一种高通量筛选羰基还原酶活性和对映选择性的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，涉及一种以NAD(P)H为辅酶的羰基还原酶活性和立体 选择性的高通量筛选方法。
【背景技术】
[0002] 羰基还原酶是一类非常重要的生物催化剂，能够实现羰基底物的不对称还原反 应。目前，羰基还原酶的研究与应用已经有了飞速的发展，来源于酵母和马肝的羰基还原酶 均有商品供应，可以像有机催化试剂一样购买。羰基还原酶在还原脂肪酮底物，特别是当羰 基两边的取代基团相差不大时，表现出了化学催化剂不具有的高立体选择性。羰基还原酶 已经开始在工业上应用，应用的形式有全细胞和分离酶两种方式，适用底物范围由取代基 较小的直链脂肪酮扩展到了较大位阻的支链脂肪酮、芳香酮、双芳香取代酮、环烷酮、炔基 酮等，由单羰基化合物到1，2_，1，3_，1，4-等双羰基化合物，由单纯的酮化合物扩展到 α,β-卤代，羧酸酮酯等功能化羰基化合物（Karkheinz,D. ;Garald,G. ;Oliver,M. 《EnzymeCatalysisinOrganicSynthesis》，ThirdEdition.ffiley-VCH:ffeinheim, 2012， 1206)。
[0003] 由于羰基还原酶本身的特点，当其催化非天然底物时，往往不能获得好的转化率 及立体选择性，酶的特性急需改造提高。随着科学家的深入研究，定向进化技术可以显著提 高酶活性、增加酶的稳定性、改变酶的底物特异性等，已经成为一种快速高效改进酶催化特 性的手段。虽然根据已知酶的分子结构数据和对催化机理的认识选择酶分子特定区域进 行随机饱和突变及其他突变手段的改进，使得在不影响突变效果的前提下降低突变库的规 模，可显著提高分子改造的效率，但是定向进化技术中，获得优质酶品的筛选方法依然是一 个急需解决的问题（Reetz,Μ·T.Angew.Chem.Int.Ed. 2011，50，138)。目前撰基还 原酶的活性筛选依赖于酶标仪测定，基本可以实现高通量筛选，而其立体选择性检测依然 是依靠液相色谱（HPLC)和气相色谱（GC)两种常用的方法，这两种方法目前在对羰基还原 酶的立体选择性实现高通量筛选方面依然存在难度（VozkaJ.，KalkovdiK.，Janeikovd L.,etal.Anal.Lett. 2012, 45, 2344 ；CavazziniA.,PastiL.,MassiA.,etal. Anal.Chim.Acta. 2011, 706, 205;JibutiG,MskhiladzeA. ,TakaishviliN. ,et al·J.S印·Sci. 2012，35，2529)。
[0004] 偶氮染料一般具有明亮的颜色，偶氮还原酶是细菌降解偶氮染料的关键酶。一种 偶氮还原酶可作用于一种或几种偶氮染料，它通过还原特定的偶氮染料的偶氮键而使染料 的颜色褪去。azoB是从PigmentiphagakullaeK24中克隆并鉴定的一种偶氮还原酶基因， 编码一种由203个氨基酸组成的非核黄素依赖型的偶氮还原酶AzoB。该酶可以利用NAD(P) Η作为电子供体，还原偶氮染料金橙I的偶氮键使其颜色消失。
[0005]CN102517378A描述了一种检测还原型辅酶NAD(Ρ)Η的荧光发射实现羰基还原酶 筛选，但是该方法需要额外的荧光光谱仪，与酶标仪的检测通量持平。
[0006] 因此发明一种直观可视的羰基还原酶的活性和立体选择性筛选的高通量筛选方 法是非常必要的。
【发明内容】
[0007] 本发明提供了 一种羰基还原酶活性和立体选择性的高通量筛选方法。
[0008] 根据羰基还原酶催化可逆的氧化还原反应的原理，利用羰基还原酶可以在 NAD(P)+存在的条件下催化相应的醇类底物生成对应的酮类物质以及NAD(P)H，而偶氮还原 酶则利用羰基还原酶生成的NAD(P)H，作用于偶氮染料引起偶氮染料的颜色变化，利用目测 的方式可以直接实现羰基还原酶活性和立体选择性的高通量筛选，如图1所示。
[0009] 该筛选方法通过优化确定为：反应在96孔板中进行，反应体系200μL，100mM缓 冲液（pH6· 0~9· 0)、0· 1mlT50mM底物、0· 1mlTlmMNADP+ 以及 0· 001mg~10mg纯化的 羰基还原酶，2min后，加入0.001mg~10mg的偶氮还原酶AzoB，以及偶氮染料金橙I(终 浓度0. 01~0. 5mM)，反应2min及更长的时间。
[0010] 本方法中使用到的来源于Sporobolomyces salmonicolor AKU4429的撰基还原 酶缩写为SSCR，来源于Candida magnolia的羰基还原酶缩写为CMCR，来源于pyrococcus furiosus的撰基还原酶缩写为PFADH，来源于Saccharomyces cerevisiae的三种撰基还 原酶缩写YMR226c、Gre2、Yill24W，来源于Pichia pastoris的C3。
[0011] 羰基还原酶与偶氮还原酶的耦合实验表明，羰基还原酶SSCRM242F/Q245T对底物 (1S，3R)-3-甲基环己醇表现出了较高的酶活力，反应体系颜色消失；而CMCR对该底物没 有表现出任何活力，反应体系仍呈现橙色，如图2所示。
[0012] 本方法适用于未知样品中羰基还原酶的筛选，待测的样品可以是菌体或者是酶 液。菌体可以是自然环境来源的菌体也可以是工程菌；酶液可以是破菌粗酶液也可以是 纯酶。所述的醇底物为（1S，3R)-3-甲基环己醇，（S)-l-苯基-1，2-乙二醇，（R)-l-苯 基-1，2-乙二醇，（S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯，（R)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯1-苯基-1，2-乙 二醇，1，2_戊二醇，（-)-薄荷醇，N，N-二甲基-1-苯基-1丙醇，N-甲基-1-苯基-1丙醇， N，N-二甲基-1- (2-噻吩基）-1丙醇，N-甲基-1- (2-噻吩基）-1丙醇。所述的羰基还 原酶为本实验保存的16种羰基还原酶。本实验中涉及到水溶性差的底物，DMS0作为助溶 剂。
[0013] 本发明具有如下优点：快速、有效，筛选结果直观，当所筛选的羰基还原酶对特定 底物有活性时，会产生明显的颜色变化，如果所用的羰基还原酶底物为手性醇，能初步实现 快速的手性筛选，因而该方法在一定程度上可以代替HPLC和GC来完成大规模筛选工作，本 方法中所提到的羰基还原酶不是对本方法的限制。
【附图说明】
[0014] 图1为筛选方法的作用机制 图2酶活验证及筛选方法建立 图3不同的反应时间对筛选结果的影响 图4利用AzoB和OrangeI进行的筛选实验 图5CMCR对（R) -1-苯基-1，2-乙二醇和（S) -1-苯基-1，2-乙二醇的活性及对映性 筛选实验 图6 1-苯基-1，2-乙二醇的消旋体及羰基还原酶还原CMCR的HPLC图谱
【具体实施方式】
[0015] 结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此。
[0016] 实施例1 为了优化偶氮染料金橙I的加入时间，设计6组实验。6组反应体系中均含有100mM磷酸盐缓冲液化!16.8)、5.0 1111底物（13，31?)-3-甲基环己醇、0.5 1111熟0?+、50 48羰 基还原酶SSCRM242F/Q245T以及72yg偶氮还原酶AzoB。反应不同时间（0，1，2,3,4,5 min)后，加入金橙I，结果如图3所示。
[0017] 实施例2 选用实验室保存的16种羰基还原酶以及醇类或手性醇类底物进行方法验证。底物分 别为（IS, 3R) _3_甲基环己醇，（S)-l_苯基-1,2-乙二醇，1-苯基-1,2-乙二醇，1，2_戊 二醇以及（-)-薄荷醇。反应在96孔板中进行，反应体系200μL，100mmol/L磷酸盐缓冲 液（pH6. 8)、5. 0mmol/L底物、0. 5mmol/LNADP+以及 50yg纯化的羰基还原酶，2min 后，加入72μg纯化的偶氮还原酶AzoB，以及偶氮染料金橙I(终浓度0.15mM)，反应2 min。反应结果如图4所示。
[0018] 实施例3 为了验证上述的筛选方法是否正确，以（R)-3-甲基环己酮为底物，建立反应体系1mL，酮底物10mM，NADP+ 0. 5mg,葡萄糖脱氢酶0. 5mg,葡萄糖30mM，羰基还原酶1mg，30 °〇过夜反应。等体积乙酸乙酯萃取，无水硫酸钠干燥后，GC与手性标准品对照检测。结果 如表1所示。
[0019] 表1气相色谱测定羰基还原酶的活性及立体选择性
实施例4 反应在96孔板中进行，反应体系200μL，100mM磷酸盐缓冲液（pH6. 8)、5. 0mM底 物（S) -1-苯基-1，2-乙二醇或（R) -1-苯基-1，2-乙二醇)、0· 5mMNADP+ 以及 50μg纯 化的羰基还原酶，2min后，加入72μg纯化的偶氮还原酶AzoB，以及偶氮染料金橙I(终 浓度0. 15mM)，反应2min。结果如图5所示。
[0020] 实施例5 为了验证上述的筛选方法是否正确，以α-羟基苯乙酮为底物，建立反应体系1mL，酮 底物10mM，NADP+ 0. 5mg，葡萄糖脱氢酶0. 5mg，葡萄糖30mM，羰基还原酶1mg，30 °C过 夜反应。等体积乙酸乙酯萃取，无水硫酸钠干燥后，HPLC与手性标准品对照检测。结果如 图6所示。
【主权项】
1. 一种羰基还原酶活性和立体选择性的高通量筛选方法，该发明的特征在于利用了如 下原理： 羰基还原酶在氧化醇时能够生成NAD(P)H，偶氮还原酶AzoB在NAD(P)H存在时，能 对偶氮化合物(如：偶氮染料金橙I)进行还原，使得偶氮化合物的颜色发生变化，并能非常 直观地观测到；将羰基还原酶氧化醇反应与偶氮还原酶AzoB还原偶氮染料金橙I相偶联， 根据反应体系的颜色变化程度，实现羰基还原酶的活性和立体选择性高通量筛选。2. -种高通量筛选羰基还原酶活性和立体选择性的方法，该发明的特征在于包含如下 步骤： 1) 将待测的消旋醇或者手性醇和羰基还原酶、NAD(P) +溶液混合后，反应1-3分钟， 2) 加入金橙I和偶氮还原酶AzoB，反应若干时间后， 3 )直接肉眼观测或者利用酶标仪或紫外分光光度计检测。3. 本方法的反应体系为磷酸缓冲溶液（pH6. (T9. 0)或Tris-HCl缓冲溶液（pH 6.0~9.0)，底物为消旋醇或者手性醇的终浓度为0.11111~50 1111，辅酶~40(?)+的终浓度为 0. 1mlTlmM，颜色标示物偶氮染料金橙I的终浓度为0.l(T〇. 5mM;羰基还原酶、偶氮还原 酶可以为破菌液、粗酶粉、粗酶液或者纯化后的酶粉、酶液的任何一种，用量为〇. 001mg~10 mg； 一种权利要求2所述的筛选方法，其特征在于：该方法适用于能够在氧化醇生成NAD(P)Η的羰基还原酶。4. 一种权利要求2所述的筛选方法，其特征在于：该方法适用的温度范围为15°C~ 42。。。5. 本筛选方法可以进行微量化，在常用的96孔板或者384孔板中进行。
【专利摘要】本发明公布了一种高通量筛选羰基还原酶活性和立体选择性的方法，该方法利用羰基还原酶氧化时生成的辅因子NAD（P）H和偶氮染料为底物，利用偶氮还原酶将偶氮染料还原引起的颜色变化实现羰基还原酶的高通量筛选。本发明的方法可以快速有效的实现羰基还原酶的筛选，并且可以在96孔板或者是384孔板中实现，该方法既可以在利用检测紫外波长变换进行检测，也可以利用肉眼直接观察，是一种非常可靠的筛选方法。
【IPC分类】C12Q1/26, C12Q1/32
【公开号】CN105463060
【申请号】CN201410457947
【发明人】吴洽庆, 冯进辉, 陈曦, 马延和, 朱敦明
【申请人】中国科学院天津工业生物技术研究所
【公开日】2016年4月6日
【申请日】2014年9月11日