专利名称：检测新布尼亚病毒的试剂盒和寡核苷酸的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种检测新布尼亚病毒的试剂盒和寡核苷酸，尤其是利用SYBR Green荧光定量PCR方法对生物样品中新布尼亚病毒进行检测。属生物技术领域。
背景技术：
新布尼亚病毒(Novel Bunyavirus)属于布尼亚病毒科(Bunyaviridae),白蛉热病毒属(Phlebovirus)。病毒基因组包含三个单股负链RNA节段(L、M和S)。新布尼亚病毒导致发热伴血小板减少综合征，主要临床表现为高热，伴乏力、明显纳差、恶心、呕吐等，部分病例有头痛、肌肉酸痛、腹泻等。少数病例病情危重，出现意识障碍、皮肤瘀斑、消化道出血、肺出血等，可因休克、呼吸衰竭、弥漫性血管内凝血(DIC)等多脏·器功能衰竭死亡。新布尼亚病毒是我国新发现的一种布尼亚病毒，曾在河南、湖北、山东等省的山区和丘陵地带发现病例。目前已从患者以及蜱中分离到了该病的病原体，提示可以经蜱叮咬传播，但直接接触急性期病人血液，也会导致感染，人群普遍易感。本病尚无特异性治疗手段，主要为对症支持治疗。目前，通过病毒分离、血清特异性IgG抗体、血清特异性总抗体等方法来确诊新型布尼亚病毒感染。病毒分离堪称病毒检测的“金标准”，但操作复杂，技术要求高，检测周期长，无法及时为临床诊断提供结果，且敏感性较差，病毒分离阴性并不能排除病毒的感染。血清学方法操作简单，但是存在较长“窗口期”，不利于早期诊断，而且敏感性较核酸诊断明显要低。病毒核酸是病毒感染最直接、最敏感和最特异的检测指标。PCR方法以其高敏感性、高特异性和快速简便等优势得到了广泛的应用。目前在临床检测中使用较多的是荧光定量PCR，荧光标记探针的使用进一步提高了检测的敏感性和特异性，但是成本相对较高。而SYBR Green实时定量检测法成本较低，又同时实现了反应体系的全封闭和操作的全自动，减少了污染，提高了效率，而且不受生物个体因素影响，具有高度灵敏度、特异性，可以进行单个或成批样品的检测，适合基层单位的推广，已成为病毒的常规检测方法。本发明研究开发出一种检测新布尼亚病毒的SYBR Green实时定量检测试剂盒，该试剂盒使用方便，可广泛应用于新布尼亚病毒的临床及实验室检测。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一组特异性强、灵敏度高的用于检测新布尼亚病毒的寡核苷酸。本发明要解决的另一个技术问题是提供一种操作简单、结果准确的检测新布尼亚病毒的试剂盒。为实现上述目的，本发明采用以下技术方案本发明提供了一组检测新布尼亚病毒的寡核苷酸，由序列表SEQ ID No. I至序列表SEQ ID No. 2所示碱基序列的寡核苷酸组成；I)上游引物 5，-ATCCTCAACCTCTCTGTCACCATAC-3，(SEQIDN0:1)2)下游引物 5，-ACGGCTCCTTCTTCCCAAA-3’ (SEQ ID NO 2)本发明还提供一种检测新布尼亚病毒的试剂盒，包括以下试剂I) RT-PCR 反应液，其包括Takara ExTag HS Mix、PrimerScript PLUS RTaseJl冲液、上游引物、下游引物、Rox染料，其中上游引物是序列表SEQ ID No. I所示的核苷酸序列，下游引物是序列表SEQ ID No. 2所示的核苷酸序列；2) DEPC 水； 3)阴性对照不含布尼亚病毒的蜱cDNA ；4)阳性对照布尼亚病毒cDNA或含布尼亚病毒目的基因的质粒；其中，Rox (50 X )染料，购自宝生物工程(大连)，货号DROXOl。缓冲液(2X)(购自宝生物工程(大连)有限公司，货号DRR096A)含有dNTPMixture2 X conc, 4mM Mg2+, SYBR Green I 等；Takara ExTag HS Mix (购自宝生物工程(大连)有限公司，货号DRR096A)含有TaKaRa Ex Taq HS I. 25U/25 U I 和辅助蛋白。PrimerScript PLUS RTase (购自宝生物工程(大连)有限公司，货号DRR096A)内含反转录酶和RNase抑制剂。本发明还提供了一种检测新布尼亚病毒的试剂盒的使用方法I)提取待检样品的RNA，即模板RNA，可以利用现有技术中已知的方法或试剂盒提取；2)进行SYBR Green荧光定量RT-PCR扩增反应，该反应体系见下表表I反应体系
组分使用终浓度
2X缓冲液IX
Takara ExTag HS Mix0.06|_iM
RT-PCTK A PrimerScript PLUS RTase0.02‘u.M
液 10 JiM上游引物(F3)0.4 ^iM
10JiM 下游引物(B3)0.4 JiM
50XRox 染料Ix
RNA 模板2 [xL~4[iL
反应体系为20^iL~50^L,不足的用DEPC水补足3)反应条件扩增程序为42 V X5min，95 V XlOsec ；95 °C X5sec —60°C X20 34sec 循环 40 次；溶解曲线分析 95°C Xlsec，65°C X15sec,95°C Xlsec (0. 1°C /sec)。4)结果判定
首先判定实验结果是否有效。有效实验结果应同时符合以下2个条件(I)阴性对照无扩增曲线；(2)阳性对照Ct值< 36并有明显扩增曲线。在判定实验结果有效的情况下报告结果(I)阴性无Ct值或Ct值> 36，且无明显扩增曲线，报告为新布尼亚病毒SYBRGreen荧光RT-PCR检测阴性；(2)阳性Ct值彡35，并有明显扩增曲线，报告为新布尼亚病毒SYBR Green荧光RT-PCR检测阳性。本发明的优点是提供了一种高度灵敏性和特异性的新布尼亚病毒的检测试剂盒，在实验中实现了反应体系的全封闭和操作的全自动，减少了污染，提高了效率。克服了病毒分离方法的操作复杂，技术要求高，检测周期长，敏感性较差；血清学方法操作简单，但是存在较长“窗口期”，敏感性较核酸诊断低；荧光探针定量PCR成本相对较高的缺点。该方法可以进行单个或成批样品的检测，适合基层单位的推广，可广泛应用于新布尼亚病毒的临床及实验室检测。下面结合说明书附图和具体实施方式
对本发明作进一步说明，凡依照本发明公开内容所做的任何本领域的等同替换，均属于本发明的保护范围。
图I临床标本、其他病毒以及健康血清样本检测结果；图2检测新布尼亚病毒的试剂盒的特异性分析结果。
具体实施例方式实施例I :引物设计本方法下载已发表的全部新布尼亚病毒M基因序列，经过序列比对，找出保守的基因序列，采用Primer Premier 5. 0软件设计特异性引物，之后将拟选定的引物在GenaBank数据库中进行BI as t比较,确定筛选特异性的引物。确定后的引物为如序列表SEQID NO 1 和 SEQ ID NO 2 所示。实施例2 :检测新布尼亚病毒的试剂盒的组成(保存于_20°C )一、试剂盒的组成(保存于_20°C )I) RT-PCR 反应液，其包括Takara ExTag HS Mix、PrimerScript PLUS RTaseJl冲液(2X)、上游引物、下游引物、Rox染料(50X)，其中上游引物是序列表SEQID No. I所示的核苷酸序列，下游引物是序列表SEQ ID No. 2所示的核苷酸序列；2) DEPC 水；3)阴性对照不含布尼亚病毒的蜱cDNA ；4)阳性对照布尼亚病毒cDNA或含布尼亚病毒目的基因的质粒；其中，Rox染料(50 X )，购自宝生物工程(大连)，货号DROXOI。缓冲液(2X )(购自宝生物工程(大连)有限公司，货号DRR096A)含有dNTPMixture
2X conc, 4mM Mg2+, SYBR Green I 等；Takara ExTag HS Mix (购自宝生物工程(大连)有限公司，货号DRR096A)含有TaKaRa Ex Taq HS I. 25U/25 U I 和辅助蛋白；。PrimerScript PLUS RTase (购自宝生物工程(大连)有限公司，货号DRR096A)内含反转录酶和RNase抑制剂.
二、阳性对照品的制备阳性对照为布尼亚病毒目的基因合成的质粒，制备方法为用SEQ ID No. I和SEQID No. 2所示的引物序列对阳性样本进行PCR反应，回收PCR产物，获得高纯度的145bp的M基因保守区序列(SEQ ID No. 3),与pGEM-Teasy载体进行连接,转化E. coli CompetentCells DH5a感受态细胞，进行培养，使用质粒提取试剂盒提取，经PCR和序列测定鉴定后获得阳性重组质粒，作为阳性对照，命名为pGEM-Bun。10倍连续梯度稀释裂解液，测定Ct值，Ct值为22. (T28. 0均可作为阳性对照。实施例3 :检测新布尼亚病毒的试剂盒的特异性I、材料用于特异性评价的健康人血清样本及常见血液病毒DNA样本来自军事医学科·学院微生物流行病研究所，包括乙型肝炎病毒Ofepatitis B virus，HBV)，丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus, HCV),人巨细胞病毒(Human cytomegalovirus, HCMV), EB 病毒(Epstein-Barr virus, EBV);森林脑炎病毒 MDJOl 株的 DNA。2、方法采用本发明所述的SYBR Green荧光定量PCR检测试剂盒对健康人血清及常见血液病毒DNA样本检测，验证方法的特异性。3、结果健康人血清及常见血液病毒DNA样本检测结果均为阴性，说明该方法对上述病原体无交叉反应，表明该体系具有良好的特异性。参见图I。实施例4 :检测新布尼亚病毒的试剂盒的灵敏性试验I、材料新布尼亚病毒阳性对照品(人工制备含新布尼亚病毒核酸片段的质粒)。2、方法利用DEPC水对阳性对照品进行10倍梯度稀释(I X IO7, I X IO6, I X IO5, I X IO4, IX 103，IX 102copies/ml)，采用本发明所述的SYBR Green荧光定量PCR检测试剂盒进行检测，从检出的浓度中选择最低的那个浓度重复测定20次，若阳性率> 95%，即为该方法的分析灵敏度(copies/ml)。3、结果通过对梯度稀释新布尼亚病毒阳性对照品进行检测，确定本方法的最低检测限为
IX 103copies/ml。见图 2。实施例5 :检测新布尼亚病毒的试剂盒对临床样品的检测I、材料新布尼亚病毒(SFTSV)样本来源临床上诊断为发热伴血小板减少综合征(Severe fever with thrombocytopenia syndrome, SFTS)患者的血清样本50份，收集自河南省信阳市。临床诊断采用《发热伴血小板减少综合征诊疗方案》(《发热伴血小板减少综合征防治指南(2010版)》)所述标准具有流行病学史(流行季节在丘陵、林区、山地等地工作、生活或旅游史等或发病前2周内有被蜱叮咬史)，发热等临床表现，且外周血血小板和白细胞降低。利用德国QIAGEN公司RNAeasy Mini Kit提取样本病毒核酸。2、方法
对这50份临床样品，采用本发明所述的SYBR Green荧光定量PCR检测试剂盒进行检测，并利用基因测序方法对分析结果进行验证，即对PCR检测产物进行序列分析，并将所得序列和已有新布尼亚病毒序列进行比对，以对检测结果进行验证。3、结果取50份新布尼亚病毒血清样本进行检测，其中40例检测为阳性。同时，将扩增产物进行基因测序，经比对验证所得序列均为SFTSV基因组序列。见图I。显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无法对所有的实施方式予以穷举。凡是属于本发明的技术方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。·
权利要求
1.一组检测新布尼亚病毒的寡核苷酸，其特征在于由序列表SEQ ID No. I至序列表SEQ ID No. 2所示碱基序列的寡核苷酸组成；其中SEQ ID No. I为上游引物，SEQ ID No. 2为下游引物。
2.一种检测新布尼亚病毒的试剂盒，其特征在于，由以下组分组成 1)RT-PCR反应液，其包括TakaraExTag HS Mix,PrimerScript PLUS RTase、缓冲液、上游引物、下游引物、Rox染料；2)DEPC 水； 3)阴性对照不含布尼亚病毒的蜱cDNA； 4)阳性对照布尼亚病毒cDNA或含布尼亚病毒目的基因的质粒， 其中，上游引物是序列表SEQ ID No. I所示的核苷酸序列，下游引物是序列表SEQ IDNo. 2所示的核苷酸序列。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述RT-PCR反应液包括0.06 u MTakara ExTag HS Mix>0. 02 u M PrimerScript PLUS RTase、I X 缓冲液、0. 4 u M上游引物、0. 4 ii M下游引物和I X Rox染料。
4.一种检测新布尼亚病毒的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤 1)提取待检样品的RNA； 2)进行SYBRGreen荧光定量RT-PCR扩增反应，其中，使用的引物为序列表SEQ IDNo. I所示的上游引物和序列表SEQ ID No. 2所示的下游引物； 3)进行结果判定，无Ct值或Ct值>36，且无明显扩增曲线为阴性；Ct值< 35，并有明显扩增曲线为阳性。
全文摘要
本发明公开了一种检测新布尼亚病毒的试剂盒和寡核苷酸，具体涉及一组检测新布尼亚病毒的寡核苷酸，其具有序列表SEQ ID No.1至SEQ ID No.2所示的寡核苷酸序列，及含有这些寡核苷酸的试剂盒及其检测方法，本发明所述的试剂盒灵敏度高、特异性强、成本低、操作简便。
文档编号C12Q1/70GK102787177SQ20121032467
公开日2012年11月21日 申请日期2012年9月4日 优先权日2012年9月4日
发明者任彤, 刘艳华, 张丽杰, 江佳富, 王艺凯, 田洁, 贾娜, 郭惠琳 申请人:中华人民共和国北京出入境检验检疫局