专利名称：用于分离骨髓单个核细胞的试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及试剂盒，特别是涉及一种用于分离骨髓单个核细胞的试剂盒。
背景技术：
由动脉阻塞引起的肢体缺血性疾病(如下肢动脉硬化性闭塞症、糖尿病肢体缺血、血栓闭塞性脉管炎等)是我国乃至世界范围内的常见病、难治病，并随着我国老年人口的增多，发病人数有逐渐增多的趋势。与其发病相关的危险因素有高血压、高脂血症、糖尿病、吸烟、缺少锻炼以及人口老龄化等，这些危险因素正朝着不利于疾病控制的方向发展。据西方国家报道，该类疾病的发病率在55岁以上的成年人中高达15％，其中1/3以上表现有典型的间歇性跛行症状；在我国，发病人数约占全国总人口的3.4-12.1％。此种疾病发展到后期，主要动脉血管严重闭塞。据欧洲的调查显示，每年每百万人口中约有500-1000人出现严重的肢体缺血性疾病，其中大部分患者因无良好的流入道及可供“搭桥”的流出道和严重的多节段、多平面的动脉阻塞性病变，不适于手术或者是经皮的血管成形术，病变呈进行性恶化，甚至危及生命。该病的保守治疗效果很差，目前尚无任何药物治疗能对严重缺血的自然病程产生积极的作用；外科人工血管搭桥术仅能使部分患者病情得到缓解，并且远期疗效也不满意，尽管截肢术有其自身的不足，会带来一系列的并发症，但仍常被用以解决患者的严重症状，尤其是不堪忍受的缺血性静息痛，虽然术后可安装假肢及进行康复治疗，但患肢的活动功能并不能完全恢复；另外此类患者大多是高龄患者，身体难以承受搭桥手术的打击，而介入治疗还受很多限制，所以迫切需要寻求一种新的有效的治疗方法。
近年来，内皮祖细胞在成体病理性血管新生部位的发现，突破了“血管生成只涉及成熟内皮细胞的迁移和增殖，是出生后新血管形成的唯一方式”这一传统理论的束缚，使人们逐渐意识到血管发生也参与病理性的血管新生，加之对各种成体干细胞生物学特性认识的不断深入，以及分离纯化、和鉴定这些干细胞手段的不断改进，使采用干细胞作为种子细胞在缺血梗死部位移植，重新建立有效的侧枝循环这种“治疗性血管新生”技术成为一个理想的治疗策略及重点研究课题。国内外目前已有不同的研究小组对干细胞移植治疗肢体缺血性疾病进行了较为广泛的研究，证实接受自体骨髓单个核细胞移植治疗的下肢动脉缺血性疾病患者均获得了满意的疗效。但是目前还未有用于分离骨髓单个核细胞的试剂盒，使得相关科研工作的进展相对缓慢。
发明内容
本发明的目的是提供一种使用方便、成本低廉的用于分离骨髓单个核细胞的试剂盒。
为实现上述目的，本发明采取以下设计方案一种用于分离骨髓单个核细胞的试剂盒，包括稀释液，洗涤液，由分离液A和分离液B组成的分离液。
上述试剂盒中的稀释液可为生理盐水、PBS或Hank’s等溶液，优选为质量/体积百分比浓度为0.85-0.9％的生理盐水。
所述洗涤液可为生理盐水、PBS或Hank’s等溶液，优选为质量/体积百分比浓度为0.85-0.9％的生理盐水。
所述分离液A可为质量/体积百分比浓度为5.5-6.5％的羟乙基淀粉溶液或0.45-0.55％甲基纤维素溶液，优选为质量/体积百分比浓度为6％的羟乙基淀粉溶液。
所述分离液B可为密度为1.077g/mL的聚蔗糖—泛影酸钠(ficoll-hypaque)溶液(商品名Ficoll液)或密度1.073g/mL的Percoll液，优选为密度为1.077g/mL的聚蔗糖—泛影酸钠溶液。
为获得更好的分离效果，所述试剂盒中还包括修复液A，可为高糖DMEM培养基、1640培养基或IMDM培养基，优选为高糖DMEM培养基。所述修复液A的使用方法可为将修复液A与自体血浆按体积比9∶1混合即可。
在添加修复液A的基础上，所述试剂盒还可添加修复液B和/或修复液C；所述修复液B可为胎牛血清、新生牛血清或小牛血清，优选为胎牛血清；修复液C可为150-250mM L-谷氨酰胺，优选为200mM L-谷氨酰胺。所述包括修复液A和修复液B的骨髓单个核细胞修复液的使用方法可为将修复液A与修复液B按体积比9∶1混合即可；所述包括修复液A和修复液C的骨髓单个核细胞修复液的使用方法可为将修复液A与体积百分浓度为1％的修复液C混匀后即可；所述包括修复液A、修复液B和修复液C的骨髓单个核细胞修复液的使用方法可为将修复液A与修复液B按体积比9∶1混合后，再加入体积百分浓度为1％的修复液C，混匀即可。
此外，为使移植用细胞具有良好的分散性，所述试剂盒中还可包括细胞分散液，如用稀释液和/或洗涤液配制的浓度为体积/体积百分比浓度为1％的人血白蛋白液。
本发明提供了一种用于分离骨髓单个核细胞的试剂盒。在该试剂盒中，生理盐水、PBS或Hank’s等试剂起到稀释和/或洗涤的作用，分离液A的作用是分离有核细胞，去除红细胞，分离液B的作用是分离单个核细胞，用于培养骨髓单个核细胞的培养液可对分离细胞起到修复作用。该试剂盒具有使用方便、成本低廉、分离效果好(可达107数量级)的优点，将在肢体缺血性疾病的治疗及相关研究中发挥重要作用，应用前景广阔。
下面结合具体实施例对本发明作进一步详细说明。
具体实施例方式
下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，所述百分比百分比浓度均为质量/体积(W/V)百分比浓度或体积/体积(V/V)百分比浓度。
实施例1、用于分离骨髓单个核细胞的试剂盒的制备及其分离效果检测一、制备用于分离骨髓单个核细胞的试剂盒1、溶液配制本发明用于分离骨髓单个核细胞的试剂盒包括以下试剂(1)稀释液和洗涤液均为质量/体积百分比浓度为0.9％的生理盐水；(2)分离液A为质量/体积百分比浓度为6.0％的羟乙基淀粉溶液；(3)分离液B为比重为1.077g/mL的聚蔗糖—泛影酸钠(ficoll-hypaque)溶液(商品名Ficoll液)；(4)修复组合液修复液A高糖DMEM培养基，修复液B胎牛血清，修复液C200mM L-谷氨酰氨；使用时，修复组合液的配制方法为将修复液A与修复液B按照9∶1的体积比充分混合后，再加入体积百分浓度为1％的修复液C，混匀后即可；(5)分散液用稀释液和/或洗涤液配制的体积/体积百分比浓度为1％的人血白蛋白液。
2、各组分的分装试剂盒的规格为1次/盒，每盒中各组分的量为稀释/洗涤液3瓶(250mL/瓶)，分离液A 1瓶(100mL/瓶)，分离液B 1瓶(40mL/瓶)，修复液A(45mL/瓶)，修复液C(1mL/管)和分散液(1mL)。按上述剂量对试剂盒中的各组分进行分装，包装后得到用于分离骨髓单个核细胞的试剂盒。
二、骨髓单个核细胞的分离现用步骤一制备的试剂盒及常规试剂进行骨髓单个核细胞的分离，以检测分离效果，其中，用本发明试剂盒进行分离的具体方法包括以下步骤(所有步骤均在洁净工作台中完成)1)将采集的患者骨髓分装入50mL无菌离心管中(≤40mL/管)，配平后，4℃、2000rpm离心20分钟，吸弃上层血浆；2)将各离心管中的下层细胞收集于250mL无菌的盐水瓶中，按1∶1的比例加入稀释液，充分混匀，再按总体积比为4∶1的比例加入分离液A，室温静置25min；3)吸取上清至50mL无菌离心管中，4℃、1500rpm离心10min，弃上清，将所有细胞集中于一个离心管中，再加入洗涤液补足体积至40mL，4℃、1500rpm离心10min，弃上清，将此洗涤过程重复2次，再用20mL或40mL洗涤液重悬细胞；4)吸取提前预温至室温(25℃)的分离液B 20mL于50mL离心管中，将细胞悬液沿管壁按照1∶1的体积比缓慢加入分离液B液面上，室温，1800rpm离心30min；5)小心吸取中间层细胞，置于另一50mL离心管中，再加入洗涤液补足体积至40mL，4℃、1500rpm离心10min，弃上清，将此洗涤步骤重复3次；6)先用5mL修复液组合重悬所有细胞，镜下计数，然后按5.0×106个/mL接种于75cm2无菌培养瓶中，每瓶≤15mL，并置CO2培养箱中在37℃、5％CO2下静置培养约3小时；7)收集所有细胞于50mL离心管中(≤40mL/管)，配平后，4℃、1500rpm离心10min，弃上清，再加入洗涤液40mL重悬细胞，4℃、1500rpm离心10min，此步骤重复2次，得到骨髓单个核细胞。将收集的骨髓单个核细胞重悬于添加1％分散液的50mL稀释液中，置于无菌瓶中，4℃备用。
用常规试剂进行骨髓单个核细胞的分离包括以下步骤A、裂解红细胞取50mL患者骨髓，放入提取管中，往提取管中加入250mL红细胞裂解液(EDTA钠盐20mg，氯化铵4.2g，碳酸氢钾0.5g，加蒸馏水定容至500mL)，与骨髓充分混合，室温放置3分钟，1000rpm常温离心3分钟。离心结束，弃去上层液体。
B、观察提取管底层提取的单个核细胞，如其中混有较多红细胞，可重复步骤A1-2次，去除多余红细胞。
C、洗涤裂解液取250mL 0.9％生理盐水放入提取管中，用吸管吹打底层细胞，使其与0.9％生理盐水充分混合，1000rpm常温离心3分钟，离心结束，弃去上层液体。
D、向提取管中加入少量0.9％生理盐水，用吸管吹打，使其与底层细胞混合，转移至50mL离心管中，4000rpm常温离心5秒钟，弃去上层0.9％生理盐水，得到骨髓单个核细胞，4℃保存备用。
检测用本发明试剂盒及常规试剂组合提取的骨髓单个核细胞的数量，结果用本发明试剂盒中的试剂组合提取的骨髓单个核细胞的数量达107个数量级，而常规试剂组合提取的骨髓单个核细胞的数量仅为106个数量级，表明用本发明的试剂盒可获得较好的分离效果。
实施例2、用于分离骨髓单个核细胞的试剂盒的制备及其分离效果检测一、制备用于分离骨髓单个核细胞的试剂盒1、溶液配制本发明用于分离骨髓单个核细胞的试剂盒包括以下试剂(1)稀释液和洗涤液均为PBS，配方为NaCl 0.8克，KCl 0.2克，Na2HPO4·12H2O2.9克，KH2PO40.2克，加去离子水定容至1000mL，高压灭菌；(2)分离液A质量/体积百分比浓度为0.5％的甲基纤维素溶液，配制方法将0.5g甲基纤维素加入100mL生理盐水中，高压灭菌后，置于4℃，待完全溶解后即可；(3)分离液B比重为1.073g/mL的Percoll液。
2、各组分的分装试剂盒的规格为1次/盒，每盒中各组分的量为稀释/洗涤液3瓶(250mL/瓶)，分离液A 1瓶(100mL/瓶)，分离液B 1瓶(40mL/瓶)。按上述剂量对试剂盒中的各组分进行分装，包装后得到用于分离骨髓单个核细胞的试剂盒。
二、骨髓单个核细胞的分离现用步骤一制备的试剂盒及常规试剂进行骨髓单个核细胞的分离，以检测分离效果，其中，用本发明试剂盒进行分离的具体方法包括以下步骤(所有步骤均在洁净工作台中完成)1)将采集的患者骨髓分装入50mL无菌离心管中(≤40mL/管)，配平后，4℃、2000rpm离心20分钟，吸弃上层血浆；2)将各离心管中的下层细胞收集于250mL无菌的盐水瓶中，按1∶1的比例加入稀释液，充分混匀，再按总体积比为4∶1(分离液A)的比例加入分离液A，室温静置25min；3)吸取上清至50mL无菌离心管中，4℃、1500rpm离心10min，弃上清，再加入稀释/洗涤液补足体积至40mL，将所有细胞集中于一个离心管中，4℃、1500rpm离心10min，弃上清，将此洗涤过程重复2次，再用20mL或40mL洗涤液重悬细胞；4)吸取提前预温至室温(25℃)的分离液B 20mL于50mL离心管中，将细胞悬液沿管壁缓慢按照1∶1的体积比加入分离液B的液面上，室温下、1800rpm离心30min；5)小心吸取中间层细胞，置于另一50mL离心管中，加入40mL洗涤液，4℃、1500rpm离心10min，弃上清，将此洗涤步骤重复3次，得到骨髓单个核细胞。将收集的细胞重悬于40mL稀释/洗涤液中，置于无菌瓶中，4℃备用。
同时，用与实施例1相同的常规试剂及方法进行骨髓单个核细胞的分离，然后，检测用本发明试剂盒及常规试剂组合提取的骨髓单个核细胞的数量，结果用本发明试剂盒中的试剂组合提取的骨髓单个核细胞的数量达107个数量级，而常规试剂组合提取的骨髓单个核细胞的数量仅为106个数量级，表明用本发明的试剂盒可获得较好的分离效果。
实施例3、用于分离骨髓单个核细胞的试剂盒的制备及其分离效果检测一、制备用于分离骨髓单个核细胞的试剂盒1、溶液配制本发明用于分离骨髓单个核细胞的试剂盒包括以下试剂(1)稀释液和洗涤液均为Hank’s液，配制方法为NaCl 8g，KCl 0.4g，Na2HPO4.H2O0.06g，KH2PO40.06g，NaHCO30.35g，加去离子水定容为1000mL，高压灭菌后，4℃保存；(2)分离液A为质量/体积百分比浓度为6.5％的羟乙基淀粉溶液；(3)分离液B为比重为1.077g/mL的聚蔗糖-泛影酸钠(ficoll-hypaque)溶液(商品名Ficoll液)；(4)修复液修复液A1640培养基；修复液的使用方法为将修复液A与自体血浆按照9∶1的体积比充分混匀即可(现用现配)。
2、各组分的分装试剂盒的规格为1次/盒，每盒中各组分的量为稀释1瓶(250mL/瓶)，洗涤液2瓶(250mL/瓶)，分离液A 1瓶(100mL/瓶)，分离液B 1瓶(40mL/瓶)，修复液A(45mL/瓶)。按上述剂量对试剂盒中的各组分进行分装，包装后得到用于分离骨髓单个核细胞的试剂盒。
二、骨髓单个核细胞的分离现用步骤一制备的试剂盒及常规试剂进行骨髓单个核细胞的分离，以检测分离效果，分离方法如下1)将采集的患者骨髓分装入50mL无菌离心管中(≤40mL/管)，配平后，4℃、2000rpm离心20分钟，吸取上层血浆，4℃备用；其余步骤与实施例1相同。
同时，用与实施例1相同的常规试剂及方法进行骨髓单个核细胞的分离，然后，检测用本发明试剂盒及常规试剂组合提取的骨髓单个核细胞的数量，结果用本发明试剂盒中的试剂组合提取的骨髓单个核细胞的数量达107个数量级，而常规试剂组合提取的骨髓单个核细胞的数量仅为106个数量级，表明用本发明的试剂盒可获得较好的分离效果。
实施例4、用于分离骨髓单个核细胞的试剂盒的制备及其分离效果检测一、制备用于分离骨髓单个核细胞的试剂盒1、溶液配制本发明用于分离骨髓单个核细胞的试剂盒包括以下试剂(1)稀释液为Hank’s液；(2)洗涤液为质量/体积百分比浓度为0.85％的生理盐水；(3)分离液A为质量/体积百分比浓度为5.5％的羟乙基淀粉溶液；(4)分离液B为比重为1.077g/mL的聚蔗糖-泛影酸钠溶液；(5)修复组合液修复液AIMDM培养基；修复液B新生牛血清；修复液C；250mM L-谷氨酰氨；使用时，修复组合液的配制方法为将修复液A与修复液B按照9∶1的体积比充分混匀后，再加入体积百分浓度为1％的修复液C，混匀后即可(现用现配)。
2、各组分的分装试剂盒的规格为1次/盒，每盒中各组分的量为稀释1瓶(250mL/瓶)，洗涤液2瓶(250mL/瓶)，分离液A 1瓶(100mL/瓶)，分离液B 1瓶(30mL/瓶)，修复液A(45mL/瓶)，修复液B(5mL/瓶)，修复液C(1mL/管)。按上述剂量对试剂盒中的各组分进行分装，包装后得到用于分离骨髓单个核细胞的试剂盒。
二、骨髓单个核细胞的分离现用步骤一制备的试剂盒及常规试剂进行骨髓单个核细胞的分离，以检测分离效果，分离方法与实施例1相同。
同时，用与实施例1相同的常规试剂及方法进行骨髓单个核细胞的分离，然后，检测用本发明试剂盒及常规试剂组合提取的骨髓单个核细胞的数量，结果用本发明试剂盒中的试剂组合提取的骨髓单个核细胞的数量达107个数量级，而常规试剂组合提取的骨髓单个核细胞的数量仅为106个数量级，表明用本发明的试剂盒可获得较好的分离效果。
实施例5、用于分离骨髓单个核细胞的试剂盒的制备及其分离效果检测一、制备用于分离骨髓单个核细胞的试剂盒1、溶液配制本发明用于分离骨髓单个核细胞的试剂盒包括以下试剂(1)稀释液为质量/体积百分比浓度为0.85％的生理盐水；
(2)洗涤液为PBS；(3)分离液A为质量/体积百分比浓度为0.45％的甲基纤维素溶液；(4)分离液B为比重为1.073g/mL的Percoll液；(5)修复组合液修复液AIMDM培养基，修复液B小牛血清；使用时，修复组合液的配制方法为将修复液A与修复液B按体积体积比9∶1混匀后即可(现用现配)。
2、各组分的分装试剂盒的规格为1次/盒，每盒中各组分的量为稀释液1瓶(250mL/瓶)，洗涤液2瓶(250mL/瓶)，分离液A 1瓶(100mL/瓶)，分离液B 1瓶(40mL/瓶)，修复液A(45mL/瓶)，修复液B(5mL/瓶)。按上述剂量对试剂盒中的各组分进行分装，包装后得到用于分离骨髓单个核细胞的试剂盒。
二、骨髓单个核细胞的分离现用步骤一制备的试剂盒及常规试剂进行骨髓单个核细胞的分离，以检测分离效果，分离方法与实施例1相同。
同时，用与实施例1相同的常规试剂及方法进行骨髓单个核细胞的分离，然后，检测用本发明试剂盒及常规试剂组合提取的骨髓单个核细胞的数量，结果用本发明试剂盒中的试剂组合提取的骨髓单个核细胞的数量达107个数量级，而常规试剂组合提取的骨髓单个核细胞的数量仅为106个数量级，表明用本发明的试剂盒可获得较好的分离效果。
实施例6、用于分离骨髓单个核细胞的试剂盒的制备及其分离效果检测一、制备用于分离骨髓单个核细胞的试剂盒1、溶液配制本发明用于分离骨髓单个核细胞的试剂盒包括以下试剂(1)稀释液为PBS；(2)洗涤液为Hank’s液；(3)分离液A为质量/体积百分比浓度为0.55％的甲基纤维素溶液；(4)分离液B为比重为1.077g/mL的聚蔗糖—泛影酸钠溶液；(5)修复组合液修复液A高糖DMEM培养基；修复液C；150mM L-谷氨酰氨；使用时，修复组合液的配制方法为将修复液A与体积百分浓度为1％的修复液C混匀后即可(现用现配)。
2、各组分的分装试剂盒的规格为1次/盒，每盒中各组分的量为稀释1瓶(250mL/瓶)，洗涤液2瓶(250mL/瓶)，分离液A 1瓶(100mL/瓶)，分离液B 1瓶(30mL/瓶)，修复液A(50mL/瓶)，修复液C(1mL/管)。按上述剂量对试剂盒中的各组分进行分装，包装后得到用于分离骨髓单个核细胞的试剂盒。
二、骨髓单个核细胞的分离现用步骤一制备的试剂盒及常规试剂进行骨髓单个核细胞的分离，以检测分离效果，分离方法与实施例1相同。
同时，用与实施例1相同的常规试剂及方法进行骨髓单个核细胞的分离，然后，检测用本发明试剂盒及常规试剂组合提取的骨髓单个核细胞的数量，结果用本发明试剂盒中的试剂组合提取的骨髓单个核细胞的数量达107个数量级，而常规试剂组合提取的骨髓单个核细胞的数量仅为106个数量级，表明用本发明的试剂盒可获得较好的分离效果。
权利要求
1.一种用于分离骨髓单个核细胞的试剂盒，包括稀释液，洗涤液，由分离液A和分离液B组成的分离液；所述稀释液为生理盐水、PBS或Hank’s液；洗涤液为生理盐水、PBS或Hank’s液；分离液A为质量/体积百分比浓度为5.5-6.5％的羟乙基淀粉溶液或质量/体积百分比浓度为0.45-0.55％的甲基纤维素溶液；分离液B为密度为1.077g/mL的聚蔗糖-泛影酸钠溶液或密度为1.073g/mL的Percoll液。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述稀释液为质量/体积百分比浓度为0.85-0.9％的生理盐水。
3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述洗涤液为质量/体积百分比浓度为0.85-0.9％的生理盐水。
4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述分离液A为质量/体积百分比浓度为6％的羟乙基淀粉溶液。
5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于密度为1.077g/mL的聚蔗糖-泛影酸钠溶液。
6.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述稀释液为质量/体积百分比浓度为0.85-0.9％的生理盐水；洗涤液为质量/体积百分比浓度为0.85-0.9％的生理盐水；分离液A为质量/体积百分比浓度为6％的羟乙基淀粉溶液；分离液B为密度为1.077g/mL的聚蔗糖-泛影酸钠溶液。
7.根据权利要求1-6任一项所述的试剂盒，其特征在于所述试剂盒还包括骨髓单个核细胞修复液A；所述修复液A为高糖DMEM培养基、1640培养基或IMDM培养基。
8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于所述试剂盒还包括修复液B和/或修复液C；所述修复液B为胎牛血清、新生牛血清或小牛血清；修复液C为150-250mML-谷氨酰氨。
9.根据权利要求1-6任一项所述的试剂盒，其特征在于所述试剂盒还包括用稀释液和/或洗涤液配制的体积/体积百分比浓度为1％的人血白蛋白液。
10.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于所述试剂盒还包括用稀释液和/或洗涤液配制的体积/体积百分比浓度为1％的人血白蛋白液。
全文摘要
本发明公开了一种用于分离骨髓单个核细胞的试剂盒。该试剂盒包括稀释液，洗涤液，由分离液A和分离液B组成的分离液；所述稀释液为生理盐水、PBS或Hank’s液；洗涤液为生理盐水、PBS或Hank’s液；分离液A为质量/体积百分比浓度为5.5－6.5％的羟乙基淀粉溶液或0.45－0.55％甲基纤维素溶液；分离液B为密度为1.077g/mL的聚蔗糖－泛影酸钠(ficoll－hypaque)溶液(商品名Ficoll液)或密度1.073g/mL的Percoll液。该试剂盒具有使用方便、成本低廉、分离效果好(可达10
文档编号C12N5/08GK1948467SQ20061011447
公开日2007年4月18日 申请日期2006年11月10日 优先权日2006年11月10日
发明者裴雪涛, 王韫芳, 南雪, 闫舫, 施双双, 管利东 申请人:中国人民解放军军事医学科学院野战输血研究所