Msc促进血管新生能力的定量方法
【技术领域】
[0001 ]本发明涉及干细胞领域，具体而言，涉及MSC促进血管新生能力的定量方法。
【背景技术】
[0002] 间充质干细胞(Mesenchymalstemcells，MSC)是一类源于中胚层的异质细胞群， 可以从人体大多数组织获取。它们具有自我更新能力、组织修复、免疫调节能力，可以向中 胚层分化，例如:脂肪细胞、骨细胞、软骨细胞等，其中，胎盘和脐带来源的MSC具有分化潜力 大、增殖能力强、免疫原性低、取材方便，没有道德理论问题的限制、易于工业化制备等特 征，是最具临床前景的多功能干细胞之一。
[0003]血管是人体的重要组成部分，它构成了循环系统的主体。长期以来，对于人自体血 管内皮细胞的各项研究绝大多数是基于人脐静脉内皮细胞(Humanvascularendothelial cell，HUVEC)。一方面，脐带来源丰富，容易获取；另一方面，脐带血管没有分支，便于操作， 而且脐带有着理想的长度，能够保证细胞的足够量。
[0004] MSC的促血管新生的特性对肢体缺血的治疗有着非常重要的临床意义。但是目前 缺乏评价MSC的促血管新生能力的方法，阻碍了MSC在治疗肢体缺血方面的临床应用。
[0005]本发明旨在建立一种MSC促进血管新生能力的定量方法，对MSC促进血管新生能力 进行评价，以指导临床应用，保证MSC的疗效。
【发明内容】
[0006]本发明的第一技术方案为一种MSC促进血管新生能力的定量方法，其特征在，建立 共培养体系，
[0007]在该共培养体系中共培养MSC和内皮细胞，其中，MSC通过因子分泌的方式来促进 内皮细胞的增殖，
[0008]检测所述内皮细胞的增殖数量，
[0009]由所述内皮细胞的增殖数量，对MSC的促血管新生能力进行定量和评价。
[0010] 第二方案基于第一技术方案，其特征在于，所述内皮细胞为HUVEC细胞。
[0011] 第三方案基于第二技术方案，其特征在于，还检测VEGF因子，由VEGF因子的数量对 MSC的促血管新生能力进行定量和评价。
[0012] 第四方案基于第三技术方案，其特征在于，在建立共培养体系时，确定孵育时间、 共培养时间、MSC和内皮细胞的细胞数的比例。
[0013] 第五方案基于第四技术方案，其特征在于，所述孵育时间为2h、共培养时间为72h、 MSC和内皮细胞的细胞数的比例为1/10。
[0014]第六技术方案基于第一至第五中的任一技术方案，其特征在于，在建立共培养体 系时，应用不同来源的MSC与内皮细胞进行共培养，选择促进内皮细胞增殖数量最少的MSC 细胞，进行移植治疗，确认其促血管新生能力。
【附图说明】
[0015] 图1示出了培养的HUVEC细胞；
[0016] 图2示出了CCK8孵育HUVEC细胞2h后标准曲线；
[0017] 图3示出了CCK8孵育HUVEC细胞4h后标准曲线；
[0018] 图4示出了外源添加VEGF因子量与HUVEC细胞数之间标准曲线；
[0019 ] 图5示出了MSC和HUVEC共培养48h后HUVEC的增殖量；
[0020] 图6示出了MSC和HUVEC共培养7 2h后HUVEC的增殖量；
[0021] 图7示出了MSC/HUVEC不同比例促进HUVEC的增殖；
[0022] 图8示出了MSC/HUVEC不同比例促进HUVEC的增殖；
[0023]图9示出了不同来源的MSC样品促进HUVEC的增殖；
[0024]图10示出了激光多普勒检测缺血下肢的血流灌注量，证明MSC在体内能够促进血 管新生。
【具体实施方式】
[0025]下面结合附图与具体实施方案对本发明进行说明，具体实施方案应该理解为仅为 举例说明，不是限定性的，不应以下述举例说明来限定本发明的保护范围。
[0026]本实施方式中，共培养体系中，在上腔中种植MSC，通过分泌因子而不是直接接触 作用于下腔的HUVEC，促进HUVEC的增殖，应用CCK8试剂盒检测HUVEC的增殖数量，以此来衡 量MSC促血管新生能力，评价其生物学效力。
[0027]以下对MSC促血管新生能力的量化和评价进行说明。在本实施方式中，内皮细胞采 用HUVEC。具体方法如下：
[0028] (1)从脐带中分离HUVEC细胞，在T75细胞培养瓶中进行培养，培养条件是37°C，5 % C〇2〇
[0029] (2)将MSC和培养后的HUVEC共培养，共培养条件为:上下腔中MSC/HUVEC为1/10,共 培养72h后按照CCK8的试剂盒说明加入CCK8检测液，孵育2h后检测细胞增殖的数量和VEGF 因子的量。
[0030] (3)由HUVEC细胞增殖的数量和VEGF因子的量，对MSC的促血管新生能力进行定量 和评价。
[0031] 细胞增殖的数量和VEGF因子的量的检测，通过以下方法进行。
[0032] 通过共培养实验制作标准曲线：1)制作HUVEC细胞数与0D值之间的标准曲线;2)制 作VEGF因子的量与HUVEC细胞数之间的标准曲线。
[0033]孵育2h后取其上清液进行酶标0D450/630的测定，结合标准曲线对细胞增殖的数 量以及分泌的因子数进行分析得到。
[0034]以下以实施例的方式对共培养体系的建立和条件进行说明。
[0035]实施例1.HUVEC细胞的扩增及鉴定
[0036] 从新鲜的脐带中分离得到HUVEC细胞，种在T75细胞培养瓶中在37°C，5 %⑶2进行 培养，培养到P5代，对细胞进行表型鉴定。鉴定的结果如表一和图1所示，细胞保持明显的HUVEC形态和特征。
[0037]表一、HUVEC表型鉴定
[0039]实施例2.CCK8孵育时间的选择及HUVEC标准曲线的制定。
[0040] 在24孔板中种植不同密度HUVEC细胞，待贴壁后，按照CCK8试剂盒使用说明加入CCK8检测液进行孵育，分别在孵育2h和4h的时候取部分上清液进行酶标测定(0D450/630)， 实验结果显示孵育不同时间后检测的活细胞数与0D值均存在一定的线性关系。图2是CCK8 孵育2h后标准曲线，图3是CCK8孵育4h后标准曲线。随着孵育时间的延长，0D值变大，但是 2hr和4hr的斜率是一样的，所对应的细胞数一样。最终确定孵育时间为2h，即最佳孵育时间 为2h。
[0041]实施例3.共培养时间的选择及VEGF标准曲线的制定
[0042] 在24孔板中种植HUVEC细胞，饥饿培养后正常培养，在培养液中添加VEGF因子，梯 度为4ng，2ng，lng，Ong，每组设定3个复孔，以此绘制标准曲线，检测共培养体系中MSC分泌 到培养液中的VEGF因子的量。选取剩余孔加悬挂式培养皿（transwell)，在transwell中种 植1^(：肩3(：/!1爪^(：细胞数的比为2/15、