Uca1基因在制备诊断结直肠癌产品中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物学研究领域，具体涉及UCA1(urothelialcarcinomaassociated 1)基因在制备诊断结直肠癌产品中的应用。
【背景技术】
[0002] 结直肠癌（colorectalcancer，CRC)是全球最常见的恶性肿瘤之一，2012年新 增结直肠癌病例140万，死亡例数为69万[TorreLA,BrayF,SiegelRL，etal.Global cancerstatistics, 2012[j].CACancerJClin, 2015]。随着诊疗技术的不断改进，结直 肠癌的预后有了很大的改善，但晚期结直肠癌的预后仍不尽如人意。因此，鉴定能用于提示 结直肠癌的发生发展、转移复发以及药物耐药等相关的新的生物标记物，有助于提高结直 肠癌的预后。
[0003] 人类基因组中除了大量的编码蛋白质的信使RNA外，还存在众多的非编码转录 本，包括微小RNA和长链非编码RNA(longnon-codingRNA，IncRNA)。IncRNA是一类转录 本超过200nt的RNA，最初被认为是基因组转录的"噪音"。近年来研究显示，IncRNA在表观 遗传学、转录和转录后水平上调控基因的表达，参与多种细胞生物学过程，其表达水平异常 与肿瘤等多种疾病相关。如UCA1(urothelialcarcinomaassociated1)，最初是在膀胱癌 中发现的IncRNA癌基因，参与调控胚胎发育、膀胱癌侵袭、进展和耐药[12 14]。最近研究显 示，肿瘤相关IncRNA在循环中能被稳定检测到，循环IncRNA是潜在的无创肿瘤标志物。因 此，本研究检测UCA1在结直肠癌组织和血浆中的表达水平，并分析其表达水平与结直肠癌 临床因素和预后等相关性。
[0004] 在本发明之前，还没有出现涉及本发明UCA1基因用于结直肠癌诊断的公开报道。 特别是目前尚未出现将UCA1基因血浆或血清样本用于结直肠癌诊断的公开报道。
【发明内容】
[0005] 本发明要解决的技术问题之一是提供UCA1基因在制备诊断结直肠癌产品中的应 用。
[0006] 本发明要解决的技术问题之二是提供UCA1基因在制备结直肠癌预后产品中的应 用。
[0007] 为了解决上述技术问题，本发明通过如下技术方案实现：
[0008] 在本发明的一方面，提供了UCA1基因在制备诊断结直肠癌产品中的应用。
[0009] 作为本发明优选的技术方案，所述诊断结直肠癌产品包括用RT-PCR、实时定量 PCR、免疫检测、原位杂交或基因芯片诊断结直肠癌的产品。
[0010] 作为本发明优选的技术方案，所述用实时定量PCR诊断结直肠癌的产品至少包括 一对特异扩增UCA1基因的引物和探针。
[0011] 作为本发明优选的技术方案，所述特异扩增UCA1基因的引物序列如下：
[0012] UCA1 基因正向引物：CCGGTCATTTATAGCACACCAA，如SEQIDNO. 1 所示；
[0013] UCA1基因反向引物：TGGAATGGTGAACCCAATGG，如SEQ ID NO.2 所示；
[0014] 所述特异扩增UCA1基因的探针序列如下：
[0015] FAM-TGCCGTCCATCTGCAGGACCC-BHQ，如SEQ ID N0.3 所示。
[0016] 作为本发明优选的技术方案，所述UCA1基因为UCA1基因血浆或血清样本。
[0017] 在本发明的另一方面，提供了UCA1基因在制备结直肠癌预后产品中的应用。
[0018] 作为本发明优选的技术方案，所述UCA1基因为UCA1基因血浆或血清样本。
[0019] 在本发明的另一方面，提供了用于结直肠癌诊断的特异扩增UCA1基因的引物和 探针，所述特异扩增UCA1基因的引物序列如下：
[0020]UCA1基因正向引物如SEQ ID NO.1所示；
[0021]UCA1基因反向引物如SEQ ID NO.2所示；
[0022] 所述特异扩增UCA1基因的探针序列，如SEQ ID NO. 3所示。
[0023] 本发明探讨UCA1(urothelialcarcinomaassociated1)在结直肠癌组织和血 浆中的表达及临床意义。方法：用荧光定量PCR检测80对结直肠癌及其癌旁组织UCA1的 相对表达量，并检测30例健康人和20例结直肠癌患者术前和术后的血浆UCA1相对表达 量，并分析UCA1表达量与临床病理因素和预后的关系。结果显示，UCA1在结直肠癌组织中 的表达水平显著上调，特别是分期较晚和淋巴结转移的结直肠癌（P均〈0.05)。结直肠癌 组织UCA1高表达与淋巴结转移、侵袭性和较晚的??Μ分期密切相关（P均〈0. 05)。生存分 析显示，结直肠癌组织UCA1高表达患者的生存期较低表达者显著降低（校正HR= 2. 002， 95%Cl1. 007-3. 981，P= 0. 048)。另外，结直肠癌患者血浆UCA1较健康人显著升高（P= 0. 016)，并且术后血浆UCA1较术前显著降低（P= 0. 042)。结论：UCA1组织表达水平与结 直肠癌预后相关，并且血浆UCA1可能是结直肠癌早期诊断和病情监测的标记物。
【附图说明】
[0024] 图1为本发明实施例1中实时定量PCR扩增曲线图（cel-miR-39为内参基因）。
[0025] 图2为本发明实施例1中实时定量PCR扩增曲线图（RNU6B为内参基因）。
[0026] 图3是本发明实施例2中UCA1表达水平在结直肠癌组织中显著上调的结果示意 图。其中，图3A代表在结肠和相邻非癌组织中UCA1的表达；图3B代表在不同??Μ阶段UCA1 的表达；图3C代表在无LNM(lymphnodemetastasis，淋巴结转移）和LNM情况下UCA1的 表达。
[0027] 图4是本发明实施例2中结直肠癌组织中UCA1表达的预后分析结果示意图。
[0028] 图5是本发明实施例2中血浆UCA1在结直肠癌患者中表达上调的结果示意图。其 中，图5A代表在结直肠癌病人和对照组中UCA1的血浆水平，图5B代表手术切除肿瘤之前 之后病人UCA1的血浆水平。
【具体实施方式】
[0029] 以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体 条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。
[0030] 实施例1实时定量PCR(qPCR)检测UCA1基因表达
[0031] 1.1 方法
[0032] 组织和血衆RNA分别用Trizol试剂盒（Invitrogen，美国）和mirVanaPARIS Kit(Ambion，美国）提取。同时在血浆RNA抽提过程中，将人工合成的秀丽隐杆线 虫cel-miR-39(由生工生物工程（上海）股份有限公司合成）加入作为对照。cDNA PrimeScriptTMRTreagentKitwithgDNAEraser试剂盒（Takara，中国）用于合成 cDNA，SYBRPremixExTaqIIkit用于实时PCR扩增（Takara，中国）。扩增反应由ABI 7900荧光定量PCR仪完成，每个标本均做3个复孔，取其均值计算。组织和血浆样本分别以 RNU6B和cel-miR-39为内参基因，UCA1相对表达水平用公式2 计算。
[0033] 1.2引物及探针设计
[0034] 使用PrimerExpressVersion3软件设计引物和探针如下：
[0035] UCAlforward primer(UCAl基因正向引物）：CCGGTCATTTATAGCACACCAA，如SEQID NO. 1所示；
[0036]UCAlReversePrimer(UCAl基因反向引物）：TGGAATGGTGAACCCAATGG，如SEQ ID NO. 2所示；
[0037]UCAlProbe(UCAl基因探针）：FAM-TGCCGTCCATCTGCAGGACCC-BHQ，如SEQIDΝ0· 3 所示；
[0038]RNU6Bforwardprimer(RNU6B内参基因正向引物）：CTCGCTTCGGCAGCACA，如SEQ IDΝ0· 4 所示；
[0039]RNU6B ReversePrimer(RNU6B内参基因反向引物）：AACGCTTCACGAATTTGCGT，如 SEQIDΝ0· 5 所示；
[0040]RNU6BProbe(RNU6B内参基因探针）：HEX-CAGAGAAGATTAGCATGGCCCCTGC-BHQ，如 SEQIDΝ0· 6 所示；
[0041]cel-mir39Forward(cel-mir39 内参基因正向引物）：TCACCGGGTGTAAATCAGCTTG， 如SEQIDΝ0· 7 所示；
[0042]cel-miR-39reverse(cel-mir39 内参基因反向引物）：GACACCAGAGCCAAGCTGA，如 SEQIDΝ0· 8 所示；
[0043]Cel-miR-39probe(cel-mir39内参基因探针）：FAM-TCACCGGGTGTAAATCAGCTT G-BHQ，如SEQ IDΝ0·9所示。
[0044] 将设计好的引物及探针序列交由合成公司合成，一般采用仪器自动化学合成，需 提供合成检验合格报告。
[0045] 1. 3 结果
[0046]cel-miR-39是血浆样本，cel-miR-39为内参基因时，实时定量PCR扩增曲线图如 图1所示。
[0047] 内参基因RUNB6是组织样本，RNU6B为内参基因时，实时定量PCR扩增曲线图如图 2所示。
[0048] 实施例2
[0049] 2. 1材料收集2008年至2011年在上海交通大学医学院附属同仁医院确诊为