一种抑制血管新生或生长的多肽及其应用
【专利摘要】本发明属于生物医药领域，具体涉及一种抑制血管新生或生长的多肽、其编码序列、包含该编码序列的载体、宿主细胞、药物组合物以及所述多肽的制药用途。本发明的多肽分子量小、水溶性好、安全性高、稳定性好，可通过固相合成的方法制备，纯度高，产量大，成本低。
【专利说明】
一种抑制血管新生或生长的多肽及其应用
技术领域
[0001] 本发明属于生物医药领域，具体地，涉及一种抑制血管新生或生长的多肽。
【背景技术】
[0002] 新生血管的形成是一个极其复杂的过程，它包括：现存血管的扩张、血管通透性的 增加、血管周围基质的降解、内皮细胞的激活增殖、迁移以及新的毛细血管样管腔的形成。 在正常生理条件下，血管的生成是一个受多个环节严密调节的过程，对修复和维持机体的 正常功能具有重要的作用。然而，如果肿瘤内部血管快速生长，则是临床常见的现象之一。 大量的动物模型和人体临床试验表明，阻断肿瘤内新生血管的形成可以有效地阻止肿瘤的 生长和引发肿瘤细胞的死亡，从而达到对肿瘤的治疗作用。因此，抑制血管新生是目前抗肿 瘤新药研究的重要方向之一。大分子抗新生血管药物如Avastin已经通过美国FDA的上市 批准，同时还有更多的药物处于不同的临床前和临床研究阶段。
[0003] 在眼部，约2/3的致盲性疾病均与病理性新生血管有关，例如：单纯疱疹性角膜 基质炎引起的角膜新生血管、年龄相关性黄斑变性中的脉络膜新生血管以及糖尿病视网膜 病变或早产儿视网膜病变中的视网膜新生血管等。目前临床上，对于眼部病理性新生血 管常规运用激光光凝、光动力学疗法（Photodynamic therapy, F1DT)以及经瞳孔温热疗法 (Thermal transpupillary therapy, TTT)等进行治疗。然而，这些治疗手段不仅对局部 组织易造成破坏，其远期疗效也并不令人十分满意。因此，近年来人们不断尝试开发治疗 眼部病理性新生血管更有效的方法；对于老年性视网膜血管病变（Age-related macular degeneration，简称为AMD)、糖尿病视网膜病变、关节炎等多种与血管新生相关的疾病，抑 制血管新生的治疗新药也有广泛和重要的作用。
[0004] 在开发有效的血管新生抑制剂时，应充分考虑到眼科用药的特殊性。第一，眼部 存在多个解剖性和功能性的屏障：全身给药常常由于血-房水屏障和血-视网膜屏障而无 法在眼组织局部达到足够的药物浓度；局部给药，如玻璃体腔注射，大于76. 5kDa的大分子 在理论上很难穿透视网膜作用于视网膜和脉络膜新生血管；对于眼表给药，药物必须要先 后穿透亲脂性的角膜上皮细胞紧密连接和亲水性的角膜基质，因此只有具备适当脂溶性、 低分子量或能与眼表组织内的转运体（如：氨基酸转运体、寡肽转运体等）结合的药物才 能到达前房发挥作用。第二，药物在亲水的泪液、房水、玻璃体液中溶解的程度与其有效性 呈正相关。第三，基于上述主要原因，眼科用药的生物利用度很低；要使之提高，需加大给 药的浓度。但是用于治疗肿瘤新生血管的化合物毒副作用较为明显，全身和局部均无法高 剂量给药。此外，分子量较大的外源性蛋白质也是敏感的异物源，可对眼部组织（如：葡 萄膜）造成免疫损伤。第四，目前虽然已经有一系列相对安全的内源性血管新生抑制剂被 先后证实，如血管抑素（angiostatin)，它由纤溶酶原Kringle结构域1-4(plasminogen Kringle 1-4)组成，可明显抑制血管依赖性肿瘤的生长，但由于其分子量较大且空间构象 复杂，故在制备过程中存在重组表达纯化工艺繁琐和内毒素残留等不足。正是由于上述种 种条件的限制，目前用于治疗眼部新生血管的药物十分有限，比如重组抗人VEGF单克隆抗 体 bevacizumab (Avastin)、重组抗人 VEGF 单克隆抗体片段 ranibizumab (Lucentis)等，但 它们价格高昂，并且需反复经玻璃体腔给药，甚至可引起血管栓塞等风险。
[0005] 由此可见，寻找具有特异生物学活性和生物相容性的小分子抑制剂，且价格便宜， 减少局部和全身的副作用，对新生血管性疾病的临床防治具有十分重要的意义。
【发明内容】
[0006] 本发明目的在于提供一种新的抑制血管新生或生长的多肽，该多肽属于小分子抑 制剂，价格便宜，能够有效地抑制血管新生或生长，并减少局部和全身的副作用。
[0007] 为了达到上述目的，本发明提供了以下技术方案：
[0008] 在一个方面，本发明提供一种抑制血管新生或生长的多肽，所述多肽含有SEQ ID NO: 1所示序列。
[0009] 在优选的实施方式中，所述多肽为在前述SEQ ID NO: 1序列的前面按次序增加 SEQ ID NO: 2 (AVSLLRATG)的从C端开始的任一个或多个氨基酸；或在前述SEQ ID NO: 1的后面 按次序增加 SEQ ID NO: 3 (HAVPV)的从N端开始的任意一个或多个氨基酸；或前后都按上述 次序增加 SEQ ID N0:2和SEQ ID N0:3中的任一个或多个氨基酸。
[0010] 在进一步优选的实施方式中，本发明的多肽为：
[0011] SK001 :其氨基酸序列为SEQ ID N0:1 ;SK002 :其氨基酸序列为SEQ ID N0:5 ; SK003:其氨基酸序列为SEQ ID N0:7;SK004:其氨基酸序列为SEQ ID N0:9;SK005:其氨 基酸序列为SEQ ID NO: 11 ;SK006:其氨基酸序列为SEQ ID NO: 13 ;SK007:其氨基酸序列 为SEQ ID NO: 15 ;SK008:其氨基酸序列为SEQ ID NO: 17 ;SK009:其氨基酸序列为SEQ ID N0:19;SK010:其氨基酸序列为SEQ ID N0:21;SK011:其氨基酸序列为SEQ ID N0:23; SK012 :其氨基酸序列为SEQ ID N0:25 ;SK013 :其氨基酸序列为SEQ ID N0:27 ;SK014 :其氨 基酸序列为SEQ ID N0:29 ;SK015 :其氨基酸序列为SEQ ID N0:31 ;SK016 :其氨基酸序列为 SEQ ID N0:33 ;SK017 :其氨基酸序列为SEQ ID N0:35 ;或SK018 :其氨基酸序列为SEQ ID N0:37〇
[0012] 在另一方面，本发明提供编码上述多肽的核苷酸序列。在优选的实施方式中，所述 核苷酸序列为：
[0013] skOOl :核苷酸序列为 SEQ ID N0:4 ;sk002 :核苷酸序列为 SEQ ID N0:6 ;sk003 : 核苷酸序列为SEQ ID N0:8;sk004:核苷酸序列为SEQ ID N0:10;sk005:核苷酸序列为 SEQ ID NO: 12 ;sk006:核苷酸序列为 SEQ ID NO: 14 ;sk007:核苷酸序列为 SEQ ID NO: 16; sk008:核苷酸序列为SEQ ID N0:18;sk009:核苷酸序列为SEQ ID N0:20;sk010:核苷酸 序列为SEQ ID N0:22;sk011:核苷酸序列为SEQ ID N0:24;sk012:核苷酸序列为SEQ ID N0:16 ;sk013 :核苷酸序列为 SEQ ID N0:28 ;sk014 :核苷酸序列为 SEQ ID N0:30 ;sk015 :核 苷酸序列为SEQ ID N0:32 ;sk016 :核苷酸序列为SEQ ID N0:34 ;sk017 :核苷酸序列为SEQ ID N0:36;或sk018:核苷酸序列为SEQ ID N0:38。其中，上述核苷酸序列与数字编号相同 的多肽相对应。
[0014] 在另一方面，本发明提供一种表达所述多肽的表达载体或宿主细胞，包含上述多 肽的核苷酸序列。所述表达载体可以是重组真核表达载体，优选哺乳动物细胞表达载体；也 可以是重组病毒表达载体，优选腺相关病毒或腺病毒载体。所述表达载体能在转化的宿主 细胞中复制表达，优选地，所述宿主细胞为CHO细胞及其亚系或293细胞及其亚系。
[0015] 在另一方面，本发明提供一种制备所述多肽的方法，所述方法为化学合成法或重 组表达法，所述重组表达法包括将上述表达载体引入合适的宿主细胞中，进行多肽的表达。
[0016] 在另一方面，本发明提供一种药物组合物，包含上述多肽或其药学上可接受的盐 和药学上可接受的载体或赋形剂；优选地，所述药物组合物的剂型为注射剂、眼药水、眼用 凝胶或眼药膏。
[0017] 在另一方面，本发明提供一种本发明所述多肽或药学上可接受的盐在制备治疗 或预防由血管新生或生长引起的疾病的药物中的应用。所述疾病优选为眼睛疾病、肿瘤、 缺血性心脏病、非炎症性心肌病、冠状动脉硬化、闭塞性动脉硬化、动脉栓塞、动脉血栓、 Berger's病、慢性炎症、炎症性肠病、溃疡、风湿性关节炎、硬皮症、银屑病、不育症或肉瘤状 病；所述眼睛疾病优选为年龄相关性黄斑变性、糖尿病性视网膜病变、脉络膜新生血管、黄 斑囊样水肿、糖尿病性黄斑水肿、视网膜血管闭塞、角膜新生血管、角膜移植手术新生血管 性青光眼、翼状胬肉或慢性结膜炎。
[0018] 本发明的主要优点，包括：
[0019] (a)本发明多肽分子量小，可透过眼组织屏障；
[0020] (b)水溶性好，能在中性泪液、房水和玻璃体液中保持较高的浓度；
[0021] (C)安全性高，对生物组织毒副作用小；并且眼局部用药生物利用度高，可减少剂 量，从而减小全身副作用；
[0022] (d)可通过固相合成的方法制备，纯度高，产量大，成本低；
[0023] (e)本发明多肽的稳定性好。
【附图说明】：
[0024] 图1是小肽SKOll的高效液相色谱及质谱分析的纯度鉴定的一级质谱图；
[0025] 图2是小肽SKOll的高效液相色谱及质谱分析的纯度鉴定的二级质谱图。
【具体实施方式】
[0026] 活性多肽
[0027] 在本发明中，本发明的多肽指具有血管新生抑制活性的蛋白或多肽。所述术语包 括具有抑制血管新生或生长功能的、包含序列SEQ ID NO :1的多肽及其变异形式。这些变 异形式包括（但并不限于）：1-3个（通常为1-2个，更佳地1个）氨基酸的缺失、插入和/ 或取代，以及在C末端和/或N末端添加或缺失一个或数个氨基酸。此外，所述术语还包括 单体和多聚体形式的本发明多肽、线性以及非线性的多肽（如环肽）。如本文所用，术语"片 段"、"衍生物"和"类似物"是指基本上保持抑制血管新生功能或活性的多肽。本发明的多 肽片段、衍生物或类似物可以是（i)有一个或几个保守或非保守性氨基酸残基（优选保守 性氨基酸残基）被取代的多肽，或（ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽， 或（iii)本发明的多肽与另一个化合物（比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇） 融合所形成的多肽，或（iv)附加的氨基酸序列融合于此多肽序列而形成的多肽（与前导序 列、分泌序列或6His等标签序列融合而形成的然后蛋白）。根据本文的教导，这些片段、衍 生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。
[0028] 本发明的多肽类似物与本发明的多肽的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以 是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。类似物还包括具有不同于天然L-氨基 酸的残基（如D-氨基酸）的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸（如β、Y-氨 基酸）的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。修饰（通常 不改变一级结构）形式包括：体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰 还包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中通过糖基化的酶（如哺 乳动物的糖基化酶或去糖基化酶）而完成的修饰。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基 (如磷酸酪氨酸、磷酸丝氨酸、磷酸苏氨酸）的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水 解性能或优化了溶解性能的多肽。
[0029] 本发明的多肽还可以以由药学或生理学可接受的酸或碱衍生的盐形式使用。这 些盐包括（但不限于）与如下酸形成的盐：氢氯酸、氢溴酸、硫酸、柠檬酸、酒石酸、磷酸、乳 酸、丙酮酸、乙酸、琥珀酸、草酸、富马酸、马来酸、草酰乙酸、甲磺酸、乙磺酸、苯磺酸或羟乙 磺酸。其它盐包括：与碱金属或碱土金属（如钠、钾、钙或镁）形成的盐，以及以酯、氨基甲 酸酯或其他常规的"前体药物"的形式。
[0030] 编码序列
[0031] 本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA可以是编码链或非编码链。本 发明的核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。 目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明多肽（或其片段，或其衍生物）的DNA 序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子（或如载体）和细胞 中。
[0032] 本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体或本发明多肽 的编码序列经基因工程产生的宿主细胞。
[0033] 制备方法
[0034] 本发明多肽可以是重组多肽或合成多肽，相应地，本发明多肽可用常规方法人工 合成，也可用重组方法生产。一种优选的方法是使用液相合成技术或固相合成技术，如Boc 固相法、Fmoc固相法或是两种方法联合使用。固相合成可快速获得样品，可根据目的肽的 序列特征选用适当的树脂载体及合成系统。例如，Fmoc系统中优选的固相载体如连接有肽 中C端氨基酸的Wang树脂，Wang树脂结构为聚苯乙烯，与氨基酸间的手臂是4-烷氧基苄 醇；用25%六氢吡啶/二甲基甲酰胺室温处理20分钟，以除去Fmoc保护基团，并按照给定 的氨基酸序列由C端逐个向N端延伸。合成完成后，用含4 %对甲基苯酚的三氟乙酸将合成 的胰岛素原相关肽从树脂上切割下来并除去保护基，可过滤除树脂后乙醚沉淀分离得到粗 肽。将所得产物的溶液冻干后，用凝胶过滤和反相高压液相层析法纯化所需的肽。当使用 Boc系统进行固相合成时，优选树脂为连接有肽中C端氨基酸的PAM树脂，PAM树脂结构为 聚苯乙烯，与氨基酸间的手臂是4-羟甲基苯乙酰胺；在Boc合成系统中，在去保护、中和、偶 联的循环中，用TFA/二氯甲烷（DCM)除去保护基团Boc并用二异丙基乙胺（DIEA)二氯甲烷 中和。肽链缩合完成后，用含对甲苯酚（5-10% )的氟化氢（HF)在0°C下处理1小时，将肽 链从树脂上切下，同时除去保护基团。以50-80%乙酸（含少量巯基乙醇）抽提肽，溶液冻 干后进一步用分子筛Sephadex GlO或Tsk_40f分离纯化，然后再经高压液相纯化得到所需 的肽。可以使用肽化学领域内已知的各种偶联剂和偶联方法偶联各氨基酸残基，例如可使 用二环己基碳二亚胺（DCC)，羟基苯骈三氮唑（HOBt)或1，1，3, 3-四脲六氟磷酸酯（HBTU) 进行直接偶联。对于合成得到的短肽，其纯度与结构可用反相高效液相和质谱分析进行确 证。
[0035] 另一种方法是用重组技术产生本发明多肽。通过常规的重组DNA技术，可利用本 发明的多核苷酸来表达或生产重组的SK系列多肽。一般来说有以下步骤：
[0036] (1)将编码本发明多肽的多核苷酸（或变异体），或用含有该多核苷酸的重组表达 载体转化或转导合适的宿主细胞；（2)在合适的培养基中培养宿主细胞；(3)从培养基或细 胞中分离、纯化蛋白质。
[0037] 重组多肽可在细胞内或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物 理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技 术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理 (盐析方法）、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析（凝胶过滤）、吸附层析、离子交 换层析、高效液相层析（HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。
[0038] 由于本发明多肽较短，因此可以考虑将多个多肽串联在一起，重组表达后获得多 聚体形式的表达产物，然后通过酶切等方法形成所需的小肽。
[0039] 药物组合物和施用方法
[0040] 本发明还提供了一种药物组合物，它含有（a)安全有效量的本发明多肽或其药学 上可接受的盐；以及（b)药学上可接受的载体或赋形剂。药物组合物中，本发明多肽的量通 常为10微克-100毫克/剂，较佳地为100-1000微克/剂。为了本发明的目的，有效的剂 量为给予个体约0. 01毫克/千克至50毫克/千克，较佳地0. 05毫克/千克至10毫克/ 千克体重的本发明多肽。此外，本发明的多肽可以单用，也可与其它治疗剂一起使用（如配 制在同一药物组合物中）。
[0041] 所述药物组合物还可含有药学上可接受的载体。术语"药学上可接受的载体"指用 于治疗剂给药的载体。该术语指这样一些药剂载体：它们本身不诱导产生对接受该组合物 的个体有害的抗体，且给药后没有过分的毒性。这些载体是本领域普通技术人员所熟知的。 在 Remington' s Pharmaceutical Sciences(Mack Pub. Co.，N.J· 1991)中可找到关于药学 上可接受的赋形剂的充分讨论。这类载体包括（但并不限于）：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘 油、乙醇、佐剂及其组合。药学上可接受的载体可含有液体，如水、盐水、甘油和乙醇。另外， 这些载体中还可能存在辅助性的物质，如润湿剂或乳化剂、PH缓冲物质等。通常，可将治疗 性组合物制成可注射剂，例如液体溶液或悬液；还可制成在注射前适合配入溶液或悬液中、 液体载体的固体形式。
[0042] 一旦制成本发明的组合物，可将其通过常规途径进行给药，其中包括（但并不限 于）：眼表、眼周、眼内（尤其是玻璃体腔内）、肌内、静脉内、皮下、皮内或局部给药。待预防 或治疗的对象可以是动物；尤其是人。
[0043] 当本发明的药物组合物被用于实际治疗时，可根据使用情况而采用各种不同剂型 的药物组合物。较佳地，可以例举的有眼药水、针剂（尤其是玻璃体腔内注射剂）、眼用凝胶 和眼药膏。
[0044] 这些药物组合物可根据常规方法通过混合、稀释或溶解而进行配制，并且偶 尔添加合适的药物添加剂，如赋形剂、崩解剂、粘合剂、润滑剂、稀释剂、缓冲剂、等渗剂 (isotonicities)、防腐剂、润湿剂、乳化剂、分散剂、稳定剂和助溶剂，而且该配制过程可根 据剂型利用惯常方式进行。例如，眼药水的配制可这样进行：将本发明的多肽或其药学上可 接受的盐与基本物质一起溶解于无菌水（在无菌水中溶解有表面活性剂）中，调节渗透压 和酸碱度至生理状态，并可任意地加入合适的药物添加剂如防腐剂、稳定剂、缓冲剂、等渗 剂、抗氧化剂和增粘剂，然后使其完全溶解。
[0045] 本发明的药物组合物还可以缓释剂形式给药。例如，本发明的多肽或其盐可被 掺入以缓释聚合物为载体的药丸或微囊中，然后将该药丸或微囊通过手术植入待治疗的 组织中。此外，本发明的多肽或其盐还可通过插入预先涂有药物的眼内透镜而得以应 用。作为缓释聚合物的例子，可例举的有乙烯-乙烯基乙酸酯共聚物、聚羟基甲基丙烯酸 酯（polyhydrometaacrylate)、聚丙烯酰胺、聚乙烯批略烧酮、甲基纤维素、乳酸聚合物、乳 酸-乙醇酸共聚物等，较佳地可例举的是可生物降解的聚合物如乳酸聚合物和乳酸-乙醇 酸共聚物。
[0046] 当本发明的药物组合物被用于实际治疗时，作为活性成分的本发明的多肽或其药 学上可接受的盐的剂量，可根据待治疗的每个病人的体重、年龄、性别、症状程度而合理地 加以确定。例如，当局部滴眼时，通常其浓度约为〇. l-l〇wt%，较佳地l_5wt%，每日可2-6 次给药，每次1-2滴。
[0047] 血管内皮生长因子与血管新生
[0048] 血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor, VEGF)是新生血管形 成过程中的一个主要介导因子，VEGF基因经过转录水平的剪切至少可产生7种VEGF变异 体，其中VEGF165(VEGF-A，即原型VEGF)是最常见、最主要的一种。其主要的生物学功能为： 选择性增强血管内皮细胞有丝分裂，刺激血管内皮细胞增殖并促进血管形成；增强血管尤 其是小血管的渗透性，使血浆蛋白等大分子（主要是纤维蛋白原）外渗沉积在血管外的基 质中，为新生毛细血管网的建立提供营养。
[0049] 因此，科研人员针对VEGF的抑制进行了很多研究。贝伐单抗（bevacizumab)是一 种重组抗人VEGF单抗，它是第一个由美国FDA批准运用于治疗转移性结肠癌患者的抗新生 血管药物。玻璃体注射bevacizumab亦能有效抑制视网膜及脉络膜新生血管。另一种VEGF 抑制剂Ranibizumab,是一种重组抗人VEGF单抗片段。它是第一个被美国FDA批准用于治 疗眼部新生血管性黄斑变性的抗新生血管类药物。目前，人们仍在不断寻找新的更加安全 有效的治疗眼部新生血管的药物。
[0050] 本发明人经过广泛而深入的研究，首次制备了一类分子量小于5kD(如仅约 l-2kD)的小分子多肽。具体而言，本发明人应用生物信息学的方法，基于同源性分析和生物 学特性等分析，设计了数个候选序列，采用固相法将其合成，分离纯化获得高纯度的本发明 的多肽，经VEGF诱导的人脐静脉内皮细胞增殖模型、鸡胚尿囊膜血管模型以及大鼠角膜缝 线模型筛选，获得了一类新型的、具有预防和治疗血管新生功能的小分子多肽。
[0051] 实验模型
[0052] 人脐静脉内皮细胞（HUVEC)检测
[0053] 血管新生指的是在原始血管丛或已存在血管的基础上以出芽的方式形成新生血 管的过程。在病理情况下，机体内已存在的血管受到促血管生成因子的刺激，发生扩张，血 管内皮细胞活化、增殖、迁移、小管腔样结构形成。其中，内皮细胞自我增殖是血管新生的基 础，它为形成新生血管提供所必须的细胞数量。因此，本发明以内皮细胞增殖作为药物干预 的靶点，应用CCK-8方法（购自Dojindo)对人脐静脉内皮细胞（HUVEC)进行检测，以探讨 多肽SK004在抗血管新生过程中抑制内皮细胞增殖的作用。
[0054] 大鼠角膜缝线模型
[0055] 大鼠角膜缝线模型是经典的眼部新生血管干预模型，可重复性好，可定量分析并 且成本较低，普遍用于检测抗新生血管药物的活性作用。
[0056] 工业应用性
[0057] 含有本发明肽或其药学上可接受盐作为活性成分的药物组合物，对血管新生或生 长有显著的抑制活性。经动物试验证实，本发明多肽不仅可以抑制鸡胚尿囊膜的血管新生， 还可抑制大鼠角膜新生血管，而且可以抑制人脐静脉血管内皮细胞的增殖作用。因此本发 明多肽有望开发成药物，用于治疗新生血管性眼病及相关的新生血管性疾病，如肿瘤新生 血管等。
[0058] 序列说明：
[0059] 以下多肽作为对照多肽，来自中国专利CN 201010235580. 4。
[0060] 多肽SK050,其氨基酸序列为SEQ ID NO: 39,核苷酸序列为SEQ ID NO: 40 ;
[0061] 多肽SK051，其氨基酸序列为SEQ ID N0:41，核苷酸序列为SEQ ID N0:42 ;
[0062] 多肽SK052,其氨基酸序列为SEQ ID NO: 43,核苷酸序列为SEQ ID NO: 44 ;
[0063] 多肽SK053,其氨基酸序列为SEQ ID NO: 45,核苷酸序列为SEQ ID NO: 46。
[0064] 应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文中具体描述的各 技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一 累述。
[0065] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条 件如 Sambrook 等人，分子克隆：实验室手册（New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
[0066] 实施例一：小肽SKOll的合成及分离纯化
[0067] 采用市售的SYMPHONY型12通道多肽合成仪（美国Protein Technologies公 司），合成序列为SEQ ID N0:23所示的SKOll多肽。具体方法如下：根据多肽合成仪的软 件（Version. 201版）计算配置试剂，将2-Chlorotrityl Chloride Resin树脂（天津市南 开合成科技有限公司）放入反应管中，加 DMF (15ml/g) (Dikma)，振荡30min。通过沙芯抽滤 掉溶剂，分别加入3倍摩尔过量的Fmoc-L-H-OH(Fmoc-亮氨酸-组氨酸-OH)(小肽SKOl 1) 氨基酸（苏州天马医药集团精细化学品有限公司），再加入10倍摩尔过量的DIEA (国药集 团上海化学试剂公司），最后加入DMF溶解，振荡30min。去掉DMF，加20%哌啶（国药集 团上海化学试剂公司）01^溶液（151111/^)，51^11，去掉01^，再加20%哌啶01^溶液（151111/ g)，15min。抽掉哌啶溶液，取十几粒树脂，用乙醇洗三次，加入茚三酮，KCN，苯酚溶液各一 滴，105°C -IKTC加热5min，变深蓝色为阳性反应。用DMF(IOmVg)洗两次，甲醇（IOml/ g)洗两次，DMF(IOmVg)洗两次。加入保护氨基酸（FOMC-Asp-OH)三倍过量，HBTU(苏州 天马医药集团精细化学品有限公司）三倍过量，均用尽量少DMF溶解，加入反应管，立刻加 入NMM十倍过量，反应30min。用DMF(IOmVg)洗一次，甲醇（lOml/g)洗两次，DMFdOml/ g)洗两次。重复上述操作步骤，从右到左依次连接小肽SKOll序列中的氨基酸。最后一个 氨基酸连接后，脱保护，用DMF(IOmVg)洗两次，甲醇（lOml/g)洗两次，DMF(IOmVg)洗两 次，DCM(IOmVg)洗两次，以此洗去树脂，再抽干lOmin。从树脂上切割多肽（切割液（10/ g):TFA(J·T·Baker)94·5%，水2·5%，EDT(ALDRICH)2·5%，TIS(ALDRICH)l% ;切割时间： 120min)。将裂解液用氮气（上海比欧气体工业公司）尽量吹干，用乙醚（上海试一化学试 剂有限公司）洗六次，然后常温挥干。最后将纯化后的溶液冻干，既得到高纯度（>95%)的 小肽SKOll。
[0068] 用HPLC (SHIMADZU高效液相色谱仪型号：制备型，分析型，软件=Class-VP. SevialSystem，厂商：SHIMADZU)纯化多肽，将粗肽用纯水或者加少量乙腈（Fisher)溶解， 按照下列条件分别纯化小肽SK011。
[0069] 色谱柱：Agilent Eclipse plus C18RRHD 1. 8 μ m 2.1X1 50mm
[0070] 流动相A :0.1 %甲酸水溶液；流动相B :0.1 %甲酸乙腈溶液。梯度如表1 :
[0071] 表1:梯度洗脱条件 L0073」 检测汲长：220nm枉温：3(TC
[0074] 实施例二：小肽SKOll的鉴定及保存
[0075] 取少量的成品小肽SK011，做HPLC分析的纯度鉴定，和ESI-MS的分子量鉴定。条 件如下：电喷雾电离，正离子模式检测，氮气作为鞘气、辅助气和吹扫气。喷雾电压4. 7kV : 鞘气为15arb，辅助气为5arb，吹扫气为Oarb ;毛细管温度：275°C，毛细管电压为40V，透镜 电压为120V。全扫描质量范围：300-2000amu。二级质谱用数据依赖模式采集，全扫描图谱 中+2价分子离子峰用于二级质谱分析，高纯氦气用作碰撞气，碰撞能量为35ev。
[0076] 结果表明，小肽SKOll分子量：1523. 83DA，其结构信息正确，符合理论设计的氨基 酸序列，无位点突变及表达后修饰（结果见图1-2)。
[0077] 将白色粉末状的小肽，密封包装，置于_20°C长期保存。
[0078] 实施例三：衍生多肽SK001-018的制备、鉴定和活性检测
[0079] 按实施例一的方法制备如表3中所示多肽，并按实施例二进行多肽鉴定。这些多 肽的结构信息均正确，与设计的氨基酸序列一致。并按如下方法进行活性检测。
[0080] 1、活性检测原理
[0081] VEGF具有促进HUVEC细胞增殖的活性，本发明多肽具有抑制VEGF的作用，因此本 次检测利用HUVEC细胞进行生物学活性比较，首先接种HUVEC细胞，利用2% FBS-ECM稀释 各个样品，稀释完毕后，各样品与VEGF混合。待细胞贴壁后，吸弃各上样孔中上清液，加入 样品，并做稀释液对照以及VEGF对照，培养4天后，每孔加入20 μ I CCK-8显色液对细胞进 行显色，然后利用酶标仪对显色后的细胞进行测定，测定吸光度值的大小直接反应细胞数 量，根据HUVEC活细胞数，推断各个样品抑制VEGF介导的促HUVEC细胞增殖活性。其中稀 释液对照组作为阴性对照，VEGF对照组作为阳性对照。
[0082] 2、实验仪器及材料（见表2)
[0083] 表2 :试验仪器和材料 L0085」
[0086] 3、实验步骤
[0087] 3. 1复苏细胞
[0088] 从液氮中取出1支HUVEC(SCienCell公司）细胞，37°C快速融化，离心重悬，用 ECGS-ECM 4ml悬浮细胞，进行细胞计数，并加 ECGS-ECM培养基（ScienCell公司，货号 7693)配制2. OX IO4个/ml的细胞悬液。
[0089] 3. 2接种细胞
[0090] 取细胞悬液4ml，加 ECGS-ECM培养基16ml，混匀后以100 μ 1/孔加入96孔板中， 37°C，5% CO2孵箱中培养1天。
[0091] 3. 3样品稀释上样
[0092] 将各样品分别用ECGS-ECM培养基稀释至2. 5mM和I. 25mM备用。
[0093] 3. 4配制VEGF工作液
[0094] 用 2 % FBS-ECM 将 VEGF 稀释至 40ng/ml 备用。
[0095] 3. 5 孵育
[0096] 取3. 3制备的各样品，加入等体积VEGF工作液，混匀，37°C培养箱孵育3小时。
[0097] 3. 6 加样
[0098] 取生长良好的96孔板，吸弃96孔板中的培养液，以100 μ 1/孔加入样品，37°C， 5% CO2孵箱中培养4天
[0099] 3. 7读数和分析
[0100] 培养结束后，观察细胞，确认形态正常无污染，每孔加入25 μ I CCK-8工作液，37°C 反应4小时，用酶标仪于450nm处测吸收值。
[0101] 4、实验结果
[0102] 所有的检测结果均以抑制率（％)表示，抑制率可反应样品对VEGF的抑制情况，计 算公式如下：
[01 03] 抑制率（％)=稀释液对照组结果/样品结果*100
[0104] 活性检测结果见表3。
[0105] 表3:多肽及活性检测结果
[0108] 本次测定中，当样品浓度为I. 25mM时，所有样品结果均在50%~80%，说明这些 多肽在该浓度下对VEGF具有一定的抑制作用，当浓度为2. 5mM时，效果更优。
[0109] 实施例四：小肽抗大鼠角膜病理性新生血管效应的测定
[0110] 使用大鼠角膜缝线模型，具体方法如下：健康SD大鼠，160-180g，雄性，以右眼为 实验眼。术前3天所有实验眼点0.3%氧氟沙星滴眼液，每日2次。实验前检查实验眼，排 除眼部病变并磅体重。按3ml/kg体重腹腔内注射1%戊巴比妥钠，予以全身麻醉，并予眼 表麻醉。首先用直径3mm的角膜环钻在大鼠角膜中央轻作压痕，用10-0尼龙线垂直压痕方 向并以其为中线作角膜基质缝合，每眼于颞侧穿入角膜基质1针，每针跨度约1mm，缝线最 外端距角膜缘约1_，术毕结膜囊涂氧氟沙星眼膏。术后各组分别每日4次滴眼液（10 μ 1/ 次/眼。按实施例五制备滴眼液，其中Avastin和小肽的含量见分组中所示）。
[0111] 分组如下：空白对照组（缝线+PBS)，阳性对照组（缝线+Avastin 10mg/ml)，各 多肽组（缝线+0. 5mg/ml)。每组8只大鼠 （η = 8)。分别于术后第7天散瞳后观察角膜新 生血管（CNV)情况，并用量规测量新生血管长度L，同时记录新生血管生长钟点数C。计算 CNV面积S = 0· 4*3. 1416*C*L。并照相。运用one-way ANOVA比较各组CNV面积S (平均 值土 SE)，运用SPSS16. 0. 1进行统计分析，具体结果见表4。
[0112] 表4:多肽及活性检测结果
[0115] 结果表明，本发明多肽组在术后第
7天具有明显抑制大鼠角膜病理性新生血管作 用。
[0116] 实施例五：眼药水的制备
[0117] 利用常规技术，混合以下组分，制得1%眼部滴眼液，其配方如下：
[0118] 小肽 IOmg
[0119] 羟丙基甲基纤维素0.03g
[0120] 无菌水 IOmL
[0121] 调节渗透压3000sm
[0122] 酸碱度（pH) 6. 8 ~7.1
[0123] 在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独 引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员 可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请权利要求书所限定的范围 中。
【主权项】
1. 一种抑制血管新生或生长的多肽，所述多肽含有SEQ ID NO: 1所示序列。2. 根据权利要求1所述的多肽，其特征在于，所述多肽为在SEQ ID NO: 1序列的前面按 次序增加 SEQ ID NO: 2的从C端开始的任一个或多个氨基酸；或在SEQ ID NO: 1的后面按 次序增加 SEQ ID NO: 3的从N端开始的任意一个或多个氨基酸；或前后都按上述次序增加 SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3中的任一个或多个氨基酸。3. 根据权利要求1所述的多肽，其特征在于，所述多肽为： SK001 :其氨基酸序列为SEQ ID N0:1 ;SK002 :其氨基酸序列为SEQ ID N0:5 ;SK003 : 其氨基酸序列为SEQ ID N0:7;SK004:其氨基酸序列为SEQ ID N0:9;SK005:其氨基酸序 列为SEQ ID NO: 11 ;SK006:其氨基酸序列为SEQ ID NO: 13 ;SK007:其氨基酸序列为SEQ ID N0:15 ;SK008 :其氨基酸序列为SEQ ID N0:17 ;SK009 :其氨基酸序列为SEQ ID N0:19 ; SK010:其氨基酸序列为SEQ ID N0:21;SK011:其氨基酸序列为SEQ ID N0:23;SK012:其 氨基酸序列为SEQ ID N0:25;SK013:其氨基酸序列为SEQ ID N0:27;SK014:其氨基酸序列 为SEQ ID N0:29;SK015:其氨基酸序列为SEQ ID N0:31;SK016:其氨基酸序列为SEQ ID N0:33 ;SK017 :其氨基酸序列为SEQ ID N0:35 ;或SK018 :其氨基酸序列为SEQ ID N0:37。4. 一种编码如权利要求1-3任一项所述的多肽的核苷酸序列；优选地，所述核苷酸序 列为skOOl :核苷酸序列为SEQ ID N0:4 ;sk002 :核苷酸序列为SEQ ID N0:6 ;sk003 :核苷 酸序列为SEQ ID N0:8 ;sk004 :核苷酸序列为SEQ ID N0:10 ;sk005 :核苷酸序列为SEQ ID NO: 12 ;sk006 :核苷酸序列为 SEQ ID NO: 14 ;sk007 :核苷酸序列为 SEQ ID NO: 16 ;sk008 : 核苷酸序列为SEQ ID N0:18;sk009:核苷酸序列为SEQ ID N0:20;sk010:核苷酸序列为 SEQ ID N0:22 ;sk011 :核苷酸序列为 SEQ ID N0:24 ;sk012 :核苷酸序列为 SEQ ID N0:16 ; sk013:核苷酸序列为SEQ ID N0:28;sk014:核苷酸序列为SEQ ID N0:30;sk015:核苷酸 序列为SEQ ID N0:32;sk016:核苷酸序列为SEQ ID N0:34;sk017:核苷酸序列为SEQ ID NO:36 ;或 skO 18 :核苷酸序列为 SEQ ID NO:38。5. -种表达如权利要求1-3任一项所述的多肽的表达载体或宿主细胞，包含如权利 要求4所述的核苷酸序列；优选地，所述表达载体是真核表达载体或病毒表达载体，更优选 地，所述真核表达载体为哺乳动物细胞表达载体，所述病毒表达载体为腺相关病毒或腺病 毒载体；优选地，所述宿主细胞为CH0细胞及其亚系或293细胞及其亚系。6. -种制备如权利要求1-3任一项所述的多肽的方法，所述方法为化学合成法或重组 表达法。7. -种药物组合物，包含如权利要求1-3任一项所述的多肽或其药学上可接受的盐和 药学上可接受的载体或赋形剂；优选地，所述药物组合物的剂型为注射剂、眼药水、眼用凝 胶或眼药膏。8. 如权利要求1-3任一项所述的多肽或其药学上可接受的盐在制备治疗或预防由血 管新生或生长引起的疾病的药物中的应用；优选地，所述疾病为眼睛疾病、肿瘤、缺血性心 脏病、非炎症性心肌病、冠状动脉硬化、闭塞性动脉硬化、动脉栓塞、动脉血栓、Berger's病、 慢性炎症、炎症性肠病、溃疡、风湿性关节炎、硬皮症、银屑病、不育症或肉瘤状病；更优选 地，所述眼睛疾病为年龄相关性黄斑变性、糖尿病性视网膜病变、脉络膜新生血管、黄斑囊 样水肿、糖尿病性黄斑水肿、视网膜血管闭塞、角膜新生血管、角膜移植手术新生血管性青 光眼、翼状胬肉或慢性结膜炎。
【文档编号】C12N15/12GK105859833SQ201510036411
【公开日】2016年8月17日
【申请日】2015年1月23日
【发明人】许迅, 柯潇, 郑颖, 邬智刚
【申请人】上海市第人民医院, 上海市第一人民医院, 成都康弘药业集团股份有限公司