合症布尼亚病毒检测试剂盒，其特征在于:所述盒体由透明材料制备而成。
【文档编号】C12R1/93GK204224600SQ201420643956
【公开日】2015年3月25日 申请日期:2014年10月31日 优先权日:2014年10月31日
【发明者】杨国樑, 刘岚铮, 韩秀云, 王春荣, 赵红, 吕燕, 张雯 申请人:济南市疾病预防控制中心