Manoalide在制备抑制新生血管形成药物中的应用的制作方法

本发明涉及已知化合物的新应用领域，具体地，涉及Manoalide在制备抑制新生血管形成药物中的应用。

背景技术：

血管新生是指从已经存在的毛细血管长出新的血管的生物学过程，它是一系列的生理、病理过程中非常重要的环节。在生理状态下，如胚胎发育、伤口愈合以及月经周期中卵巢、子宫的周期性变化都依赖于新生的血管提供氧气、养料及带走代谢的废物。病理状态下局部缺血的组织、心梗后再灌注，这时有明显的血管新生，这种血管新生过程在治疗中应得到促进以利于疾病的治疗。相反地，肿瘤、动脉粥样硬化、类风湿性关节炎、节段性回肠炎、糖尿病性视网膜病变、银屑病、子宫内膜异位症、肥胖症等疾病将会从抑制血管新生方面达到治疗疾病的效果。

目前抑制血管新生的药物有贝伐单抗、恩度和反应停、舒尼替尼（Sunitinib）；马立马司他（Marimastat）；TNP-470等，但是这些药物有各自的局限性，如手足皮肤反应、心血管毒性、肾毒性等副作用，可以增加致死性不良事件的风险。最常见的致死性不良事件为出血、心肌梗死、肝衰竭、高血压和蛋白尿等。

技术实现要素：

本发明为了克服现有技术的上述不足，提供了Manoalide在制备抑制新生血管形成药物中的应用。

为了实现上述目的，本发明是通过以下技术方案予以实现的：

本发明要求保护Manoalide在制备抑制新生血管形成药物中的应用。

因为鸡胚绒毛尿囊膜（CAM）模型和鸡胚卵黄囊膜（YSM）模型是本技术领域用于检测或筛选对新生血管生成具有影响作用药物的典型性和普适性模型，因此，本发明只需要在这两种代表性模型中证明Manoalide可以抑制新生血管形成，就可以强有力的证实Manoalide可以用于制备抑制新生血管形成的药物。

优选地，本发明要求保护Manoalide在制备抑制肿瘤新生血管形成药物中的应用。

优选地，本发明要求保护Manoalide在制备抑制乳腺癌肿瘤新生血管形成药物中的应用。

一种抑制新生血管形成的药物，含有Manoalide和药学上可接受的辅剂。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明首次发现Manoalide可以抑制鸡胚绒毛尿囊膜模型中二级及三级血管的形成，并可以抑制鸡胚卵黄囊膜模型中血管的生长。另外，在鸡胚绒毛尿囊膜上种植乳腺癌肿瘤细胞(MDA-MB-231)，发现肿瘤细胞在鸡胚绒毛尿囊膜上生长并形成肿瘤，肿瘤内部出现新生血管，用Manoalide处理后，此药可以显著抑制肿瘤内部新生血管形成和肿瘤细胞的生长，由此证明Manoalide可抑制新生血管形成，可以用于制备抑制新生血管形成的药物，该药物可以广泛用于新生血管相关疾病（如肿瘤、动脉粥样硬化、类风湿性关节炎、节段性回肠炎、糖尿病性视网膜病变、银屑病、子宫内膜异位症、肥胖症等）。尤其是肿瘤的血管新生，为临床靶向血管新生治疗肿瘤具有重要的意义。

附图说明

图1为药物处理鸡胚绒毛尿囊膜模型后的观察结果。

图2为药物处理鸡胚卵黄囊膜模型后的观察结果。

图3为药物处理鸡胚绒毛尿囊膜种肿瘤细胞后的观察结果。

具体实施方式

下面结合说明书附图和具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。

实施例1

鸡胚绒毛尿囊膜（CAM）模型的建立及药物处理

1）鸡胚处理：将购买的9天鸡胚表面清洁，然后用1∶1 000新洁尔灭液擦拭，拭干后将鸡胚气室向上，长轴与蛋托呈45°放入普通培养箱中孵化，设定温度(37.8 ±0.5)℃和相对湿度60%，每天照蛋转蛋3次。

2）开窗：孵育第9天，在照蛋器下标记气室，确定开窗位置，用75%酒精消毒后，用慢速牙科钻在气室标记处钻一个1mm³大小的小孔，用眼科弯镊小心揭去蛋壳，形成直径约为1cm的缺口，用眼科镊轻轻揭掉蛋膜暴露鸡胚绒毛尿囊膜。

3）实验分组及加药：Manoalide通过购买获得，开窗后将鸡胚随机分为两组（Manoalide实验组和DMSO对照组）。每组8只鸡胚。实验组加待测药物Manoalide，对照组加相同剂量的对照液DMSO。将Manoalide或DMSO从开口处小心加到尿囊膜上，医用胶布封口，放入37.8℃，50%～60%湿度的恒温箱中孵育48小时。

4）结果观察：加药48小时后，将蛋壳从中线剪开，流净蛋中内容物，肉眼直接观察开窗孔一侧尿囊膜上血管的变化，记录现象，并在体式显微镜下照相观察，统计血管发育情况。

观察指标：以给药点为中心，主干血管向中心盘的弯曲和靠近称之为血管的吸引；周围血管放射状朝向中心的生长状态，称为血管辐辏。反之，无此向心生长情况，且比正常发育情况下的血管网密度小，血管细且数量显著减少，出现明显的无血管区域则存在待定的血管生长发育抑制作用。

结果如图1所示，A为Manoalide处理的鸡胚绒毛尿囊膜的血管变细，并且二级及三级血管分支变少。B为对血管密度增长率的统计，***P＜0.001。可见，Manoalide抑制了9天鸡胚CAM的血管形成。

实施例2

鸡胚卵黄囊膜（YSM）模型的建立及药物处理

1）种蛋处理：将种蛋表面清洁，然后用1:1 000新洁尔灭液浸泡3min，拭干后将鸡胚气室向上，长轴与蛋托呈45°放入普通培养箱中孵化，设定温度(37.8 ±0.5)℃和相对湿度60%，每天照蛋、转蛋3次。

2）实验方法：取孵化2.5天的鸡胚，将鸡卵内容物倾倒入无菌平皿中，将红色和黑色记号笔标记的两个同样大小的硅胶环放置到鸡胚卵黄囊血管网上血管较少的不同位置，盖好平皿盖(不需封闭)，放入37～38℃孵育箱中继续孵育3～4h。3～4h后，挑选硅胶环未见移位、卵黄囊膜完整、血管网及胚盘发育良好的鸡胚，红色标记的硅胶环中加入待测药物Manoalide，黑色标记的胶圈加入相同剂量的对照液DMSO作为自身对照，然后继续孵育。

结果观察：于加药后0h、12h、24h分别在体式显微镜下拍照，观察胶圈内和周围的YSM血管密度、走向。采用Image-ProPlus6.0图像分析系统分析拍摄实验区域整个硅胶圈内的血管，以血管面积和血管密度的变化作为分析指标。

加药后12h的观察结果如图2所示，A左侧为用0.1%DMSO处理的自身对照，右侧为用Manoalide处理后的结果；B为对血管面积增长率的统计。*P＜0.05；**P＜0.01。可见，DPPA抑制了3天鸡胚YSM的血管生成。

实施例3

鸡胚绒毛尿囊膜（CAM）接种肿瘤细胞模型的建立及药物处理：将购买的鸡胚种蛋用75%乙醇擦拭表面，鸡胚气室向上，长轴与蛋托呈45°放入普通培养箱中孵化，设定温度（38±0.5）℃和相对湿度60%，每天照蛋、转蛋，弃去未受精或死胚。持续孵育8～10d，标记气室，确定开窗位置，用75%酒精消毒后，用牙科钻在标记处磨出“+”痕迹，再用眼科弯镊小心揭去蛋壳，形成直径约1cm的缺口，用酒精棉球擦拭缺口外缘，用眼科弯镊轻轻揭掉蛋膜，暴露出含有丰富血管的鸡胚卵黄膜组织，用灭菌医用胶布呈十字交叉封口，适应9～16 h。在超净台上揭开医用胶布。将无菌胶圈放在卵黄膜一级血管的半侧附近。把已消过毒的硅胶药圈放在卵黄膜一级血管与二级血管的交汇处。取对数生长期的 MDA-MB-231 细胞，用0.25%的胰酶消化、PBS洗涤、800rpm5min离心去上清后用1mL PBS基重悬，细胞计数后按每个种蛋 CAM 的硅胶药圈中加入 50 μL细胞悬液(约含3×10⁶～5 ×10⁶个细胞)，配置细胞悬液并加入蛋中，保证胶圈与CAM紧贴，以确保加入的细胞悬液不流出胶圈。

30 h后，在超净台上打开胶布，观察肿瘤生长情况，淘汰 CAM膜上没有肿瘤生长的鸡胚种蛋。将带有肿瘤的鸡胚种蛋随机分成 4 组，前3组为实验组，在胶圈中加2μM，4μM，6μM的50μL /个Manoalide，对照组给予相同剂量的 DMSO。用无菌胶布封口，孵育箱继续孵育。24h加药一次，连续加药 3次，确保达到药物的有效浓度。

第3次加药后大约16 h，沿中线剪开鸡蛋，倒净里面的内容物，PBS清洗，体视显微镜拍照测量肿瘤的体积，测量肿瘤区域血管的面积(V)，计算 MVD。肿瘤体积= 4π/3（长径×短径²）。MVD(%) = 肿瘤血管面积/(肿瘤区域亮区面积 + 肿瘤区域暗区面积) ×100%。将 CAM 移植瘤取出，置PBS中清洗。包埋、切片、H&E染色。

H&E染色：H&E染色是取鸡胚绒毛尿囊膜上生长的肿瘤组织得到的石蜡切片，厚度为3～4μm。组织石蜡切片脱蜡、苏木素染色4分钟，反蓝，伊红染色3 秒，37℃过夜、封片。正置显微镜下观察各个组织血管密度变化并拍照。