一种基于纳米金探针结合基因芯片可视化检测microRNA的生物传感器的制造方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物传感器领域，特别涉及一种基于纳米金探针结合基因芯片可视化 检测mi croRNA的生物传感器。
【背景技术】
[0002]MicroRNAs(miRNAs)是一类长度约21-25个核苷酸的内源性、高保守非编码小分子RNA，它们主要通过与祀mRNA的3 ' -UTR互补配对来调苄基因的表达。MiRNAs表达水平的改变 与多种疾病密切相关，尤其是肿瘤。MiRNAs的检测对于疾病的早期诊断以及发现药物新靶 标具有重要作用。然而，由于miRNAs分子序列短小，在体液中丰度较低以及miRNA家族成员 之间的同源性高，使得miRNAs的分析具有挑战性。Northernblotting是用于miRNAs检测的 经典方法。然而，它具有灵敏度较低、操作繁琐和耗时的缺点，从而限制了在临床研究中的 应用。实时定量PCR(Real-timePCR，RT-PCR)具有线性范围宽和灵敏度高的优点，但是它需 要精确的温控条件，并且miRNAs的序列短小使得引物设计比较复杂。基于电化学的检测方 法具有很高的灵敏度，但是这种方法很难实现多个miRNAs靶标的同时检测。因此，发展一种 具有高灵敏、操作简单并且成本低的miRNAs检测方法十分必要。
【发明内容】
[0003] 本发明所要解决的技术问题是提供一种基于纳米金探针结合基因芯片可视化检 测microRNA的生物传感器，该生物传感器对临床样本的检测具有良好适用性，整个分析时 间不超过lh，并且可以用肉眼观察反应结果；这种分析方法具有费用低、快速及便捷的优 点，有望用于临床样本中miRNAs的超灵敏和可视化检测。
[0004] 本发明的一种基于纳米金探针结合基因芯片可视化检测microRNA的生物传感器， 所述生物传感器包括：固定在基因芯片上的靶标miRNA特异性捕获探针、miRNA特异性报告 探针和纳米金探针以及信号增强液;其中，纳米金探针表面的检测探针序列为：
[0005]SH-TTTTTTTTTTGCACAGGAGCAACAG、SH-TTTTTTTTTTCTGTTGCTCCTGTGC中的一种或两 种。
[0006] 所述靶标miRNA特异性捕获探针的序列为：
[0007]miR-125a-5p捕获探针：NH2-TTTTTTTTTTTTTTTTTCACAGGTTAAA;
[0008]miR-126捕获探针：NH2-TTTTTTTTTTTTTTTTCGCATTATTAC。
[0009] 所述靶标miRNA特异性报告探针的序列为：
[0010] miR-125a-5p报告探针：GGGTCTCAGGGA(T)i5GTCGTCTGTTGCTCCTGTGC;
[0011]miR-126报告探针：TCACGGTACGA(T)15GTCGTCTGTTGCTCCTGT。
[0012] 采用两种纳米金探针时浓度为0·134nmol/L和6.7nmol/L。
[0013]miRNA特异性报告探针的浓度为lnmol/L。
[0014] 所述信号增强液为25mmol/L的MES缓冲液、30%的H2O2和100mm〇l/L的HA11CI4溶液 按照体积比5:3:2混匀而得。
[0015] 本发明提供了一种基于纳米金探针结合基因芯片用于miRNA检测的高灵敏度和便 携式生物传感器，如图1所示。氨基修饰的核苷酸(捕获探针)通过希夫碱反应固定在醛基化 的芯片上，接着，在反应体系中加入靶标miRNAs、报告探针和纳米金探针，它们可以通过碱 基互补配对结合在芯片上。最后，加入由四氯金酸&61：抑(3111〇1'03111'；[(3(111)3(^(1，撤11(]14)、 过氧化氢（hydrogenperoxide，H2〇2)和2-吗啉乙横酸（2-(N-Morpholino)ethanesuIfonic acid，MES)组成的增强反应液，H2〇2可以在MES缓冲液中还原HAuCl4为AuQ。增强反应的过程 可以视为一个自催化反应:纳米金作为成核位置催化金离子还原成为金原子，还原反应的 产物沉积在芯片上，并且反应结果肉眼可见。
[0016] 本发明利用单个纳米金探针结合基因芯片可以检测到10pmol/L的革E1标miRNAs，测 得miR-126在胎牛血清中的回收率为81.5%-109.1%，并用这种生物传感器检测肺癌组织 样本总RNA中的miR-126,其结果与定量PCR具有一致性。双纳米金探针的使用进一步提高检 测灵敏度，可以检测到lfmol/L的miR-125a_5p。
[0017] 有益效果
[0018] 本发明对临床样本的检测具有良好适用性，整个分析时间不超过lh，并且可以用 肉眼观察反应结果;这种分析方法具有费用低、快速及便捷的优点，有望用于临床样本中 miRNAs的超灵敏和可视化检测。
【附图说明】
[0019] 图1为本发明基于纳米金探针结合基因芯片检测miRNAs示意图；
[0020] 图2为本发明基于单纳米金探针结合基因芯片检测miR-125a-5p结果图；其中，A为 miR-125a-5p浓度从100nmol/L-10pmol/L的检测结果图及空白对照;B为miR-125a-5p浓度 与灰度值之间的关系图；
[0021] 图3为本发明基于单纳米金探针结合基因芯片检测miR-126结果图；其中，A为miR-126浓度从100nm〇l/L-10pm〇l/L的检测结果图及空白对照;B为miR-126浓度与灰度值之间 的关系图；
[0022]图4为本发明基于双纳米金探针结合基因芯片检测miR-125a-5p结果图；其中，A为miR-125a-5p浓度从100nmol/L-10pmol/L的检测结果图及空白对照;B为miR-125a-5p浓度 与灰度值之间的关系图；
[0023]图5为本发明基于双纳米金探针结合基因芯片检测miR-125a-5p的探针优化测试 结果图；其中，A为纳米金探针2，B为纳米金探针1，C为报告探针。
【具体实施方式】
[0024]下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人 员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定 的范围。
[0025] 实施例1 [0026] 1材料与方法
[0027] 1.1试剂和仪器
[0028] 四氯金酸三水合物(HAuCl4· 3H20)购自比利时Acros公司；2-吗啉乙磺酸(MES)购 自美国Sigma公司；15nm的纳米金溶液购自上海水源生物公司；RNA酶抑制剂购自美国ABI公 司.实验所需核苷酸均在Takara公司合成(表1)。所用试剂均为分析纯，实验用水为去离子 水(电阻率大于18.3ΜΩcnf1)。
[0029] ProSys-5510型芯片点样仪(美国CartesianTechnology公司）用于将捕获探针点 到芯片上;JascoV-670型紫外-可见光光谱仪（日本）用于测定紫外-可见吸收光谱;实验图 片用连有DP-70数码相机和DPcontroller软件（日本Olympus公司）的BX51型倒置显微镜 (日本Olympus公司）拍摄。
[0030]表1实验中所用序列
[0032] 1.2纳米金探针的制备
[0033] 纳米金粒子的形态用透射电子显微镜（TransmissionElectronMicroscopy, TEM)进行观察。用0.2mol/LK2CO3将纳米金溶液的pH调至8.2-8.5dOOOr/min，离心50min， 弃上清，加入检测探针至其终浓度为3ymol/L，体系总体积为100yL。在4°C静置16h后，分3次 加入磷酸盐缓冲液(phosphatebuffer，ΡΒ;0 ·lmol/L，pH7.2)和NaCl(lmol/L)至其终浓度 分别为0.01m〇l/L和0.1m〇l/L，每次间隔lh。将溶液充分混匀后室温放置48h，用lml 0.01mol/LPB和0.1mol/LNaCl组成的缓冲液(pH7