Torch检测并联探针、基因芯片、试剂盒与检测方法
【专利摘要】本发明公开了一种TORCH检测并联探针，包括弓形虫TOX探针1、2、3，序列分别为SEQ ID NO.1～3；风疹病毒RV探针1、2、3，序列分别为SEQ ID NO.4～6；巨细胞病毒CMV探针1、2、3，序列分别为SEQ ID NO.7～9；单纯疱疹病毒I型HSV I探针1、2、3，序列分别为SEQ ID NO.10～12；和单纯疱疹病毒II型HSV II探针1、2、3，序列分别为SEQ ID NO.13～15；还公开了含有上述探针的基因芯片以及该基因芯片的试剂盒，以及利用该试剂盒进行TORCH检测的方法。本发明操作简单、结果易读，满足医院、产前检测等的现场检测需求，结果准确可靠。
【专利说明】
TORCH检测并联探针、基因芯片、试剂盒与检测方法
技术领域
[0001]本发明属于分子生物学领域，涉及一种TORCH检测并联探针、基因芯片、试剂盒与 检测方法。
【背景技术】
[0002] TORCH是指可导致先天性宫内感染及围产期感染而引起围产儿畸形的病原体，它 是一组病原微生物的英文名称缩写，其中T(Toxoplasma)是弓形虫，0(0thers)是其他病原 微生物，如梅毒螺旋体、带状疱疹病毒、细小病毒B19、柯萨奇病毒等，R(Rubella.Virus)是 风疹病毒，C(Cytomegalo.Virus)是巨细胞病毒，H(Herpes.Virus)即是单纯疱疹I/II型。其 中弓形虫寄生于细胞内，随血液流动，到达全身各部位，破坏大脑、心脏、眼底，致使人的免 疫力下降;风疹病毒主要通过呼吸道传播，孕妇感染后能使胎儿致畸，病毒通过胎盘感染胎 儿形成先天性感染，称为先天性风疹综合症(CRS)，主要是先天性白内障、先天性心脏病和 神经性耳聋，风疹感染发生在孕期越早，胎儿的致畸也越严重;巨细胞病毒感染能引起宫内 胎儿生长迟缓、小头形、脑炎、视网膜脉膜炎、黄疸、肝脾肿大、溶血性贫血等，新生儿死亡率 较高;怀孕早期感染单纯疱疹病毒(HSV I、II型）能破坏胚芽面导致流产，孕中晚期虽少发 畸胎，但可引起胎儿和新生儿发病。TORCH的感染影响着人口素质，与优生优育有重要关系。
[0003] 目前，临床上最常用的TORCH检测是EL ISA法，常规的EL ISA检测的是抗体，常检测 IgM和IgG抗体，即可判断近期感染(IgM指标），又可检测人群抗体(免疫力)水平（IgG指标）， 但是如果要对5种病原体进行检测，就需要十几种试剂盒才能将所有的IgM和IgG检测完毕， 每次反应只能检测一个指标，速度慢，效率低，费用昂贵，需要样本量大，并存在一定的窗口 期，可能导致假阴性。
[0004] 生物芯片技术是九十年代发展起来的一项新兴生物技术。按照检测对象来分类， 可以分为基因芯片和蛋白质芯片等两大类。相较于蛋白质芯片，基因芯片利用的是核苷酸 链之间的互补作用，特异性强，重现性好。基因芯片指的是将大量(通常每平方厘米点阵密 度高于400)探针分子固定于支持物上后与标记的样品分子杂交，通过检测每个探针分子的 杂交信号强度进而获取样品分子的数量和序列信息。采用基因芯片进行检测，其检测通量 大，在一张芯片上一次性完成几种病原体检测，直接针对病原体基因进行，结果更准确，具 有检测灵敏度高、特异性好，所需样本量少等优点。
[0005] 目前，已有利用基因芯片技术检测TORCH的报道，如1)用于TORCH检测的探针、基因 芯片和试剂盒CN 104846074A;2)-种ToRCH检测的荧光标记基因芯片试剂制备方法及其应 用CN 103805715A，但是以上的研究存在假阳性率较高的可能。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是提供一种特异性好、结果准确、假阳性率低、检测效率高的TORCH 检测并联探针、基因芯片、试剂盒与检测方法。
[0007] 本发明实现其目的的技术方案为：
[0008] 一种TORCH检测并联探针，包括弓形虫Τ0Χ探针1、2、3,风疹病毒RV探针1、2、3,巨细 胞病毒CMV探针1、2、3,单纯疱疹病毒I型HSV I探针1、2、3和单纯疱疹病毒II型HSV II探针 1、2、3;所述探针序列为：
[0009] 弓形虫Τ0Χ探针1、2、3序列分别为SEQ ID N0.1~3;
[0010] 风疹病毒RV探针1、2、3序列分别为SEQIDN0.4~6;
[0011]巨细胞病毒CMV探针1、2、3序列分别为SEQIDN0.7~9;
[0012] 单纯疱疹病毒I型HSVI探针1、2、3序列分别为SEQIDN0.10~12;
[0013] 单纯疱疹病毒II型HSVII探针1、2、3序列分别为SEQIDN0.13~15。
[0014] 一种TORCH检测基因芯片，包括固体相和上述的探针组SEQ ID NO. 1~15。
[0015] 作为优选地，所述固相载体为氨基修饰的玻璃基片、尼龙膜或者硝酸纤维素膜。
[0016] 一种TORCH检测试剂盒，包括前述的基因芯片。
[0017] 在上述TORCH检测试剂盒中，还包括以下引物对：弓形虫靶序列扩增引物对、风疹 病毒靶序列扩增引物对、巨细胞病毒靶序列扩增引物对、单纯疱疹病毒I型靶序列扩增引物 对、单纯疱疹病毒II型靶序列扩增引物对，所述引物对的序列分别为：
[0018] 弓形虫靶序列扩增引物对序列如SEQ ID N0.16、17所示;风疹病毒靶序列扩增引 物对序列如SEQIDN0.18、19所示；巨细胞病毒靶序列扩增引物对序列如SEQIDN0.20、21 所示；单纯疱疹病毒I型靶序列扩增引物对序列如SEQ ID N0.22、23所示;单纯疱疹病毒II 型靶序列扩增引物对序列如SEQ ID N0.24、25所示。
[0019] 作为优选地，所述引物对的下游引物的5'端含有生物素标记。
[0020] 作为优选地，TORCH检测试剂盒还包括PCR反应体系、杂交缓冲液、亲和素、洗涤液、 TMB显色液。
[0021] 作为优选地，10yL的PCR反应体系包括：50~150ng/yL的扩增模板0.4yL，Premix Taq 5yL，浓度为8~12μΜ的上、下游引物各0.2yL。。
[0022] 一种TORCH检测方法，使用前述的TORCH检测试剂盒进行检测，当检测对象的三个 探针显示的检测结果一致时可以判断样品是否感染病原体；当检测对象的三个探针显示的 检测结果不一致时，不能判断该待测样品为阳性或阴性，使用该检测试剂盒重新检测或者 使用现有其它检测方法(比如Elisa方法)进行进一步验证。
[0023]在上述的TORCH检测方法中，扩增5个病原体靶序列的PCR扩增反应程序均为95°C 511^11;95。(：1〇8、551€3〇8、721€3〇8、30个循环 ；72。(：1〇11^11。
[0024]本发明的有益效果是：①能同时完成TORCH五种病原体的检测，减少反应复杂程 度，简化实验操作;②针对TORCH五种病原体每种病原体均设计三条高特异性的探针，当3条 探针均检测出阳性时才判断该项指标为阳性，能极大的提尚广品的准确性和精确性，减少 其它方法容易出现的假阳性问题;③本发明通过PCR技术对病原体DNA进行扩增，扩增产物 与生物芯片上的寡核苷酸探针进行杂交，通过生物素标记，显色液进行显色后，可以用普通 数码相机拍照或肉眼直接判读，直观的表现检测结果，操作简单、结果易读，满足医院、产前 检测等的现场检测需求，为优生优育及诊断TORCH感染提供可靠的实验依据。
【附图说明】
[0025]图1为检测TORCH五种病原体的基因芯片示意图。
[0026] 图2为5种病原体基因扩增后PCR产物电泳条带图；Y-T:弓形虫;Y-R:风疹病毒;Y-C:巨细胞病毒;Υ-Η1:单纯疱疹病毒I型;Υ-Η2:单纯疱疹病毒Π 型;M: lOOOObp marker。
【具体实施方式】
[0027] 以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
[0028]主要试剂及生产者：
[0029]氨基修饰的玻璃基片（武汉阳达生物科技有限公司），病毒基因组DNA/RNA共提试 剂盒（货号DP438,天根生化科技(北京）有限公司），亲和素(辣根过氧化物酶标记）（碧云天 生物技术研究所），TMB显色液(上海生工生物工程有限公司），Premix Taq(TAKARA公司，日 本）：成分为PrimeSTARHS DNA Polymerase，dNTP Mixture，PrimeSTAR Buffer。
[0030] 引物合成公司为英潍捷基(上海)贸易有限公司。
[0031] 实施例1目的片段引物与探针设计
[0032] 查找NCBI数据库中弓形虫、风疹病毒、巨细胞病毒、单纯疱疹病毒I型和Π 型的基 因序列，选择高特异性的基因序列作为靶序列(5个检测对象选择的基因保守序列的ID依次 为:AF179871 · 1，ΑΥ161375· 1，FJ491284.1，JQ352183.1，HQ123122.1)，设计引物与探针。靶 序列确定后，根据引物与探针设计原则，设计各病原体基因的扩增引物与探针，为了使芯片 结果用显色液显色后可直接通过肉眼判读，在各病原体靶基因的R引物5'端用生物素进行 标记，具体序列如下：
[0033] 1、弓形虫（Τ0Χ)
[0034]弓形虫(Τ0Χ)靶序列扩增引物：
[0035] F引物（T0X-F):5'-CGTATTGTCGAGTAGATCAG-3'（SEQ ID N0.16)，
[0036] I^|*(T0X-R):5'-biotin-TCGCTGCGGAGACAGCGAAG(SEQIDN0.17)-3'。
[0037] Τ0Χ并联探针：
[0044] 2、风疹病毒(RV)
[0045] 风疹病毒(RV)靶序列扩增引物：
[0046] F引物（RV-F):5'-TCCGGGTCAAGTTCCATACA-3'（SEQ ID N0.18)，
[0047] R引物（RV-R):5'-biotin-GCCAACGCCATTCCCCTGAC-3'（SEQ ID N0.19)。
[0048] RV并联探针：
[0055] 3、巨细胞病毒(CMV)
[0056] 巨细胞病毒(CMV)靶序列扩增引物：
[0057] F引物（CMV-F):5'-AGGTGACACCAGAGAATCAG-3'（SEQ ID N0.20)，
[0058] I^|*(CMV-R):5'-biotin-CTTCATTACACTGATAACCT-3'（SEQIDN0.21)。
[0059] CMV并联探针：
[0060] CMV 探针 1:
[0066] 4、单纯疱疹病毒(HSV) I型
[0067] HSV I靶序列扩增引物：
[0068] F引物（HSV I-F):5'-ACCCGCACCATCTACGACGG-3'（SEQ ID N0.22)，
[0069] R引物（HSV I-R):5，-biotin-ACCCCACTTC CGGGTTTCAC-3，（SEQ ID N0.23)。
[0070] HSV I并联探针：
[0077] 5、单纯疱疹病毒(HSV) II型
[0078] HSV II靶序列扩增引物：
[0079] F引物（HSV II-F):5'-CGGGAACGGG GACGAGGATA-3'（SEQ ID N0.24)
[0080] R引物（HSV II-R):5'-biotin-GCCGTCGCGCACCTGGAGGC-3'（SEQ ID N0.25)
[00811并联探针：
[0088] 实施例2芯片的制备
[0089] 将实施例1中1'(?、1^、01^、!^￥1、!^￥11的并联探针按照表1的顺序点样到氨基修 饰的玻璃基片上，得到含有探针的基因芯片（如图1所示）。探针浓度为30μΜ，每个点0.2yL， 然后80 °C孵育1.5小时。
[0090] 表1T0RCH检测芯片探针排列顺序
[0092]实施例3检测方法 [0093] 1、待测样品基因组提取
[0094]使用病毒基因组DNA/RNA共提试剂盒，按照操作说明书的步骤提取待测样品的基 因组作为扩增模板。
[0095] 2、PCR扩增目的片段
[0096] 经过大量实验摸索，确定对5个检测对象1'(^、1^、01^、批￥1、批￥11通用的？0財广 增体系和PCR反应程序，使得检测方法更加容易，一台机器即可同时对多个对象进行扩增， 增加了工作效率。
[0097] 5个检测对象的PCR扩增体系一样，具体如下:不同的检测对象使用相应的F引物、R 引物即可。
[0100] 5 个检测对象的 PCR 反应程序均为：951€5111丨11;95°(：1〇8、55 1€3〇8、721€3〇8、30个循 环；72°C10min。
[0101] 3、PCR产物与芯片杂交 [0102]按照如下步骤操作：
[0103] a.在实施例2中制备好的基因芯片上将5个不同的检测对象的PCR扩增产物对应地 点样到该检测对象的检测孔中，具体步骤为:PCR产物95°C解链5分钟，迅速置于冰上，PCR产 物与杂交缓冲液(50 %甲酰胺，10 X SSC，0.2 % SDS)等体积混合，每孔点10微升混合液，在湿 盒中，于60°C杂交孵育2小时。
[0104] b.取出孵育后的基因芯片，用洗涤液(0.3 X SSC缓冲液)清洗3次，晾干芯片。
[0105] C.将亲和素(辣根过氧化物酶标记)加到晾干的芯片上，室温孵育lOmin。
[0106] d.用洗涤液(0.3 X SSC缓冲液)清洗3次后晾干。
[0107] e.在晾干的基因芯片上点样TMB显色液，反应15分钟，拍照，统计结果，检测对象为 阳性的样品TMB显色反应后溶液颜色由蓝色变为黄色。
[0108] 实施例4检测待测样品
[0109] 从第三军医大学获取分别感染弓形虫、风疹病毒、巨细胞病毒和单纯疱疹病毒I型 和II型的样本（阴道分泌物)各20份，按照实施例1和3中的引物和方法分别提取待测样品的 基因组，进行PCR扩增后，使用实施例2中的基因芯片进行检测。PCR扩增后的产物电泳条带 表明本发明设计的靶序列扩增引物特异性高，能特异、灵敏地扩增出目标基因（如图2所 示)。
[0110] 对于感染了检测对象的样品，TMB显色反应后溶液颜色由蓝色变为黄色，表明样品 为阳性，感染了该病原体，检测中设置阳性和阴性对照。判断检测结果时，当三个探针均显 示阳性时才判断该样品感染了病原体，如果其中某一个或者两个探针显示阴性，则应对该 检测样品重新检测，三个探针结果须一致才能采信该检测结果。三个探针检测结果不一致 时，也可使用现有其它技术(比如Elisa方法)进一步检测验证。
[0111] 在试验的100份样品中，97份样品利用本发明的基因芯片的检测结果与已知结果 相符，每个样品的检测对象的3个探针结果一致，均显示阳性。其中只有1份弓形虫样品、1份 风疹病毒和1份单纯疱疹病毒I型的样品，每个样品其两个探针显示阳性，1个探针显示阴 性，于是利用本发明的基因芯片重新检测这3份可疑样品，第二次检测结果显示该可疑的弓 形虫样品、单纯疱疹病毒I型样品的3个探针均为阳性，而可疑的风疹病毒样品重新检测结 果仍是2个探针显示阳性、1个探针显示阴性，对该可疑样品采取Elisa方法检测，Elisa检测 为阳性。
[0112] 本发明的探针、基因芯片、试剂盒，特异性高、结果非常准确，检测快速、工作效率 高，操作简单、结果易读，满足医院、产前检测等的现场检测需求，为优生优育及诊断TORCH 感染提供可靠的实验依据。
【主权项】
1. 一种TORCH检测并联探针，其特征在于:包括弓形虫TOX探针I、2、3，风疹病毒RV探针 1、2、3,巨细胞病毒CMV探针1、2、3,单纯疱疹病毒I型HSV I探针1、2、3和单纯疱疹病毒II型 HSV II探针1、2、3;所述探针序列为： 弓形虫TOX探针1、2、3序列分别为SEQ ID NO. 1~3; 风疹病毒RV探针1、2、3序列分别为SEQ ID NO.4~6; 巨细胞病毒CMV探针1、2、3序列分别为SEQ ID NO.7~9; 单纯疱疹病毒I型HSV I探针1、2、3序列分别为SEQ ID NO. 10~12; 单纯疱疹病毒II型HSV II探针1、2、3序列分别为SEQ ID NO. 13~15。2. -种TORCH检测基因芯片，其特征在于:包括固体相和权利要求1所述的探针组。3. 如权利要求2所述的TORCH检测基因芯片，其特征在于:所述固相载体为氨基修饰的 玻璃基片、尼龙膜或者硝酸纤维素膜。4. 一种TORCH检测试剂盒，其特征在于:包括权利要求2或3所述的基因芯片。5. 如权利要求4所述的TORCH检测试剂盒，其特征在于:还包括以下引物对：弓形虫靶序 列扩增引物对、风疹病毒靶序列扩增引物对、巨细胞病毒靶序列扩增引物对、单纯疱疹病毒 I型靶序列扩增引物对、单纯疱疹病毒II型靶序列扩增引物对，所述引物对的序列分别为： 弓形虫靶序列扩增引物对序列如SEQ ID NO.16、17所示;风疹病毒靶序列扩增引物对 序列如SEQ ID NO. 18、19所示；巨细胞病毒靶序列扩增引物对序列如SEQ ID NO. 20、21所 示;单纯疱疹病毒I型靶序列扩增引物对序列如SEQ ID NO.22、23所示;单纯疱疹病毒II型 靶序列扩增引物对序列如SEQ ID NO.24、25所示。6. 如权利要求5所述的TORCH检测试剂盒，其特征在于:所述引物对的下游引物的5 '端 含有生物素标记。7. 如权利要求6所述的TORCH检测试剂盒，其特征在于：还包括PCR反应体系、杂交缓冲 液、亲和素、洗涤液、TMB显色液。8. 如权利要求7所述的TORCH检测试剂盒，其特征在于：IOyL的PCR反应体系包括:50~ 150ng/yL的扩增模板0 · 4yL，Premix Taq 5yL，浓度为8~12μΜ的上、下游引物各0 · 2yL。9. 一种TORCH检测方法，其特征在于:使用权利要求4至8任一项所述的TORCH检测试剂 盒进行检测，当检测对象的三个探针显示的检测结果一致时可以判断样品是否感染病原 体;当检测对象的三个探针显示的检测结果不一致时，不能判断该待测样品为阳性或阴性， 使用该检测试剂盒重新检测或者使用现有其它检测方法进行进一步验证。10. 如权利要求9所述的TORCH检测方法，其特征在于:扩增5个病原体靶序列的PCR扩增 反应程序均为 951€5111丨11;95°(：1〇8、551€3〇8、72 1€3〇8、30个循环；72°(：1〇11^11。
【文档编号】C12Q1/04GK105950787SQ201610392961
【公开日】2016年9月21日
【申请日】2016年6月6日
【发明人】周勇, 徐建
【申请人】重庆威斯腾生物医药科技有限责任公司