一种提取珊瑚礁中珊瑚蛋白的试剂盒和方法
【专利摘要】本发明涉及一种提取珊瑚礁中珊瑚蛋白的试剂盒，其试剂包含Trizol试剂，还进一步包含蛋白裂解液、丙酮和甲醇。本发明还涉及采用上述试剂盒提取珊瑚礁中珊瑚蛋白的方法。采用本发明试剂盒进行珊瑚蛋白的提取与现有的方法相比具有反应步骤少、操作时间短、蛋白提取量大、可用于SDS?PAGE和质谱鉴定等优点，且可以对多种类型珊瑚进行提取，为珊瑚蛋白的提取提供了一种通用的方法。
【专利说明】
一种提取珊瑚礁中珊瑚蛋白的试剂盒和方法
技术领域
[0001 ]本发明涉及蛋白提取纯化领域，具体涉及一种提取珊瑚礁中珊瑚蛋白的试剂盒和方法。
【背景技术】
[0002]珊瑚礁是石珊瑚目的动物形成的一种结构。这个结构可以大到影响其周围海域环境的物理和生态条件。珊瑚礁是成千上万的由碳酸钙组成的珊瑚虫的骨骼在数百年至数万年的生长过程中形成的。珊瑚礁为许多动植物提供了生活环境，其中包括鱼类、蠕虫、软体动物、海绵、棘皮动物和甲壳动物等，估计占海洋物种数的25%。珊瑚礁生态系统是具有极高生物多样性和资源生产力的热带浅海生态系统，素有“海洋中的热带雨林”之称，是海洋生态系统的重要组成部分。我国南海独特的地理区位和自然条件，形成了全国分布最广、品种最全、发育最好的珊瑚礁。南海珊瑚礁种类繁多，主要有滨珊瑚、蜂巢珊瑚、角状蜂巢珊瑚、扁脑珊瑚等巨大珊瑚礁块体，还有成片生长的鹿角状珊瑚、牡丹珊瑚、陀螺珊瑚、杯形珊瑚等。
[0003]由于人类活动和全球气候变化引起的珊瑚礁白化现象受到科学界的极大关注，科研工作者已经从生理生化、毒理学、基因组学、转录组学、蛋白质组学等各个角度去研究珊瑚白化的原因。从造礁珊瑚中提取蛋白以了解正常珊瑚与白化珊瑚之间的蛋白表达水平差异，从而找出与珊瑚白化密切相关的蛋白标志物，以期揭示不同环境因子对珊瑚白化影响的机理。另外通过发现与珊瑚白化相关蛋白标志物对于珊瑚白化早期预警具有十分重要的研究和实际应用价值。目前已经有报道关于珊瑚礁蛋白提取的文献，如提取珊瑚骨骼中相关蛋白的文献(Drake et al.,Proteomic analysis of skeletal organic matrix fromthe stony coral Stylophora pistillata，PNAS，2013)以及珊瑚总蛋白的文献(Barshiset al.,Protein express1n and genetic structure of the coral Porites lobatain an environmentalIy extreme Samoan back reef: does host genotype limitphenotypic plasticity?Molecylar Ecology，2010)。珊瑚礁的主要成分是碳酸|丐，目前还没有商业化的可用于珊瑚蛋白提取纯化的试剂盒。
【发明内容】
[0004]本发明的目的在于克服现有技术中的不足，提供商业化的可用于珊瑚蛋白提取纯化的试剂盒及提取方法。
[0005]本发明的第一个方面是提供一种提取珊瑚礁中珊瑚蛋白的试剂盒，其试剂包括Trizol 试剂。
[0006]进一步地，所述试剂盒的试剂还包括:蛋白裂解液、丙酮和甲醇。
[0007]其中，所述蛋白裂解液中含有:3-101(例如:4]\1、51、61、7]\1、81、91等)尿素，0.5-51(例如:謂、1.51、21、31、3.51、4]?、4.51等)硫脲，0.5-5%(例如:1%、1.5%、2%、2.5%、3%、3.5%、4%、4.5%等)0^卩5，0.01-0.51(例如:0.051、0.謂、0.21、0.251、0.31、0.351、0.4]?、0.451等汗]\^卩和0.卜5%(例如:0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%、3%、3.5%、4%、4.5%等)
DTT0
[0008]优选地，所述蛋白裂解液中含有:7M尿素，2M硫脲，2 % CHAPS，0.1MPMSF和I % DTT。
[0009]根据下述本发明第二个方面所述的方法，在提取珊瑚礁中珊瑚蛋白时，还使用氯仿、乙醇和异丙醇等常规试剂。一般地，常规试剂不包括在试剂盒中。但是应当理解的是，本发明的试剂盒的试剂还可以进一步包括:氯仿、乙醇和/或异丙醇。
[00?0] 本发明中，所述Trizol试剂为Invitrogen公司或其他公司产品。
[0011]本发明中，所述试剂丙酮和甲醇至少应为分析纯以上纯度。本发明的第二个方面是提供一种提取珊瑚礁中珊瑚蛋白的方法，使用本发明第一个方面所述的任意一种试剂盒提取珊瑚礁中珊瑚蛋白。
[0012]优选地，所述方法具体包括以下步骤:
[0013]步骤I，取珊瑚粉末，加入Trizol试剂，震荡2分钟以上，分离，取上清液；
[0014]步骤2，加入氯仿，剧烈震荡0.1分钟以上，静置，分离，弃上清液；
[0015]步骤3，加入乙醇，混匀，静置，分离，取上清液；
[0016]步骤4，加入异丙醇，混匀，在低于-10°C的温度以下静置，分离，弃上清液；
[0017]步骤5，加入甲醇，洗涤蛋白沉淀；
[00? 8]步骤6，加入丙酮，洗涤蛋白沉淀，干燥；
[0019 ]步骤7，加入适量蛋白裂解液溶解蛋白。
[0020]优选地，步骤I中，震荡采用涡旋震荡。
[0021 ] 进一步地，步骤I中，震荡时间优选为5min以上，更优选为5?40min，更优选为10?20mino
[0022]优选地，步骤2中，剧烈震荡0.5min以上，例如lmin、2min、3min等。
[0023]优选地，步骤2中，静置I?lOmin，例如3min、5min、8min等。
[0024]优选地，步骤3中，静置0.5?6min，例如lmin、3min、5min等。
[0025]优选地，步骤4中，静置Ih以上，更优选2h以上，例如2h、4h、10h等。
[0026]优选地，步骤4中，静置的温度为-40?-15 °C，例如-35 °C、-30 °C、-25 °C、-20 °C等。
[0027]本发明中，步骤I?4中的分离可以采用常用的物理分离方法，例如过滤、静置后吸取、离心分离等。
[0028]若无特殊说明，本发明上下文中的环境温度一般为10?35摄氏度。
[0029]本发明的第三个方面是提供Trizol试剂在提取珊瑚礁中珊瑚蛋白的应用。
[0030]利用任意一种Trizol试剂提取珊瑚蛋白的方法均在本发明保护范围之内。
[0031]采用本发明试剂盒进行珊瑚蛋白的提取与现有的方法相比具有反应步骤少、操作时间短、蛋白提取量大、可用于SDS-PAGE和质谱鉴定等优点，且可以对多种类型珊瑚进行提取，为珊瑚蛋白的提取提供了一种通用的方法。
【附图说明】
[0032]图1为本发明试剂盒与土壤蛋白试剂盒蛋白提取效果的对比图:试剂盒M为标准蛋白Marker，I号条带为本发明试剂盒提取，2号条带为土壤蛋白提取试剂盒提取。
[0033]图2位本发明试剂盒提取六种不同珊瑚蛋白结果:I，隆起鹿角珊瑚Acoporatumida；2，十字牡丹珊瑚Pavona decussata；3，鹿角杯形珊瑚PociIlopora damicornis；4，稀杯蓝形珊瑚Galaxea astreata;5，缨真叶珊瑚Euphyllia fimbriata;6，佳丽鹿角珊瑚Acopora pulchra。
[0034]图3为本发明试剂盒提取3种未知品种珊瑚蛋白结果。
[0035]图4为本发明试剂盒提取正常珊瑚与处于不同白化阶段的珊瑚蛋白的SDS-PAGE:1，正常未白化的珊瑚;2，正处于白化中的珊瑚;3，已经完全白化的珊瑚。
【具体实施方式】
[0036]下面结合具体的实施例对本发明作进一步的说明，以更好地理解本发明。
[0037]实施例1:本发明试剂盒与商业化土壤蛋白提取试剂盒提取珊瑚蛋白效果比较
[0038](I)取一块鹿角珊瑚，用液氮速冻，将其置于液氮的研钵中研磨成粉末。称取两份Ig的粉末分别置于2ml的离心管中，并分别编号管I和管2。管I中样品按照以下步骤进行:
[0039]⑵将1.0mL Trizol试剂分别加入离心管中，涡旋振荡10?20分钟。
[0040](3)在4°C条件下，12000g离心lOmin，将上清液转移到新的0.5ml离心管中。
[0041 ] (4)加入200μ1氯仿，剧烈振荡2min，室温静置5min。
[0042](5)在4°C条件下，12000g离心lOmin，弃上清液，留下中层和下层。
[0043](6)加入300μ1乙醇，涡旋混匀，室温静置3min后于4°C条件下2000g离心5min。
[0044](7)取大约800μ1上清液于新的2ml离心管中，加入800μ1异丙醇，轻摇混匀。置于-20°C条件下静置2h以上。
[0045](8)弃上清液加入Iml甲醇，用移液器反复吹打蛋白沉淀，于4°C条件下，12000g离心I Omin，重复2次。
[0046](9)吸除甲醇，加入Iml丙酮，用移液器反复吹打蛋白沉淀，于4°C条件下，12000g离心1min，吸除剩余丙酮，室温静止干燥后加入适量蛋白裂解液溶解蛋白
[0047]管2中样品按照NoviPure 土壤蛋白提取试剂盒(NoviPure Soil ProteinExtract1n Kit)说明书进行，具体为:
[0048]快速称取5g粉末到50ml NoviPure? Bead Tube(试剂盒提供)中，并把Tube放入冰上。加入15ml冷Solut1n SPl (试剂盒提供)。加入150μ1的IM二硫苏糖醇(DTT)到此50mlTube中，使得DTT最终浓度为10mM。涡旋至充分混匀，4°C冰浴1min。把此50ml Tube安放在祸旋仪适配器上，最大转速连续祸旋振荡1min。50ml冷冻离心机设置在4°C，4500g快速离心30s。把Bead Tube和帽子上的土壤、研磨珠、缓冲液离下来。加入1.5ml冷Solut1n SP2(试剂盒提供)。涡旋至充分混匀，4°C冰浴lOmin。摇匀样品，然后把50ml Tube安放在涡旋仪适配器上，最大转速连续祸旋振荡1min0冷冻离心机设置在4°C，4500g快速离心30s。用移液器把上清液转移到另一个干净的50ml Falcon? Collect1n Tube(试剂盒提供)中。每Iml蛋白上清液加入0.25ml的100 %三氯乙酸(TCA)。稍微涡旋混匀，-20 °C孵育Ih至过夜。次日冰上解冻此50ml Tube，上清液化冻但仍保持冰冷。冷冻离心机设置在4°C，4500g离心50ml Tube 20min。预冷I.7ml Low-Protein Binding Tubes和微型离心机到4°C。确保丙酮-20 °C保存。不扰动沉淀的情况下尽量吸掉上清液。加入Iml冰冷的HPLC级丙酮，反复吹打、点振祸旋充分重悬沉淀。把丙酮重悬的蛋白液转移到一个新的1.7ml Low-ProteinBinding Tube中(试剂盒提供)。冷冻离心机设置在4°C，20000g离心1.7ml离心管5min。小心倒掉丙酮。若沉淀出现位移，改用移液器。再加入Iml冰冻丙酮冲洗沉淀，涡旋10s，尽可能重悬沉淀。冷冻离心机设置在4°(:，2000(^离心1.71111离心管51^11。小心倒掉丙酮。若沉淀出现位移，改用移液器。重复冲洗步骤:再加入Iml冰冻丙酮冲洗沉淀，涡旋10s，尽可能重悬沉淀。冷冻离心机设置在4°C，20000g离心1.7ml离心管5min。小心吸掉丙酮。室温下在通风橱里或氮气干燥沉淀，直至沉淀不含水分但不至于形成结晶。加适量蛋白裂解液，完全溶解后-80°C保存。
[0049]用Bradford法测蛋白浓度，计算结果为:采用本发明试剂盒Ig珊瑚提取得到781yg蛋白；而采用商业化土壤蛋白提取试剂盒5g珊瑚提取得到1743yg蛋白，即每Ig珊瑚提取得至Ij350yg蛋白。吸取10?20yg蛋白进行SDS-PAGE电泳检测，如图1所示。
[°°50] 在本发明试剂盒提取和土壤蛋白提取试剂盒法(Soil Protein Extract1n Kit)提取比较中，所用同一物种样品，且为同一组织的液氮研磨，Trizol试剂提取中加入的Ig珊瑚样品，土壤蛋白提取试剂盒加入5g珊瑚样品，但前者Ig珊瑚样品总蛋白是后者Ig珊瑚总蛋白量的2.2倍，提取蛋白量差距明显。从图1的蛋白条带来看，本发明试剂盒提取条带中，大分子量和小分子量的蛋白均可见，条带比较清晰。土壤蛋白提取试剂盒提取条带中，大分子量条带均消失或不清晰，说明此方法易造成珊瑚总蛋白的降解。
[0051]实施例2:本发明试剂盒对6种已经鉴定的珊瑚品种中蛋白的提取效果验证[°°52] (I)分别称取等重(0.5至Ig)6种珊瑚(I，隆起鹿角珊瑚Acopora tumida； 2，十字牡丹珊瑚Pavona decussata; 3，鹿角杯形珊瑚Poci llopora damicornis ; 4，稀杯蓝形珊瑚Galaxea astreata;5，缀真叶珊瑚Euphyllia f imbr iata ; 6，佳_鹿角珊瑚 Acoporapulchra。)于液氮中速冻后，置于液氮预冷的研钵中研磨成粉末，将粉末分别转移至2ml离心管中。
[0053]⑵将1.0mL Trizol试剂分别加入离心管中，涡旋振荡10?20分钟。
[0054](3)在4°C条件下，12000g离心lOmin，将上清液转移到新的0.5ml离心管中。
[0055](4)加入200μ1氯仿，剧烈振荡2min，室温静置5min。
[0056](5)在4°C条件下，12000g离心lOmin，弃上清液，留下中层和下层。
[0057](6)加入300μ1乙醇，涡旋混匀，室温静置3min后于4°C条件下2000g离心5min。
[0058](7)取大约800μ1上清液于新的2ml离心管中，加入800μ1异丙醇，轻摇混匀。置于-20°C条件下静置2h以上。
[0059](8)弃上清液加入Iml甲醇，用移液器反复吹打蛋白沉淀，于4°C条件下，12000g离心I Omin，重复2次。
[0060](9)吸除甲醇，加入Iml丙酮，用移液器反复吹打蛋白沉淀，于4°C条件下，12000g离心1min，吸除剩余丙酮，室温静止干燥后加入适量蛋白裂解液溶解蛋白
[0061 ]用Bradford法测蛋白浓度后，计算结果为:隆起鹿角珊瑚、十字牡丹珊瑚、鹿角杯形珊瑚、稀杯盔形珊瑚、缨真叶珊瑚、佳丽鹿角珊瑚均为2.2g，分别得到377.4yg、723yg、322.8yg、867.6yg、1415yg和403yg的蛋白。
[0062]吸取10到20yg蛋白进行SDS-PAGE电泳检测，如图2所示。由图2可知，本发明试剂盒适用于不同种珊瑚样品的蛋白提取，均能获得从小到大不同蛋白分子量分布的SDS-PAGE条带。
[0063]实施例3:本发明试剂盒对未经鉴定珊瑚品种中蛋白的提取效果验证
[0064](I)分别称取等重(0.5至lg)3种未经鉴定的珊瑚于液氮中速冻后，置于液氮预冷的研钵中研磨成粉末，将粉末分别转移至2ml离心管中。
[0065]⑵将1.0mL Trizol试剂分别加入离心管中，涡旋振荡10?20分钟。
[0066](3)在4°C条件下，12000g离心lOmin，将上清液转移到新的0.5ml离心管中。
[0067](4)加入200μ1氯仿，剧烈振荡2min，室温静置5min。
[0068](5)在4°C条件下，12000g离心lOmin，弃上清液，留下中层和下层。
[0069](6)加入300μ1乙醇，涡旋混匀，室温静置3min后于4°C条件下2000g离心5min。
[0070](7)取大约800μ1上清液于新的2ml离心管中，加入800μ1异丙醇，轻摇混匀。置于-20°C条件下静置2h以上。
[0071](8)弃上清液加入Iml甲醇，用移液器反复吹打蛋白沉淀，于4°C条件下，12000g离心I Omin，重复2次。
[0072](9)吸除甲醇，加入Iml丙酮，用移液器反复吹打蛋白沉淀，于4°C条件下，12000g离心1min，吸除剩余丙酮，室温静止干燥后加入适量蛋白裂解液溶解蛋白。
[0073]用Bradford法测蛋白浓度后，计算结果为:三种未经鉴定的珊瑚质量分别为3、3和4g，得到蛋白量分别为3110μg、1451μg和1258μg。
[0074]吸取1到20yg蛋白进行SDS-PAGE电泳检测，如图3所示。由图3可知采用本发明试剂盒对三种未经鉴定的珊瑚亦能得到令人满意的蛋白提取效果，通过SDS-PAGE发现，三种珊瑚的蛋白条带有明显差异。
[0075]实施例4:本发明试剂盒对处于不同白化阶段的珊瑚中蛋白的提取效果验证
[0076]珊瑚的白化是珊瑚响应外界环境变化的结果，研究处于不同白化阶段的珊瑚并结合环境因子数据的变化，可获知珊瑚白化的敏感环境因子。因此，我们在同一株珊瑚中，采集了三块分别为正常珊瑚、正处于白化过程中的珊瑚以及完全白化的珊瑚样品。
[0077](I)分别称取等重(0.5至Ig)正常珊瑚、正处于白化过程中的珊瑚以及完全白化的珊瑚，于液氮中速冻后，置于液氮预冷的研钵中研磨成粉末，将粉末分别转移至2ml离心管中。
[0078]((2)将1.0mL Trizol试剂分别加入离心管中，涡旋振荡10?20分钟。
[0079](3)在4°C条件下，12000g离心lOmin，将上清液转移到新的0.5ml离心管中。
[0080](4)加入200μ1氯仿，剧烈振荡2min，室温静置5min。
[0081 ] (5)在4°C条件下，12000g离心lOmin，弃上清液，留下中层和下层。
[0082](6)加入300μ1乙醇，涡旋混匀，室温静置3min后于4°C条件下2000g离心5min。
[0083](7)取大约800μ1上清液于新的2ml离心管中，加入800μ1异丙醇，轻摇混匀。置于-20°C条件下静置2h以上。
[0084](8)弃上清液加入Iml甲醇，用移液器反复吹打蛋白沉淀，于4°C条件下，12000g离心I Omin，重复2次。
[0085](9)吸除甲醇，加入Iml丙酮，用移液器反复吹打蛋白沉淀，于4°C条件下，12000g离心1min，吸除剩余丙酮，室温静止干燥后加入适量蛋白裂解液溶解蛋白
[0086]用Bradford法测蛋白浓度，计算结果为:正常珊瑚、正处于白化过程中的珊瑚以及完全白化的珊瑚分别为2.2、2.8和3.3g，得到蛋白量分别为1200μg、1362μg和161μg蛋白。
[0087]吸取10到20yg蛋白进行SDS-PAGE电泳检测，如图4所示。由图4中可见，正常珊瑚与正处于白化珊瑚样品在35KD至75KD之间有明显的条带差异，然而，完全白化的珊瑚样品，从低分子量到高分子量条带与另外两个样品都有明显的条带差异。此结果表明白化珊瑚与正常珊瑚有明显的蛋白表达谱差异。
[0088]以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。
【主权项】
1.一种提取珊瑚礁中珊瑚蛋白的试剂盒，其特征在于，其试剂包括Trizol试剂。2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，其试剂还包括:蛋白裂解液、丙酮和甲醇。3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述蛋白裂解液中含有:3-10M尿素，0.5-5M 硫脲,0.5-5% CHAPS，0.01-0.5M PMSF 和 0.1-5 % DTT。4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述蛋白裂解液中含有:7M尿素，2M硫月尿，2%CHAPS，0.1M PMSF和 1%DTT。5.根据权利要求1?4中任意一项所述的试剂盒，其特征在于，其试剂还包括:氯仿、乙醇和/或异丙醇。6.—种提取珊瑚礁中珊瑚蛋白的方法，其特征在于，使用权利要求1?4中任意一项所述的试剂盒提取珊瑚礁中珊瑚蛋白。7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，包括以下步骤: 步骤I，取珊瑚粉末，加入Trizol试剂，震荡2分钟以上，分离，取上清液； 步骤2，加入氯仿，剧烈震荡0.1分钟以上，静置，分离，弃上清液； 步骤3，加入乙醇，混匀，静置，分离，取上清液； 步骤4，加入异丙醇，混匀，在低于-10°C的温度以下静置，分离，弃上清液； 步骤5，加入甲醇，洗涤蛋白沉淀； 步骤6，加入丙酮，洗涤蛋白沉淀，干燥； 步骤7，加入适量蛋白裂解液溶解蛋白。8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤I中漩涡震荡5?40分钟。9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤4中在-40?-15°C下静置Ih以上。10.Trizol试剂在提取珊瑚礁中珊瑚蛋白的应用。
【文档编号】C07K1/14GK105859828SQ201610338123
【公开日】2016年8月17日
【申请日】2016年5月20日
【发明人】赵洪伟, 程华民, 刁晓平, 周海龙, 陈好, 阮孙兰
【申请人】海南大学