诊断细菌性阴道炎的方法
【专利说明】
[00011本申请是申请日为2010年11月17日、申请号为"201080063023.7"、发明名称为"诊 断细菌性阴道炎的方法"的发明专利申请的分案申请。
技术领域
[0002] 本发明总体上涉及医学诊断领域。具体地，本发明涉及检测是否存在与细菌性阴 道炎有关的细菌以及基于是否存在该细菌确定诊断分数的方法。
【背景技术】
[0003]提供以下描述来帮助读者理解。所提供的信息或所引用的参考文献都不能被认为 是本发明的现有技术。
[0004]阴道炎是成年女性最为常见的妇科问题。感染性阴道炎本身主要以三种形式存 在:细菌性阴道炎、念珠菌性阴道炎和滴虫性阴道炎。细菌性阴道炎在美国影响了正常临床 人群中的高达25%的女性，近乎为念珠菌性阴道炎的两倍，且是阴道感染的最常见形式。细 菌性阴道炎是通过兼性厌氧性细菌取代正常阴道菌群引起的。通常，细菌性阴道炎的症状 是非特异性的，鉴别诊断困难。
[0005]与细菌性阴道炎相关的并发症意味着较多的卫生保健费用负担。例如，细菌性阴 道炎的产科并发症包括:早产、出生体重过轻婴儿;羊膜早期破水;羊水感染;产后子宫内膜 炎;和绒毛膜羊膜炎。而且，怀疑细菌性阴道炎是大脑性麻痹的多个原因之一。此外，细菌性 阴道炎的妇科并发症包括:术后感染;盆腔炎(PID);异常宫颈涂片;性传播疾病(STD)易感 性增加和子宫切除后感染。而且，细菌性阴道炎可潜在地为宫颈上皮内瘤样病变(CIN)发展 中的人乳头瘤病毒的辅因子、宫颈癌的先兆。
[0006] 传统上利用Amsel标准来进行细菌性阴道炎(BV)的诊断，或者通过计算Nugent评 分来诊断，该Amesl标准包括下列中的任意三者：阴道分泌物异常、pH值大于4.5、加入氢氧 化钾后恶臭、或革兰氏染色剂中存在线索细胞。所述Nugent评分是由测量乳酸杆菌属 (Lactobacillusssp.)、阴道加特纳菌(Gardnerellavaginalis)、拟杆菌属(Bacteroides ssp.)和动弯杆菌属(Mobi1uncus)类的物种的相对数量的微观测试确定的。
【发明内容】
[0007] -方面，本发明提供了一种用于诊断对象中的细菌性阴道炎的方法，所述方法包 括以下步骤：（a)利用来自所述对象的样本中的一种或多种乳酸杆菌的含量以及两种或两 种以上的病原生物的含量来确定单一诊断分数；以及(b)将个体的所述诊断分数与参考分 数进行比较以确定细菌性阴道炎的存在，其中，所述单一诊断分数是通过求得所述一种或 多种乳酸杆菌的含量的对数函数与所述两种或两种以上的病原生物的含量的对数函数的 比率来确定的。在一个实施方式中，所述样本是阴道拭子。
[0008]在一个实施方式中，应用于所述一种或多种乳酸杆菌的所述对数函数包括确定所 使用的每一种乳酸杆菌的含量的对数的和，且应用于所述两种或两种以上的病原生物的对 数函数包括确定所使用的每一种病原生物的含量的对数的和。在一个实施方式中，所述参 考分数为大约0.2，小于大约0.2的诊断分数表示存在细菌性阴道炎。
[0009]在一个实施方式中，应用于所述一种或多种乳酸杆菌的所述对数函数包括确定所 使用的每一种乳酸杆菌的含量的和的对数，且应用于所述两种或两种以上的病原生物的对 数函数包括确定所使用的每一种病原生物的含量的和的对数。在一个实施方式中，所述参 考分数为大约〇. 2，小于大约0.2的诊断分数表示存在细菌性阴道炎。
[0010] 在一个实施方式中，所述样本中的一种或多种乳酸杆菌的含量和两种或两种以上 的病原生物的含量是通过检测表示所述一种或多种乳酸杆菌和所述两种或两种以上的病 原生物的核酸来确定的。在一个实施方式中，所述检测是通过聚合酶链反应(PCR)、逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)或核酸杂交进行的。在一个实施方式中，所述检测包括扩增来自所 述样本中的所述一种或多种乳酸杆菌以及所述两种或两种以上的病原生物（如果存在的 话）中的每一种的片段。在一个实施方式中，所述片断是16S核糖体核糖核酸基因的片段。在 说明性实施方式中，所述检测是利用TaqMan?PCR检测系统实现的。
[0011] 在一个实施方式中，所述一种或多种乳酸杆菌选自嗜酸乳杆菌、卷曲乳杆菌、詹氏 乳杆菌、惰性乳酸杆菌和阴道乳杆菌(Lactobacillus vaginalis)。在一个实施方式中，所 述一种或多种乳酸杆菌的含量是利用能够检测乳酸杆菌属的引物检测的。在一个实施方式 中，所述能够检测乳酸杆菌属的引物中的至少一种引物选自SEQ ID N0:8-9或其互补链。
[0012] 在一个实施方式中，所述一种或者多种乳酸杆菌的含量是利用能够检测嗜酸乳杆 菌、卷曲乳杆菌和詹氏乳杆菌的一种或多种引物对来检测的。在一个实施方式中，能够检测 嗜酸乳杆菌和卷曲乳杆菌的引物中的至少一种引物选自SEQ ID N0:1-2或其互补链。在一 个实施方式中，能够检测詹氏乳杆菌的引物中的至少一种引物选自SEQ ID N0:4-5或其互 补链。在一个实施方式中，能够检测阴道乳杆菌的引物中的至少一种引物选自SEQ ID NO: 20-21或其互补链。
[0013]在一个实施方式中，所述两种或两种以上的病原生物中的至少一种选自阴道阿托 波氏菌、巨型球菌属和阴道加特纳菌。在一个实施方式中，能够检测阴道阿托波氏菌的引物 中的至少一种引物选自SEQ ID NO:11-12或其互补链。在一个实施方式中，能够检测巨型球 菌属的引物中的至少一种引物选自SEQ ID N0:14-15或其互补链。在一个实施方式中，能够 检测阴道加特纳菌的引物中的至少一种引物选自SEQ ID N0:17-18或其互补链。
[0014]在上述任一【具体实施方式】中，所述对数函数可以是本文中确定的算法1-10中的任 一算法。所述算法中确定的具体生物仅用作示例。任一种乳酸杆菌物种的测量含量可以被 任何其他非病原乳酸杆菌的测量含量代替。而且，任何病原菌的测量含量可以被任何其他 病原菌的测量含量代替。
[0015] -方面，本发明提供了一种用于诊断细菌性阴道炎的试剂盒，所述试剂盒包括用 于扩增来自一种或多种乳酸杆菌的核酸的片段的引物对和用于扩增来自两种或两种以上 的病原生物的核酸的片段的多个引物对。在一个实施方式中，至少一个引物对选自S E Q ID N0:1/2、SEQ ID N0:4/5、SEQ ID N0:8/9、SEQ ID N0:11/12、SEQ ID N0:14-15、SEQ ID N0: 17/18或其互补链。
[0016] -方面，本发明提供了一种基本上纯化的寡核苷酸，所述寡核苷酸具有选自SEQ ID NO :1-19或其互补链的序列。
【附图说明】
[0017]图1为示出根据Nugent评分分类的包含各种细菌的拭子样品的百分比的图表。所 述细菌是根据本发明的说明性实施方式检测的。
[0018]图2为示出根据Nugent评分分类的来自患者的拭子样品中的细菌的平均量的图 表。所述细菌是根据本发明的说明性实施方式检测的。
【具体实施方式】
[0019]本发明提供了通过以下步骤来诊断细菌性阴道炎(BV)的方法:在来自个体的测试 核酸样本中，检测与BV的诊断相关的各种菌种所对应的一个或多个核酸片段。在特定的实 施方式中，检测对应于乳酸杆菌和一种或多种病原菌的核酸片段。可以在一个或多个子测 定中来进行该测定以检测所关注的细菌目标。例如，一个子测定检测产生过氧化物的乳酸 杆菌（"测定A"）；一个子测定检测所有的乳酸杆菌（"测定B"）；一个子测定检测病原菌巨型 球菌属和阴道阿托波氏菌（"测定C"）；以及一个子测定检测病原菌阴道加特纳菌（"测定 D"）。该信息可以用来确定个体是否患有BV。在一些实施方式中，确定对应于BV诊断的诊断 分数。例如，可以通过求得一种或多种乳酸杆菌的含量的对数函数与两种或两种以上的病 原生物的含量的对数函数的比率来确定所述分数。
[0020] 在实施本文描述的方法中，使用分子生物学、蛋白质生物化学、细胞生物学、免疫 学、微生物学和重组DNA方面的很多传统技术。这些技术是公知的且分别在例如以下的文献 中予以描述：CurrentProtocolsinMolecularBiology,第I-III卷，Ausubel编（1997); Sambrook等，MolecularCloning:ALaboratoryManual,第二版(冷泉港实验室出版社，冷 泉港，NY, 1989);DNACloning:APracticalApproach,第I卷和第II卷，Glover编（1985); OligonucleotideSynthesis，Gait编（1984);NucleicAcidHybridization,Hames& HigginsUK1985)；TranscriptionandTranslation,Hames&Higgins编（1984);Animal CellCulture,Freshney编（1986);ImmobilizedCellsandEnzymes(IRL出版社，1986); Perbal，APracticalGuidetoMolecularCloning;系列期刊，Meth.Enzymol·，（美国学 术出版社有限公司，1984);GeneTransferVectorsforMammalianCells,Miller&Calos 编(冷泉港实验室,NY, 1987);和Meth.Enzymol.,第154卷和第155卷，分别由Wu&Grossman和 Wu编。
[0021] 下文提供了本说明书中使用的一些术语的定义。除非另有说明，本文中使用的所 有技术和科学用语通常具有和本发明所属领域的普通技术人员通常理解的意思相同的意 思。
[0022] 除非内容另有清楚指明，否则本说明和所附的权利要求中使用的单数形式"一"和 "该"包括复数的引用对象。例如，所提及的"一核酸"包括两个核酸或两个以上的核酸的组 合等。
[0023]本文中使用的术语"扩增"表示现有技术已知的用于复制目标核酸且由此增大所 选择的核酸序列的拷贝的数量的一种或多种方法。扩增可以是以指数的或线性的。目标核 酸可以是DNA或RNA。以此方式扩增的序列形成"扩增子"。尽管下文描述的示例性方法涉及 利用聚合酶链反应（"PCR"）进行扩增，但在现有技术中已知用于扩增核酸的很多其他方法 (例如，等温法、滚环法等）。本领域的技术人员将理解，这些其他的方法可以替代PCR方法使 用或者可以与PCR方法一起使用。例如，参见：Saiki，"AmplificationofGenomicDNA"， PCRProtocols，Innis等编，AcademicPress，圣地亚哥，加利福尼亚 1990，第13-20页； Wharam等，NucleicAcidsRes.,2001,29(11):E54-E54;Hafner等，Biotechniques2001，30 (4):852-6，858，860;Zhong等，Biotechniques，2001，30(4):852-6，858，860。
[0024] 本文中使用的术语"互补链"根据标准沃森-克里克碱基配对法则表示核酸的互补 序列。互补序列还可是与DNA序列互补的RNA序列或者其互补序列，也可以是cDNA。本文中使 用的术语"基本上互补"表示两个序列在严格的杂交条件下杂交。本领域的技术人员将理 解，基本上互补的序列不需要沿着它们的整个长度杂交。尤其是，基本上互补的序列包括位 于3'到5'的不与目标序列或标记序列杂交的碱基的连续序列或者在严格的杂交条件下与 目标序列或标记序列杂交的碱基的连续序列。
[0025]本文中使用的术语"诊断"指的是区分或确定疾病、综合征或病症，或者指的是区 分或确定患有特定的疾病、综合征或病症的人。在本发明的说明性实施方式中，测定和算法 用来基于分析样本来诊断对象中的细菌性阴道炎。
[0026]本文中使用的术语"杂交"或"特异性杂交"指的是两个互补的核酸链在适当严格 的条件下彼此退火结合。通常利用探针长度的核酸分子来进行杂交。核酸杂交技术在现有 技术中是公知的。例如，参见：Sambrook等，1989,Molecular