专利名称：靶向基因dna分子探针的制备方法
技术领域：
本发明属于生物医学技术领域，涉及将基于计算机的生物医学信息学和实验室分子生物学结合起来以制备靶向基因DNA分子探针的方法。
背景技术：
人类基因组测序工程于1990年正式启动，经过多个国家的数百名科学家和工程技术人员的共同努力，于2001年发表了初稿，并于2006年最后完成，历时十六年，耗资上百亿美元。这一工程的完工，将第一个也是最重要的一个哺乳动物，即我们人类自己的整个基因组的图谱展现在我们眼前，其中包括所有22对常染色体(1-22)和两个性染色体(X，Y)
的DNA序列，共计大约32亿核苷酸碱基。同时揭示人类蛋白质编码的基因大约有二万至二万五千个，其核苷酸序列的总长度仅占整个基因组长度的1.9%。这些基因不均等地分散分布在基因组的各个角落，参见图I。此外，占基因组绝大部分的碱基是一些有序或无序的重复序列，有些重复序列具有明显的规律，比如，5-8个碱基循环出现构成到100-200个碱基的集团，然后这个集团又在不同的基因组中出现，由于此类DNA碱基可以在任意(无规律)基因组DNA中出现，如图2，因此，如果所制作的进行杂交的DNA分子探针中含有此类重复序列，则信号会在所有染色体基因或细胞中出现，所得结果就被混淆，这类杂交信号即被称为干扰信号或背景信号。因此，如何去除这些重复片段，成为一个问题。随着人类基因组测序工程的完成以及后基因组时代的到来，生物医学的科学研究和技术发展进入了一个前所未有的新时期，这对医疗保健的发展和进步提供了空前的机遇，对生物医学高科技的研究和应用也提出了巨大的挑战。生物医学基础研究也不再是一个独立的概念，而是时时刻刻都与医疗保健相关联。如何将基础研究的成果用于临床？如何开展具有明确医药用途的科学研究即基础与临床转化性的研究(transitionalresearch) 是目前每一位生物医学研究人员都在考虑的问题。由于基因的异常与多种疾病都相关，例如肿瘤，心血管疾病，遗传病，中枢神经退行性疾病，视网膜黄斑变性，血液病，代谢营养性疾病，自体免疫性疾病，内分泌性疾病如糖尿病，等等。另外，对于传染性疾病，如病毒，细菌感染，也要研究其基因结构，表达方式及蛋白产物，才能深刻地理解疾病的发生，发展和转归，才能进行更好的治疗，又如爱滋病(人类免疫缺陷病毒，Human immunodeficient virus, HIV),乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus, HBV),结核病(tuberculosis, TB)等等。在疾病的诊断上，用基因及其产物进行诊断，包括肿瘤(人类基因)和感染性疾病(微生物基因)，已显现广阔的应用前景。其结果更加准确，迅速，安全，可靠。基因诊断亦称分子诊断，是由人类基因组序列工程与其它致病性病源微生物和病源体的基因序列弄清楚以后所衍生出来的诊断领域，其历史虽然不长，已显示出强大的生命力。其发展速度非常快，其范围也囊括几乎所有医学领域。目前临床上已在使用的，以感染性疾病，肿瘤及心血管疾病最多。其中肿瘤病理学的“分子诊断”是一个重要的分支。根治肿瘤仍然是一世界性难题，但针对致癌基因的“靶向治疗”是目前最有效的肿瘤治疗战略之一。配合靶向治疗的“伴侣诊断”是目前国际上最新的肿瘤分子诊断方法。它通过对疾病分子标志物进行检测，对靶向治疗中病人的筛选及预后的观察起关键性作用。在过去的60年里，有关DNA的技术层出不穷，使得对DNA的检测成为可能，比如于1969年发明的荧光原位杂交(FISH)技术(Gall and Pardue，PNAS 1969)，1972年发明的分子克隆技术(Cohen, Chang and Hsu, PNAS 1972)以及 1985年发明的PCR技术(Saiki RK etal, Science 1985; Jeffreys, Wilson and Thein, Nature 1985)等等。此外，伴随人类基因组测序工程的进展，为了能够充分的分析，研究，分享和应用DNA序列的成果，计算机软件及基因网络系统得到了很好的开发。比如，1990年发明的基础局部搜索DNA同源序列的工具-比较基因组学的关键技术BLAST (Altschul SF et al, J. Mol. Biol. 1990)和2002年开始运行的UCSC基因组浏览器(Kent WJ and Colleagues, Genome Res. 2002)，都是很好的研究应用工具。这使得任何研究人员都能够再次利用并开发和发展DNA序列，并将其用到实际应用当中。本发明的靶向基因DNA分子探针的制备方法就是在分析，比较和应用以上这些技术的基础上诞生的。
发明内容
本发明的目的是提供将基于计算机的生物医学信息学和实验室分子生物学结合起来来制作具有特异性序列的DNA分子探针的方法，制备出的DNA分子探针能够与整个靶向基因的所有特异性DNA序列进行DNA-DNA杂交，起到准确探测、识别疾病基因和正常基因的作用。DNA分子探针的制备方法包括两大程序
_6] 第一程序利用基于计算机的生物信息学手段来获得靶向基因的特异性DNA序列，并设计出相应PCR引物第一程序包括以下步骤(I)在公共基因库上搜索到靶向基因的基因组位置，然后识别出该靶向基因的编码序列和非编码序列(即外显子和内含子的区域)，剔除掉其中的非特异性重复序列，获得覆盖整个靶向基因的特异性DNA序列，该特异性DNA序列为不连续的多个DNA片段；位于外显子的编码序列一般都是特异性序列，即该基因所特有的(在少数情况下，有些基因的外显子编码序列也会与其同一家族的其它基因序列有非常大的同源性，应有所注意，在设计探针时因避免使用)。位于内含子的非编码序列又分成特异性序列和非特异性序列，前者是该基因所特有的，在制作探针时应当保留，后者一般由有序或无序的重复DNA序列构成，在制作DNA探针时应当去除。下面列出的一些重复序列，在基因组的许多基因内含子的区域中都存在，应当避免用在探针里。重复序列I : tgaatttcccagcctccagaactatgggaaataaatttctgttgtttacaagtaaatcattttatgttattttgttacagaagcccaaaaagatgaagacatacaccagatcactccattctcttcttgcttgcatggtttctgaggatacgttggatgtaattctaatattctctataggtattttctttatggctcct重复序列2 aagctccagtatacctaaacaagtgcaaatttgtttaagtacagttatttgtggtagcattagtcattgttttcaatagcaagaagaaaaaggaaacaac重复序列3 catcaaaaatcggttaccataaaatcctaatagttgaagagatgtaatttcaattatttggtaaacctgaccttcattgtcaaagc重复序列4 ttttcctgtgtctctgcaaccacaggcccctctcctttctcttaataaagataccagtcattgagtttgaaaattgctaagagagtctgttgtaaatctt重复序列5 cttagcacaaaaaaaaatgacagatatgtgaagtggtagatatattaattagtttgatttgatcactccgctatgtgtataaatgtcaaaacaaacattg重复序列6 ·
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(I)以正常组织的基因组DNA为模板，利用第一程序的步骤(2)中设计出的PCR引物，用PCR方法扩增出第一程序的步骤(I)中确定的靶向基因的特异性DNA序列，扩增出的特异性DNA序列含有靶向基因的所有特异信息；(2)利用扩增出的特异性DNA序列制造特异性的DNA分子探针，该DNA分子探针能够与整个靶向基因的所有特异性DNA序列进行DNA-DNA杂交。第一步确定序列并剔出重复序列，1-2天，设计引物，1-2天；第二步PCR扩增目的基因1-2天，其实这时的步骤(I)扩增出的PCR产物已经能够直接用来标记探针和进行原位杂交实验了。但为了建立稳定的探针来源，使其永久地，不断地提供探针，将步骤(I)扩增出的PCR产物克隆，即将步骤(I)中扩增出的特异性DNA序列中每一个DNA片段均克隆到一个质粒载体上，克隆的质粒用作永久、稳定地特异性DNA序列来源，用PCR方法多次连续扩增所有质粒中克隆的DNA片段，其中每次扩增后的产物均进行稀释后再进行下次扩增，连续三次，最后一次扩增的产物即为未标记的DNA分子探针。装在质粒载体中的DNA比PCR产物DNA要稳定得多，将永远不会降解或丢失。克隆这一步大约需1-2周时间，再加上第一程序中确定序列并剔出重复序列需要1-2天，设计引物需要1-2天，以及第二程序中PCR扩增目的基因需要1-2天，这样总共只需不到3周的时间就可以建立某个靶基因的DNA探针的永久货源。而且，质粒DNA的扩增可以大规模进行，比PCR方法的产量和稳定性都要好，而且成本要低得多。本发明特异性强、周期短、效率高、成本低，可大规模生产探针、促进试剂盒的产业化、用于各种疾病分子病理诊断。在将DNA片段克隆到质粒中后，经小量扩增提取质粒中插入的DNA片段，进行鉴定，保证正确后，扩增大量提取质粒DNA。克隆的质粒将会提供永久的DNA来源。待所有DNA片段都获得克隆之后，每个克隆的质粒按插入片段的大小分别取出一小份混合到一起，在该质粒的插入片段的两端设计一对引物，或用质粒载体所特有的引物，比如M13引物或T7和SP6引物，用PCR的方法同时扩增所有的插入片段，其产物经过凝胶电泳检测，产物的大小范围与最初确认的DNA片段的大小范围应当一致，或者对扩增的产物进行测序保证所克隆片段的正确。产物经过I :1000稀释后，再次用PCR扩增，总共三次，以达到稳定的产物。最后一次PCR的产物就作为未标记的探针。此次PCR产物经过纯化后，用TE缓冲液(IOmM, pH 8. 5)按每批所需要的量分装后，储藏到_20°C冰箱。在第二程序中，将第一程序获得的靶向基因的特异性基因组DNA序列(genomicDNA sequence of targeted gene,已不含有非特异性重复序列，或仅含有微量成分,小于0.1%)，纯度达99. 9%，用分子生物学的分子克隆的方法，将每一个上面纯的DNA序列都克隆了，所得结果，我们将获得与众不同的，已经过处理过的，包含靶向基因所有特异信息的DNA片段。用这一 DNA (含多个小的DNA片段)来制作特异性很高的DNA探针(其特征是虽然由多个小的DNA片段组成，但合起来覆盖整个靶基因)，用于疾病如肿瘤病理分子诊断，即在病理组织细胞切片和细胞涂片上的原位杂交方法的诊断包括荧光原位杂交和非荧光的显色原位杂交。该DNA探针不同于其他种类的探针，不是RNA探针(RNA-RNA杂交)，也不是cDNA探针(cDNA-RNA,或cDNA-DNA杂交)，也不是仅仅与基因组DNA中的靶基因的某个特定编码序列的杂交，而是与整个靶基因的所有特异性DNA序列的DNA-DNA杂交，包括编码序列和非编码的特异序列。本发明用克隆的办法加上测序，保证了所做的探针的序列准确无误，并且通过质粒的扩增，可得到大量且稳定的DNA探针来源，一旦做好以后，将给标记探针永久提供DNA模板，且保持序列不会改变，而且本发明在第一程序的步骤(I)中就将非特异性重复序列剔出了，因此不需要反复抽提和FISH的测试(参见参考文献1、2、3)，本专利方法周期短，成本低，适合于大规模生产探针。
附图I显示了基因组中基因分散在不同的区域中，基因和基因之间有大片的非基因区段，图示人类Y染色体0-59Mbp区段中散布着19个基因，每个基因之间有较大的空间。附图2为本发明所列的重复序列I (200bp)作为问讯DNA序列到基因数据库去扫描后，所得结果显示，在人类基因组中有为数众多染色体在不同程度上都与这一重复序列有同源性(74%-100%)，其部位与长短大多没有规律，这是引起DNA-DNA杂交的主要背景来源。附图3为DNA靶向分子探针技术的总体路线图。附图4为pCR 2. 1-T0P0 质粒载体多克隆位点DNA序列图谱。
具体实施例方式下面结合附图来进一步阐述本发明的结构。具体实施例人类PTEN DNA探针的制作人类 PTEN (Phosphatase and Tensin homo log deleted from chromosome ten)基因是一个肿瘤抑制基因，是继P53之后第二个在肿瘤中最常发生突变的基因。该基因在正常胚胎发育和保持染色体的稳定性方面起非常重要的作用。该基因在许多疾病的病理发生上起非常重要的作用，例如糖尿病(diabetes)，呆小症(autism),以及几乎所有肿瘤均有关，已明确的肿瘤有神经胶质瘤，乳腺癌，结肠癌，肺癌，前列腺癌，子宫内膜癌，神经胶质母细胞瘤和黑色素细胞瘤等等。参见图3，整个制备方法包括两大程序，具体实施如下一、特异性DNA序列的获取，引物设计我们研制的PTEN基因探针，位于第10染色体长臂第23条区带(10q23)覆盖包括整个PTEN基因组位点在内的大约320kb的基因组区段，经过反复整合及筛选，去除非特异性DNA序列，最后选择大小不等的多片段基因序列(从150bp到4666bp)，总的片段数目达到126个，其净长度为112kb。下表显示了 PTEN基因片段的组成
权利要求
1.一种靶向基因DNA分子探针的制备方法，其特征在于包括第一程序，其利用基于计算机的生物信息学手段来获得靶向基因的特异性DNA序列，并设计出相应PCR引物； 第二程序，其根据第一程序的设计应用分子生物学手段来制造DNA分子探针；所述第一程序包括以下步骤 (1)在公共基因库上搜索到靶向基因的基因组位置，然后识别出该靶向基因的编码序列和非编码序列，剔除掉其中的非特异性重复序列，获得覆盖整个靶向基因的特异性DNA序列，该特异性DNA序列为不连续的多个DNA片段； (2)给靶向基因的特异性DNA序列中每一个DNA片段设计出成对PCR引物，引物长度为18-25个碱基； 所述第二程序包括以下步骤 (1)以正常组织的基因组DNA为模板，利用第一程序的步骤(2)中设计出的PCR引物，用PCR方法扩增出第一程序的步骤(I)中确定的靶向基因的特异性DNA序列，扩增出的特异性DNA序列含有靶向基因的所有特异信息； (2)利用扩增出的特异性DNA序列制造特异性的DNA分子探针，该DNA分子探针能够与整个靶向基因的所有特异性DNA序列进行DNA-DNA杂交。
2.根据权利要求I所述的靶向基因DNA分子探针的制备方法，其特征在于在第二程序的步骤(2)中，将步骤(I)中扩增出的特异性DNA序列中每一个DNA片段均克隆到一个质粒载体上，克隆的质粒用作永久、稳定地特异性DNA序列来源，用PCR方法多次连续扩增所有质粒中克隆的DNA片段，其中每次扩增后的产物均进行稀释后再进行下次扩增，连续三次，最后一次扩增的产物即为未标记的DNA分子探针。
3.根据权利要求2所述的靶向基因DNA分子探针的制备方法，其特征在于在用PCR方法第一次扩增所有质粒中克隆的DNA片段时，扩增的产物经过凝胶电泳检测，产物的大小范围与第一程序的步骤(I)中确定的对应DNA片段的大小范围应当一致，或者对扩增的产物进行测序保证所克隆片段的正确。
4.根据权利要求I所述的靶向基因DNA分子探针的制备方法，其特征在于设计靶向基因为人类肿瘤抑制基因-PTEN基因，通过第一程序的步骤(I)获得的特异性DNA序列为126个长度在150bp-4666bp的特异性DNA片段。
5.根据权利要求4所述的靶向基因DNA分子探针的制备方法，其特征在于 PTEN基因的特异性DNA序列中一个DNA片段的序列为CATGAGGTGGTATTCATTTATTCATATAGTTAGAACAAAAAATATTTAAAATATTGAGGTAGAAACAAATTAGTCTCTTTTTAATTAAAAGCCAGATTACTTGTTAGAGTAACATTTTCCCAAATGAGGTAAAATTGTTGCGACTGTTAAACTTAAGGAAATTTTGATCTAGGTGTGGTATATACCTTCTTGTGGGGTGCTAATGAAAACAGGGATGGCAAAAATATTTTGTTTGTGAGTGTATGCATTTATGCTTTTTGACAACCTAAGAAACACTCTTACATCTGAGTATCTTTCATGGACTAGCTGTAGGAAATCTATATAAAATAGCTTAGTATACTGAAAGTATGACATAGTTTTACATATCTAGATTGTGGTTGTGATTATATATAATACTATAAAATATGCTAACGTGCTGCTTAATAATACTATTTGGATTTTTTTTAATACTGAAAAGGTCACACAGATTGTGATTATTGTGTAGTGTCCAAGAACTAAGGCCTACCATCTGTTACTCAAATGTATGAAAAAGTTAAGATAATTTAGTGATATAAGTGGTTTTGACACCACTGTTTTTGGAATAATCTAATTATGATTTTTATAAAGACTAATATCAAATTTTAAACGTTTGCAAAAATGAAACCTAATAGTTATACTGTTATTTATATTTTTCTATTACAATACAGATACTGGCTGAGAACTAAAGATTGTGTAATAAACGCCTGGCCTTCAGTCATTTGGTTTTTTTTTTCCCTCGATTGTTTGGATAGTTAACTGGACATCATGTTTTAACTTGAGAAATTAAGTTATACAAGATTTTGATATTTTAAACTAGTTTTCCTAACTGGTTGAGATATATAAGAATTTAGTATTACAGGACTCAATCAGGGAACTGATTTAATAAGAATTTCTTAAAAATTTGTTTAAATATTTTTCAAGTTCTTTTCTTCATCTTCTACAACTTAATTCTTGTCTGTATGCAAATGAGCTTCCCCATTTAAAATTTTGCTGTTGCATTTTAGGCCACTATAGAAGTTGTTTCTTTAATTTTCACTCACAAGAATTTGGTCTTACCAAATTGTGTAAATCTTTAAAATTGTGTATTTGGCTTAATATTATAGAATCTGATTGATTTAATCTACCTTGTTTCATTTAGTATGTTGACATTTTCTTGAGAAATTTGTTATGCCAAATGATTAACATAATAATATTTTAAGTTTAGATATGATTTTGAATTTACATTTTCAAATGCAACTTTGTGTCTGTGGCC 由此设计出两对PCR引物，其中一对引物的序列如下正向引物5’ -AAACGCCTGGCCTTCAGTCA-3’逆向引物5’ -GGCCACAGACACAAAGTTGCAT-3’ 另外一对引物的序列如下正向引物5’ -GGGTGCTAATGAAAACAGGGATGGC-3’逆向引物5’ -CCAAATGACTGAAGGCCAGGCG-3’， PTEN基因的特异性DNA序列中另外一个DNA片段的序列为GCTAGTAGTTTTTAAAGTAATCCTTTTTCCTTTAATTATGTAGTTGTTGAACTGTTGGGAGTTACTTTTCTCTTACTATTTTGTTATTTAATGTATTCTTTGACCTTATGCTTTTTTATTCTAAAGCTGCTTTTATTATAGTCAGATATGATGAAGTTAAATGTACAATGTAAAATTGCAAATTTCCAACGAGCTATACAAACTTAAATATTTCTAAGTAAAGAAAATAGGGCTGACTCTAAGGTTCTTTGATCCATGTGTTGCATTCTTTTCTAGGCCCTAAATTTGCTATGCCAGCCTGTTGAATTAAAGTGCTTTATTTATCTAAATTAGAAACTTGTATTAAAGTGAAGTTTTAGAAAAAAAGAAACAAAATCGGAATGGAGTTTTAGGTTAGCCCAGAGATGGGAAGATGCCAAGAAGGTAGCTTTAGTGGATTCTGAATTTTTTGGTTTTGTTTTGTTTTTAGGGCAGGCAAATGTAATTACAAAAGGGTTCTAGGAATAGATTGCTGTGATTTTTTTTCTGTTTGCATGATTTTACAGTTTGCTTTGCCTCTCACTTTTGAATGCAGAATAAAATGTCAAGGCCTTATTTTTTTTTAAATTCTTAAGAAATTTAAGATTTGACTGTTAATTCCTTTTGAAATATGGGATATTTTGAGATACCAATTATTTAAGACAAATAGGACTCATTGTTACAATTCAGTTGAATAAGGCTTATGATGTTTATTTCAGTATATGAATGAAAACTATGTGCTTATTGTACTTAAGAAAATTTCTTTTATTAAAAACATGACTAAAGAGAATTTTAAAAATCACCCACTGTCCTACTTCTCTAAAACTTAATGTTTTCATATTAGCTTCCAGTTTTGTTCATATGCATATACTTTAAAACCTAGTTCATGGTGAACTTAAGAGGGTGTTCTTTTTAAAAAACAATTTCCATTGCACTTTGTCGTTGCCTTAATTAAATGGTGAAATCATCAGAAATATTTATTTTCCTATACTTATACATTTATTAAGCTTGTTTCCATTTTTTTATTTTGTGATTTTTTAAGTGGATTTAAGATAACCTAAACATTAGAGAGGATTTTCATGGTTTTGATTCATGAAATCATAATGTTATACAAACCTAACTGAAGTGTTAGAGCCTTGAAGATTTTTCCCCCGAATTACATATAGTAACTCTACTTGTATTTAATACTGAAAGCATATTTTACTTATTTAAGTGAGACAAAGTAAAATTTAGCTGAATACTTTAGATCTATCATTTCCTTTTCCTGTTGTAAGAACATTACATTGTGTTGAAATTAAAGTGGATATAGAAGGTAATTAGAATAAACTGCCACATCATTTTTATAGTAAAGTGGTAATAACACTATTGCTTTCTGTTTTTTTAATCAGAAGGAGTATGGGCTTATAATGATGTTACTGTTCCCTGAAGCATATTTTGAATGATACGGTTTATATTTGCACAGTTGCCCAGGTAATCATTGTGATATTAATTGATCAATTTGCTATTTATTTGCGTTTTAAATCAGTACTAGTATTTGTGCTTAAAAATTTTGCATATGTTTTATCAGATTTAATTTTTAAGTGTCAGATACTAAAACAAATAACCTTAAC由此设计出的PCR引物的序列如下正向引物5’ -AGCCCAGAGATGGGAAGATGCCA-3’逆向引物5’ -AGGCAACGACAAAGTGCAATGGA-3’， PTEN基因的特异性DNA序列中第三个DNA片段的序列为ACGAGAAACATCTTGCCAATTTTCAGATTAATCTGTGAGGAAAGTAGATTGGTTTACTAGACTCAGTTTGTAGACTTTGGTGAGAACTGAATTGGAGGCTATGAAAAAAATACCTTTTGGGCCTTTCTGAATAGACATATATACATAAATTATATCTCTTACATTAAGTGAGGCACATATGTAGGTGAGATTTTTACCTGAATATTAAAAGTTTAAAAGTCGTTACCTATTCTGTTTACTTAATAGTATTTAAAGGGTGTGAGAGGTGTTATGTGTTTCTGTCCCTTGTTTTTATTCCTATCCCTCCCATCTAACTGTTGGTACTCTTATCTTCCCAGGTATTAAACTTGTATGTTTTAAAAGCTTATTTACTTGTTGAAATGGTTAACTTAATTAGTTTTTTCTTTGAAGTTTCAGCCTAAATATTTTCTGTTTTTTTATATGTCCTTTAAATATGAAAATTCTACAGCTAATCATAATTAGTAATTGTACTTTTTCCCCTATTACAATAACTGGTTTCAT AATAAAATGGTATCCCTTCAATAACAAGCATTTATAGTAGTTTATTAAAACTAAGGGTGTTATCTATTCAAACCAAGCAATGCAGACTTACTGTTGACTCTG 由此设计出的PCR引物的序列如下正向引物5’ -TGGTGAGAACTGAATTGGAGGCT-3’逆向引物5’ -ACACATAACACCTCTCACACCCT-3’， PTEN基因的特异性DNA序列中第四个DNA片段的序列为TAAATTTTGATTGTTATTAGCAACTATAAAAGTTTTGCAGTTGGCTTATTGGAAAAAGAAAACCTCCTTGCCGGAGACGGAGACGCATTTGTATTAGAACTTTGTTTTCTGAGTACCTTACCTATAGTAGGTTTCAAATATTGGTGAATTAGTTGATGGTTAGGTCTGCATAATTACTGCGTATGGAAATTCTGGAACCCTATTTTTTCAAAATGCAGCTAATGTTGAGAGAATATGCACTAAATATTACTAGATCTTTGTTTTTCAAGATGCTGATATCCCTTAACATCTTCTGCACTTTACCTGTTTGAATATCTTTTTTGCTGTAAAAATTAGTGGCCTTATGTCTTTCTGCATAATTATAGAGTAGCCAAAACCTGTTTTAGGTTAATCACCTCTGGCAAAATAAATGATAAAAGCATAGCTTTTGTAAGCAGAATGATATTACAGAAGTTAACTTATAAATCTAAGTGTATTAAAGACACTTAGGAAATTTATGATAATGCTGGGTCAGCATTACAGTTTTAACTTTTTACAGTTTTTCATATGCTTTTTTTGTGATTTTGCTGTAGAAAATTAACAGTTGGCATTTGGCTTAGTTCAAGTATAATGCTGTTGACAAGTATATCTGACACGTCATTGAACTAATAATATTTTTGAAAGCTGATAGGTAAGTTATATCTATTTTGTTTCATTCGTCATTAGTGATCGGTCTTAGATGTTTTTAGCGAGAGCAAAACTGTAGAGGAA由此设计出的PCR引物的序列如下正向引物5’ -AACCTCCTTGCCGGAGACGG-3’逆向引物5’ -TCCTCTACAGTTTTGCTCTCGCT-3’， PTEN基因的特异性DNA序列中第五个DNA片段的序列为GACAAATTGTTCTTAAATAATGAACAGTTGGCACTTTTTCAACTGGAAAATTCAAGGAACTGCTCTTTCTGCTTTCTGCTCAATATGAATCTTCAATTTAGAAATGAGAGTCCATCATTAACAATTCAACATAGCTTATTAATAGGAAAAAAAAACCTAGTAACAAATGTAAAATCTTTGATTAAATGAGAAAGTCATAGAAGTTCATCAGATTTGTATTTAAAGCATGATTTCATTAGAAAAGTTGATAATAAGGATTTAACTGTGACATAATTGGAAAATACTTGTTTAAACTTAAAATTTTGAAAAGAAATGTAAATGTGATGTAACTTATGAATCAGTGGTTGAGTTTCTTTTTTGCTCACAAGAACCCTAACTGTGTGTTACTTGAAAGCACTGATGGAAATCAGGGAAAAAGCTCCAGAAGTTCCTACGAAATAAAATTAAATGATAAAGTCCTGGTATCTGCTAACTTGCCTTCCATTCCTGTTATCTTTTCTTCTTAGTCTGACTTCATTAATTCTTTCACCCTGGCTACTGGTTTAGCTCAGTGTTTTATGAGCCAGGCAGCTTCAGACTTTGCTTTTGATGCTCTTTGTTCATTACCTCTAAAGCTGTATTATCACTTTCATTTTATCATTAATGTTTCATGTATATGTTATAGTTTCATATTGTTACTGCAACTTTTACTTAGCTATAATTTAAAAAATATCTGTGATCTGTGGAAATAATTATTCTATGGCAGAAAAGTAGTTATTGCATTTTACTTTATAAGTTGTTTAAGGATAAGCATACCTATATATTAAGCACTACAAAGAAACTTTTACAATGGCTTTATTTTTAGCAAACCATCATAGTTAAAATAAGATTTAGTGTACATGTCAGGAACACAGTCTTATGAAATAAGGTTTAGGGAGCTATTTTTAGTTACTATATCCTACTTGAAAATTGTAGTTAAATTTCTAGCATATACCCTATTAATTTAGATGCAAGTACAGATTTGAGATAAGGTAGATACATTATTTGGATGTCAACTCGGAAGTTGTTCAAGAAAAGATATTTTGTTATTTAGATGTAACTTGGAACATATTTCTAGTGTTTCAAGTCATGATTGTATGCCTAGAACAGGCAATAAAAATTTACTTAGCTGGTAAAACAGCCACATTATTTCAAATATAGTTTAGTTATATTATGGATTAAATTGATTTTTGTGGACAGACTTTAGAACTTAATTGCTATTAATTACATTTTTTCTTTGGGACGGTATTTGTTCTTTGGTGAGAAAGGATTCTTGTAACACCTAAATCAAGACTGTCCAAACAT 由此设计出的PCR引物的序列如下 正向引物5’ -GGAACTGCTCTTTCTGCTTTCTGCT-3’ 逆向引物5’-GCAAAGTCTGAAGCTGCCTGGCT-3’。
6.根据权利要求I所述的靶向基因DNA分子探针的制备方法，其特征在于 在所述第一程序的步骤(I)中，剔除掉的非特异性重复序列能够为tgaatttcccagcctccagaactatgggaaataaatttctgttgtttacaagtaaatcattttatgttattttgttacagaagcccaaaaagatgaagacatacaccagatcactccattctcttcttgcttgcatggtttctgaggatacgttggatgtaattctaatattctctataggtattttctttatggctcct或aagctccagtatacctaaacaagtgcaaatttgtttaagtacagttatttgtggtagcattagtcattgttttcaatagcaagaagaaaaaggaaacaac 或catcaaaaatcggttaccataaaatcctaatagttgaagagatgtaatttcaattatttggtaaacctgaccttcattgtcaaagc 或ttttcctgtgtctctgcaaccacaggcccctctcctttctcttaataaagataccagtcattgagtttgaaaattgctaagagagtctgttgtaaatctt 或cttagcacaaaaaaaaatgacagatatgtgaagtggtagatatattaattagtttgatttgatcactccgctatgtgtataaatgtcaaaacaaacattg 或taggaaagtgattggcttttgtatgttaacgttgtatcctgctcacttgctataactgcttattagttccaggagcttttttattgtttcttttggattttctaagagacaattacattatcagtgaacaaacacgatttatttcttccc 或ctttgttcctgattttagctataggtttttgtagctgttctttattaagttgaggatatccttctctattcttagtttgctgagaatttttatcatgaat 或aggtaattctggcttcacaaaattaattatggagtcttccctctacttctagtttctggaagagattgtagagaatggatgtaatttctttcttaaatgt或ttctttcatttctgatattcataatttgtgtattctctctttgtttcttagcctggtgagaggcttataaattttattgattttttgaagaatcactttttggttttgctgattttcttgctgggattataggcgtgagccaccacactc或aaaaagtccaggcattagctaggactgtgcctgtagtcccagctactcaggaggctgagatgagaagatcaccggagcctagaaatttgaggctgcagtgggctgtgatcatgtcacttcactcctgcctagaagacagttagaccctgcctctaaaataaacaagcaaataaataaaaagaaaggaagaaaagaagagcaagggcagcaaatagaaaatagtaataaatatggtagctattaatccaactatgtcaataattaccttaaatgttagtggtctaaatatactgcaatggB ο
7.根据权利要求I所述的靶向基因DNA分子探针的制备方法，其特征在于所述靶向基因为人类、非人类动物、植物或微生物的疾病基因或正常基因，疾病的种类包括肿瘤或癌症、心脑血管疾病、内分泌及代谢性疾病、免疫淋巴系统疾病、遗传性疾病、神经系统疾病、血液系统疾病、组织器官及个体发育性疾病、泌尿和生殖系统疾病、骨关节肌肉运动系 统疾病、老年性疾病、呼吸和消化系统疾病、皮肤病、眼耳鼻舌身的感觉器官或感受器的疾病以及各个种类的传染性疾病。
全文摘要
本发明公开了靶向基因DNA分子探针的制备方法，其将网路生物医学信息学和实验室分子生物学有机的结合起来，通过使用网路的或计算机的生物医学信息学工具，来确定人类基因组中疾病基因序列或正常基因序列，剔除其中的非特异的重复DNA片断，保留独特的和特异的疾病基因序列或者基因组特有的正常基因序列。整个DNA探针制作过程包括两大程序第一程序是将基因的DNA序列确定并排除非特异性重复片段，第二程序是在第一程序的设计和指导下，应用实验室分子生物学的手段将此DNA探针实际地制造出来。本发明制造的探针可用于在福尔马林固定、石蜡包埋的组织和细胞切片以及细胞涂片的临床病理标本上进行以形态学为基础的原位杂交反应包括荧光原位杂交和非荧光的显色原位杂交，用于各级各类疾病基因的检测和诊断，还可用于正常人类基因和非人类基因的测定。
文档编号C12N15/10GK102952794SQ201210324630
公开日2013年3月6日 申请日期2012年9月5日 优先权日2012年9月5日
发明者方园 申请人:张家港蓝苏生物工程有限公司