专利名称：一种快速检验细菌的试剂盒及其检测方法
技术领域：
本发明涉及一种检测试剂盒，具体地说，涉及一种利用复合酶的PCR技术进行快 速检测细菌的试剂盒及其检测方法，属于微生物检测领域。
背景技术：
人们的生活水平不断提高，逐步从温饱迈向小康。人们对食品的要求已从过去的 买得起足够的食品，转为希望买到质量好、卫生安全的食品。食品的质量、卫生安全则成为 广大消费者的主要追求。因此微生物对食品的污染问题，尤其是细菌对食品的污染问题相 应地备受关注，在食品生产、加工、储存、运输、销售等各个环节中都有污染细菌的可能，一 旦污染，细菌将大量繁殖而引起食品腐败变质，或导致食源性感染和食物中毒，特别是近年 来随着环境污染的加剧和生态平衡的不断破坏，可导致人类感染的致病菌种类越来越多， 病原菌对人类的威胁越来越大。为了防止此类事件的发生，采用适当的快速检验方法来对
食品进行检测，是预防食源性中毒的重要手段。(范ii萍，王婷，梁炎，快速检验纸片在食品
微生物检测中的应用，中国医药指南，2008年10月48-49) 目前，常规的微生物和细菌检测主要是通过培养基来培养目标，通常情况下，将 lmL (经过稀释)样本置于溶化的营养琼脂内，使菌培养成离散的菌落，并在约24h内进行菌 落形成单位(CFU/mL)计数。这些菌落可进行分离，并进一步鉴定它们属于致病菌或非致病 菌，培养时间从2-3天，到数周不等。实验需要用到大量的器皿、试剂。而且检测要有专门 的实验室，由专门的技术人员进行无菌操作。此方法极易受到污染而导致错误结果，不但检 测时间长，还浪费大量的人力、物力、财力。 而微生物学和细菌学的快速检测方法，人们从20世纪60年代中期就开始进行研 究，70年代该领域发展快速，并在80年代、90年代持续发展，直至现在。
目前微生物学和细菌学的快速检测大致分为以下几类第一类是活细胞计数。一 些方便的系统装置，如具有营养培养基的快速测试片Petrifihn ;将样本散布在预成的琼 脂平板表面的快速螺旋接种仪SpiralPlater ;将微生物捕集在细菌滤膜上的网格滤膜系 统Isogrid或捕集在小井组中的微生物检测系统BioCotrol Simplate ;非热凝胶"琼脂"系 统Easygel等，以及在选择性培养基或非选择性培养基上寻找生长的靶标等系统，有助于 大大地縮减活细胞计数的完成时间。总体来说，活细胞计数比传统的方法检测速度有所提 高，但提高的有限，仍需人工计数。 第二类为仪器检测，液体和半固体样本内致病菌和非致病菌菌群的生长动力学和 动态的变化可使用仪器自动检测，如ATP水平、专一性酶、pH值、电阻抗、导电系数、电容、浊 度、颜色、热度、放射性二氧化碳等。但这些检测仪器较昂贵，而且实验操作较复杂，所需的 检测时间最少为4小时(冯贻泽，食品微生物学的快速检测方法和自动化操作25年回顾 和预测，中国食品学报，2009年4月1-3)。 还有一类为核酸检测。通过已知探针进行DNA与RNA的杂交已经使用30年之久。 近年来，PCR已经被人们所接受。聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction)，简称PCR，是一种分子生物学技术，通过一对特异的引物来放大特定微生物或细菌的DNA片段。可看 作生物体外的特殊DNA复制。并通过琼脂糖电泳来检测靶标PCR产物，可用于检测病毒、细 菌甚至霉菌和酵母菌等。但传统的PCR反应由于酶的限制，导致PCR循环至少要进行1个 半小时，而使整个检测时间超过2个小时。 经文献检索，未发现与本发明内容相同文献的公开报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种快速检测细菌的试剂盒，其利用复合酶的PCR技术，可 定性的检测所有细菌，并大大縮短了细菌的检测时间。 为了实现本发明目的，本发明的一种快速检测细菌的试剂盒，其以热启动酶和高
保真酶为复合酶，酶活比为i : 1-3 : 2。 其中，二者的酶活比优选为3 : 2。 所述热启动酶为Phire Hot Start DNA Polymerase (Fi籠ymes，芬兰)、 DyNAzyme II Hot Start DNA Polymerase (Fi籠ymes，芬兰)或GoTaq Hot Start DNA Polymerase (Promega，美国)。 所述高保真酶为iProof High Fidelity DNA Polymerase (BI0-RAD，美 国)、Phusion High-Fidelity DNA Polymerase (Fi丽ymes， 芬兰)或Pfu DNA Polymerase (Promega，美国)。 本发明所述的试剂盒还包括反应液为含有裂解成分的PCR缓冲液，比如5x Phire Reaction Buffer反应用缓冲液(Finnzymes，芬兰)；或Nuclei Lysis Solution细胞裂解 液(Promega，美国)；或其浓縮液。优选为，5x Phire Reaction Buffer (Fi籠ymes，芬兰)；或其浓縮液。试剂盒中还含有菌体预处理液8-12mmol/L Tris_Cl、0. 5-1. 5,1/L EDTA、
0. 05-0. 15% TritonX-100、0. 05-0. 15%牛血清白蛋白、0. 01-0. 05% Tween20调pH到8. 0 ;
或其浓縮液。 优选菌体预处理液10mmol/L Tris-Cl、lmmol/L EDTA、0. 05 % TritonX-100、 0. 08%牛血清白蛋白、0. 02% Tween20调pH到8. 0 ;或其浓縮液。 上述浓縮液可以是工作液浓度的5-20倍，将工作液浓縮后可以提高试剂盒的使 用次数。在使用时，将浓縮液按照浓縮倍数稀释到工作液状态，稀释液为各试液的溶剂，对 于菌体预处理液和反应液而言，稀释液为水。 具体地说，本发明快速检测试剂盒包括反应液、复合酶、菌体预处理。使用时须自 行准备10mM dNTP Mix、水以及一对针对不同细菌的特异性引物或细菌通用引物。
利用本发明所述试剂盒进行细菌快速检验的方法，其包括如下步骤
1)先将所述菌体预处理液对样品菌液进行处理，得模板； 2)再以所述反应液、所述复合酶、dNTP Mix、所述模板为组成进行PCR反应，得PCR 产物； 3)最后用琼脂糖凝胶电泳法进行检测。 具体地说，包括如下步骤 1)将样品菌液进行离心处理，去上清；
4
2)加入菌体预处理液与沉淀所得菌体混合均匀；
3)加热离心，取上清，即为模板；4)20uL PCR反应体系包括反应液4. Oil L ;10mM dNTP MixO. 4ii L ;—对针对不同
细菌的特异性引物或细菌通用引物各1 P L ;复合酶0. 4L ;模板1L ;用水补足20 P L ; 5)PCR循环98t:预变性5分30秒，98。C变性5秒，72延伸6秒，40个循环，最后 72t:延伸1分钟。 6) PCR产物用2 %琼脂糖凝胶电泳检测。 电泳缓冲液为1XTAE，G0LDVIEW染色(荧光染色)，凝胶成像仪拍照并记录结果。
本发明所述的模板可以放置在-20°〇备用。 本发明的细菌快速检验试剂盒及检测方法与现有技术相比，具有以下有益效果
1)本发明采用复合酶配方使PCR反应循环时间大大縮短，不到40分钟就可以完成 PCR循环，以及15分钟的电泳时间，因此从检测样品制备到得到电泳图仅需1个小时，大大 縮短了细菌的检测时间，而目前的国标法对食品中细菌总数的检测需要48小时以上。因此 本试剂盒能达到快速检测的目的； 2)本发明的细菌快速检验试剂盒可以用于检测所有细菌； 3)本发明的细菌快速检验试剂盒易于操作，并且避免有机试剂等对人体有害药品 的使用； 4)本发明的细菌快速检验试剂盒灵敏度高，对细菌检测的灵敏度为5. OX lO^fu/
图1使用本发明的试剂盒对多种细菌进行检测结果；
1为李斯特菌，2为沙门氏菌，3为大肠杆菌，4为阴性对照。
图2本发明的灵敏度的检测结果； 1沙门菌含量5. 0 X 108cfu/mL， 2沙门菌含量5. 0 X 107cfu/mL， 3沙门菌含量 5. OX 106cfu/mL，4沙门菌含量5. OX 105cfu/mL， 5沙门菌含量5. OX 104cfu/mL，6沙门菌含 量5. OX 103cfu/mL，7沙门菌含量5. OX 102cfu/mL，8沙门菌含量5. OX 10卜fu/mL，9沙门菌 含量5. OX 10°cfu/mL， 10为阴性对照。
具体实施例方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。 若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
本发明中涉及到的百分号"％"，若未特别说明，是指质量百分比；但溶液的百分 比，除另有规定外，是指溶液lOOmL中含有溶质若干克；液体之间的百分比，是指在2(TC时 容量的比例。
实施例1 本实施例的快速检验试剂盒含有 菌体预处理液10mmol/L Tris-Cl、 lmmol/L EDTA、0. 05% TritonX-100、0. 08%牛 血清白蛋白、0. 02% Tween20调pH到8. 0 ;
反应液5x Phire Reaction Buffer (Fi皿zymes，芬兰)； 复合酶Phire Hot Start DNA Polymerase (Fi籠ymes，芬兰)2U/u L禾口 iProof High Fidelity DNA Polymerase (BI0-RAD，美国)2U/ii L，两个酶的酶活比为3 : 2。
实施例2使用本发明的试剂盒对多种细菌进行检测。 作为一种细菌快速检验试剂盒，我们希望这种方法具有广泛的适用性，可以广泛 的应用于各种细菌检测。因此我们选取了三种常见的食源性致病菌，按生物学分类来描述， 把细菌分为革兰氏阳性以及阴性。因此，在样品选择时，本实施例选择革兰氏阳性菌李斯特 菌、革兰氏阴性菌沙门氏菌和大肠杆菌为代表，并按照试剂盒所述的方法进行检测。以实施 例1的试剂盒为例。
具体操作如下 1.取50iiL菌液于离心管中，1000rpm离心2min，去上清。 2.加入50 ii L菌体预处理液(菌体预处理液配方为10mmol/LTris-Cl、lmmol/L EDTA、0. 05% TritonX-100、0. 08%牛血清白蛋白、0. 02% Tween20调pH到8. 0)于离心管 中，与沉淀所得菌体混合均匀。 3.置于95。C加热5分钟(在PCR仪上进行)，lOOOrpm离心2min，上清即为模板。
4. 20uL PCR反应体系包括反应液(反应液配方为5x PhireReaction Buffer) 4. 0 ii L ; 10mM dNTP Mix 0. 4 ii L ;Primer A 1 ii L ;Primer B 1 ii L ;复合酶(复合酶 配方为Phire Hot Start DNA Polymerase2U/uL和iProof High Fidelity DNA Polymerase 2U/iiL，两个酶的酶活比为3 : 2)0.4iiL ;模板liiL ;用水补足20iiL。
5. PCR循环98。C预变性5分30秒，98。C变性5秒，72延伸6秒，40个循环，最后 72t:延伸1分钟。 6. PCR产物用2 %琼脂糖凝胶电泳检测。电泳缓冲液为1 X TAE， GOLDVIEW染色，凝 胶成像仪拍照并记录结果。 选用细菌通用引物作为PCR检测的引物，反应扩增的目的片段约为180bp，细菌通 用引物的碱基序列为F 5' -ACT CCTACG GGA GGC AGC AG-3'
R 5' -ATTACC GCG GCT GCT GG-3' 结果表明对三种常见的革兰氏阳性及革兰氏阴性食源性致病菌以细菌通用引物 为引物进行PCR扩增后，经过琼脂糖电泳时后发现，所有样品均得到电泳可见的目的基因 条带(图1)。所以本发明的试剂盒完全可以适于多种细菌进行快速检测。
实施例3本发明的灵敏度的检测。 以无菌操作将沙门菌的过夜培养液按IO倍倍比稀释，进行菌落计数，按照实施例
1的本发明试剂盒的方法提取模板，进行PCR电泳检测，计算出检测限。选用沙门特定引物
作为PCR检测的引物，反应扩增的目的片段约为284bp，沙门特定引物的碱基序列为F 5' -TCATCG CAC CGT CAAAGGAAC C-3'R 5' -GTG AAA TTA TCG CCA CGT TCG GGC AA—3' 其PCR反应体系、PCR反应条件及检测条件等均与实施例1 一致。 结果表明电泳检测发现当每mL菌液中含有50个沙门菌时能扩增出与理论相符
的条带，继续稀释，则超过该方法的分辨范围，无法得到目标条带，本试剂盒对细菌检测的
6灵敏度为5. OX 10卜fu/mL(图2)。
实施例4快速检验试剂盒
本实施例的试剂盒包括 菌体预处理液(5倍浓縮液)50mmol/L Tris-Cl、5mmol/L EDTA、0. 25 % TritonX-100、0. 40%牛血清白蛋白、0. 10% Tween20调pH到8. 0。
反应液5x Phire Reaction Buffer (Fi籠ymes，芬兰)。 复合酶Phire Hot Start DNA Polymerase (Fi籠ymes，芬兰)2U/u L禾口 iProof High Fidelity DNA Polymerase (BIO-RAD，美国)2U/ii L，两个酶的酶活比为3 : 2。
实施例5快速检验试剂盒
本实施例的试剂盒包括 菌体预处理液(5倍浓縮液)60mmol/L Tris-C1、7. 5mmol/LEDTA、0. 75 % TritonX-100、0. 75%牛血清白蛋白、0. 25% Tween20调pH到8. 0。
反应液5x Phire Reaction Buffer (Fi皿zymes，芬兰)。 复合酶Phire Hot Start DNA Polymerase (Fi籠ymes，芬兰)2U/u L禾口 iProof High Fidelity DNA Polymerase (BIO-RAD，美国)2U/ii L，两个酶的酶活比为3 : 2。
实施例6快速检验试剂盒
本实施例的试剂盒包括 菌体预处理液(5倍浓縮液)40mmol/L Tris_Cl、2. 5mmol/LEDTA、0. 25 % TritonX-100、0. 25%牛血清白蛋白、0. 05% Tween20调pH到8. 0。
反应液5x Phire Reaction Buffer (Fi籠ymes，芬兰)。 复合酶Phire Hot Start DNA Polymerase (Fi籠ymes，芬兰)2U/u L禾口 iProof High Fidelity DNA Polymerase (BIO-RAD，美国)2U/ii L，两个酶的酶活比为3 : 2。
实施例7快速检验试剂盒
本实施例的试剂盒包括 菌体预处理液(5倍浓縮液)50mmol/L Tris-Cl、5mmol/L EDTA、0. 25 % TritonX-100、0. 40%牛血清白蛋白、0. 10% Tween20调pH到8. 0。
反应液Nuclei Lysis Solution (Promega，美国)； 复合酶Phire Hot Start DNA Polymerase (Fi籠ymes，芬兰)2U/u L禾口 iProof High Fidelity DNA Polymerase (BIO-RAD，美国)2U/ii L，两个酶的酶活比为3 : 2。
实施例8快速检验试剂盒
本实施例的试剂盒包括 菌体预处理液(5倍浓縮液)50mmol/L Tris-Cl、5mmol/L EDTA、0. 25 % TritonX-100、0. 40%牛血清白蛋白、0. 10% Tween20调pH到8. 0。
反应液5x Phire Reaction Buffer (Fi籠ymes，芬兰)。 复合酶Phire Hot Start DNA Polymerase (Fi籠ymes，芬兰)2U/u L禾口 iProof High Fidelity DNA Polymerase (BIO-RAD，美国)2U/ii L，两个酶的酶活比为1 : 1。
按照实施例2和3的方法使用实施例5-8试剂盒，分别对沙门菌进行检测，结果表 明，实施例5-8的实验结果与实施例1和2的实验结果基本相同，实施例1和2的效果更好。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因 此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
0096]序列表
0097]〈110〉中国农业大学
0098]〈120〉 一种快速检验细菌的试剂盒及其检测方法
0099]<130>KHP09113459.2
0100]〈160>4
0101]〈170>PatentIn version
0102]〈210>1
0103]<211>20
0104]〈212>DNA
0105]〈213〉人工序列
:0106]〈400>1
:0107]actcctacgg gaggcagcag
:0108]〈210>2
:0109]〈211>17
:o"o]〈212>DNA
:o川]<213>人工序列
:0112]〈400>2
:o"3]attaccgcgg ctgctgg
:o"4]〈210>3
:o"5]<211>22
:o"6]〈212>DNA
:o"7]〈213〉人工序列〈400>3tcatcgcacc gtcaaaggaa cc〈210>4〈211>26〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>4gtga朋ttet cgccacgttc gggca i
权利要求
一种快速检测细菌的试剂盒，其特征在于，其以热启动酶和高保真酶为PCR反应体系的复合酶，酶活比为1∶1-3∶2。
2. 根据权利要求l所述的试剂盒，其特征在于，热启动酶和高保真酶的酶活比为3 : 2。
3. 根据权利要求l或2所述的试剂盒，其特征在于，所述热启动酶为Phire Hot Start DNA Polymerase、 DyNAzyme II Hot Start DNAPolymerase或GoTaq Hot Start DNA Polymerase。
4. 根据权利要求l-3任意一项所述的试剂盒，其特征在于，所述高保真酶为iProof High Fidelity DNA Polymerase、 PhusionHigh-Fidelity DNA Polymerase或Pfu DNA Polymerase。
5. 根据权利要求l-4任意一项所述的试剂盒，其特征在于，还包括反应液，其为含有裂 解成分的PCR缓冲液。
6. 根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述反应液为5xPhire Reaction Buffer ;或Nuclei Lysis Solution ;或其浓縮液。
7. 根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述反应液为5xPhire Reaction Buffer或其浓縮液。
8. 根据权利要求l-7任意一项所述的试剂盒，其特征在于，其还含有菌体预处理 液，其成分为8-12mmol/L Tris_Cl、0. 5-1. 5mmol/LEDTA、0. 05-0. 15 % TritonX-100、 0. 05-0. 15%牛血清白蛋白、0. 01-0. 05% Tween20调pH到8. 0 ;或其浓縮液。
9. 根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述菌体预处理液10mmol/L Tris-Cl、lmmol/L EDTA、0. 05% TritonX-100、0. 08%牛血清白蛋白、0. 02% Tween20调pH 到8. 0 ;或其浓縮液。
10. 采用权利要求l-9任意一项所述试剂盒进行细菌快速检验的方法，其特征在于，其 包括如下步骤1) 先将所述菌体预处理液对样品菌液进行处理，得模板；2) 再以所述反应液、所述复合酶、dNTP Mix、所述模板及针对不同细菌的特异性引物或 细菌通用引物为组成，进行PCR反应，得PCR产物；3) 最后用琼脂糖凝胶电泳法进行检测。
全文摘要
本发明提供了一种快速检测细菌的试剂盒，其以热启动酶和高保真酶为PCR反应体系的复合酶，酶活比为1∶1-3∶2。采用本发明可以定性的检测所有细菌。本发明独创了复合酶配方使PCR反应循环时间大大缩短，从制备样品到得到电泳图仅需一个小时，大大缩短了细菌的检测时间。本试剂盒易于操作，并且避免有机试剂等对人体有害药品的使用；而且对细菌检测的灵敏度为5.0×101cfu/mL。本发明的试剂盒成本低，速度快，普适性强，适合各种细菌的快速检测，具有良好的应用前景。
文档编号C12R1/01GK101705298SQ20091023673
公开日2010年5月12日 申请日期2009年11月5日 优先权日2009年11月5日
发明者张南, 梁志宏, 王龑, 石慧, 罗云波, 许文涛, 黄昆仑 申请人:中国农业大学