一种基于基因芯片同时鉴定三种伊蚊的探针及试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物检测鉴定领域，涉及一种针对白纹伊蚊、埃及伊蚊、东乡伊蚊3种 伊蚊的基因芯片检测鉴定探针及试剂盒。
【背景技术】
[0002] 伊蚊，蚊科（Culicidae)库蚊亚科（Culicinae)伊蚊属（Aedes)昆虫的统称。分布 于全世界，是蚊科中最大一属，近1000种，中国有100余种。伊蚊会传播很多疾病，对人类 的健康带来危害，黄热病与登革热就主要通过伊蚊传播。黄热病是由黄热病病毒引起的急 性传染病，埃及伊蚊是主要传播媒介。登革热是一种急性传染病，已知12种伊蚊可传播本 病，但最主要的是埃及伊蚊和白纹伊蚊。东乡伊蚊幼虫多孳生在海滨岩穴、石洞以及容器、 船舱等的积水中，是马来丝虫病和乙型脑炎的传播媒介。
[0003] 目前，口岸媒介生物的传统鉴定方法为形态学鉴定方法，主要是依据有形态学鉴 定经验、具有媒介生物形态鉴定知识的实验室专业人员根据医学媒介分类检索表进行种类 鉴定。受限于鉴定人员的经验积累、专业要求、标本完整性与发育阶段，传统媒介蚊种鉴定 方法存在着鉴定专家数量有限、鉴定周期长、鉴定效率低等问题。比如，首先，传统的分类方 法在鉴定蚊虫复合体、近缘种存在一定困难；其次，在国境口岸蚊媒监测和交通工具等的卫 生检疫工作中，受不同的采集工具、采集方法的影响以及标本运送过程的限制，当专业技术 人员鉴定时，许多蚊虫标本已经是残缺不全，往往是腹部鳞片或翅等重要体征脱落或受损， 难以进行准确的形态分类；再次，对于截获的卵、幼虫和蛹，整个鉴定过程大致需要数周的 时间，由于鉴定特征细微难辨，往往需要培养至成虫再鉴定，如果是少见的国外种类，还要 请国外专家协助鉴定，鉴定所需的时间就更多了。
[0004] 近年来，分子生物学技术的迅速发展，显示了在蚊类鉴别应用中的极大潜力，形成 了许多分子鉴别方法，成为解决当前蚊虫分类难题的新钥匙。
[0005] 基因芯片技术系指将大量探针分子固定于支持物上后与标记的样品分子进行杂 交，通过检测每个探针分子的杂交信号强度进而获取样品分子的数量和序列信息。基因芯 片主要用于基因检测工作。基因芯片技术由于同时将大量探针固定于支持物上，所以可以 一次性对样品大量序列进行检测和分析，从而解决了传统核酸印迹杂交技术操作繁杂、自 动化程度低、操作序列数量少、检测效率低等不足。目前基于基因芯片鉴定蚊虫报道的技术 极少，仅能搜索到赵明等人建立的D NA条形码芯片的初步研究，但是芯片的设计与研制主 要通过虚拟电子杂交及验证，结果与实物的杂交还是有很大的差异。
【发明内容】
[0006] 为了克服现有技术的缺点与不足，本发明公开了一种基于基因芯片同时鉴定三种 伊蚊的探针，包括下列三种探针：
[0007] 白纹伊蚊：CTTTAACACTGCTGCTITCTAGITC ;
[0008] 埃及伊蚊：GTGCTGAACTTAGCCACCCTGGT ;
[0009] 东乡伊蚊：AACTCTCCTGCTITCAAGTAGT。
[0010] 本发明的内容还包括一种用于同时鉴定三种伊蚊的基因芯片，所述基因芯片含有 上述二种探针。
[0011] 本发明的内容还包括一种用于同时鉴定三种伊蚊的基因芯片试剂盒，所述基因芯 片含有上述三种探针。
[0012] 本发明的内容还包括上述基因芯片试剂盒在检测和鉴定白纹伊蚊、埃及伊蚊、东 乡伊蚊三种伊蚊中的应用。
[0013] 本发明根据不同伊蚊的基因序列，选择基因序列保守位置并设计特异性寡核苷酸 检测探针，利用分子生物学的方法进行蚊类鉴别，克服了传统媒介蚊种鉴定方法存在着鉴 定专家数量有限、鉴定周期长、鉴定效率低等问题，实现了对白纹伊蚊、埃及伊蚊、东乡伊蚊 三种伊蚊快速、准确的鉴定。经过实验检测，本发明的基因芯片及试剂盒特异性强，灵敏度 高，可以很好的应用于口岸媒介生物鉴定工作。
[0014] 为了更好地理解和实施，下面结合附图详细说明本发明。
【附图说明】
[0015] 图1实施例1的基因芯片的点样位置示意图，其中灰色点为阳性质控；黑色空心点 为阴性质控；黑色实心点为检测样本。检测样本和质控点平行两组，检测样本从左到右分别 为白纹伊蚊、东乡伊蚊、埃及伊蚊。
[0016] 图2是特异性检测中，样品为白纹伊蚊的基因芯片杂交结果图，结果证明本发明 的基因芯片可以特异性识别样品中的白纹伊蚊基因。
[0017] 图3是特异性检测中，样品为东乡伊蚊的基因芯片杂交结果图，结果证明本发明 的基因芯片可以特异性识别样品中的东乡伊蚊基因。
[0018] 图4是特异性检测中，样品为埃及伊蚊的基因芯片杂交结果图，结果证明本发明 的基因芯片可以特异性识别样品中的埃及伊蚊基因。
[0019] 图5为本发明的基因芯片针对白纹伊蚊的灵敏度检测结果，其中1-6号为检测模 板梯度依次2倍梯度稀释；
[0020] 图6为本发明的基因芯片针对东乡伊蚊的灵敏度检测结果，其中1-6号为检测模 板梯度依次2倍梯度稀释；
[0021] 图7为本发明的基因芯片针对埃及伊蚊的灵敏度检测结果，其中1-6号为检测模 板梯度依次2倍梯度稀释； 具体实施例
[0022] 【实施例1基因芯片的制备】
[0023] 本实施例的制备方法如下：
[0024] 1、探针的设计：首先从NCBI基因数据库中下载相应的基因序列，使用软件对序列 进行比对。根据比对结果在基因序列保守位置设计特异性寡核苷酸检测探针（表1)、质控 探针（表2)和特异性引物（表3)。
[0025] 2、探针的合成：每条探针的3'端加入6个碱基T且3'末端氨基修饰作为连接 臂，使其固定在芯片上；质控探针除了 3'末端进行氨基修饰外，5'端同时标记生物素。
[0026] 3、芯片的制备：将合成的探针用去离子水稀释成100uM，分别取lOul探针溶液和 10ul体积芯片点样液混匀，使探针终浓度为50uM。其中，点样位置如图1所示，灰色点为阳 性质控；黑色空心点为阴性质控；黑色实心点为检测样本。检测样本和质控点平行两组，检 测样本从左到右分别为白纹伊蚊、东乡伊蚊、埃及伊蚊。点样过程保持一定湿度，点样完成 后将芯片置于干燥器中避光常温静置24小时。点制好的芯片常温干燥保存。
[0027] 其中，用于检测鉴定3种伊蚊的寡核苷酸探针和质控探针如下：
[0028] 表1检测探针
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[0034] 利用基因芯片检测鉴定上述三种伊蚊的使用方法步骤如下：
[0035] 1、提取待测样本的模板DNA :使用商品化动物组织基因组DNA提取试剂盒提取蚊 虫 DNA。
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