专利名称：动物细胞内核蛋白提取方法
动物细胞内核蛋白提取方法本发明涉及蛋白质提取方法，尤其涉及一种动物细胞内核蛋白提取方法。 [背景技术]蛋白质的制备是一项十分细致的工作，涉及物理学、化学和生物学等多门学科。蛋白质种类很多，在理化特性方面差异较大，因此不可能有一个固定的程序适用各类蛋白质的分离。动物材料中的蛋白质有些以可溶性的形式存在于体液如血液、尿液中，可以不必经过提取直接进行分离。但是一些蛋白质常以与其它生物体物质结合形式存在，如核蛋白，这给分离工作带来了较大困难。动物细胞是由细胞膜、细胞质和细胞核三部分组成的，蛋白质在细胞膜、细胞质和细胞核内均大量存在，发挥着不同的生理功能。细胞核是细胞的中枢和指挥中心，在细胞核内表达的蛋白，即核蛋白，在三种类型的蛋白中是唯一一种同遗传物质基因组紧密结合在一起的蛋白，核蛋白只有同基因组紧密地结合在一起才能发挥蛋白的特定功能。因此，提取保持生物活性的核蛋白在三种蛋白类型中难度最大。细胞核内基因组DNA为粘稠的线型分子，在提取核蛋白去除基因组DNA时DNase I是常用的降解酶。DNase I的中文名称为脱氧核糖核酸酶I，是一种用于消化单链或双链 DNA的核酸内切酶。DNase I降解基因组DNA的理想条件为37°C，而细胞蛋白提取的基本条件要求在0-4°C的低温环境条件下进行，目的是为了防止细胞蛋白快速降解，因此，核蛋白的提取要兼顾两个不同的温度条件是难以进行的。目前，核蛋白的提取常采用蛋白变性剂使细胞核蛋白变性而从基因组上脱落下来。但是，这种方法提取的核蛋白由于蛋白变性不具有核蛋白的生物学活性，只能用于蛋白印记、蛋白电泳、免疫共沉淀等蛋白质的常规分析检测。另外，由于提取的蛋白液中含有蛋白变性剂，蛋白提取物中微量的蛋白变性剂即可导致培养细胞的死亡，因此不能添加到细胞培养液中开展蛋白功能应用。本发明要解决的技术问题是提供一种动物细胞内核蛋白提取方法。为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是，一种动物细胞内核蛋白提取方法，包括以下步骤(1)核蛋白的表达用高糖DMEM培养液培养传代四31~细胞，经过多次培养传代后选择生长速度快、生长状态好的细胞用作核蛋白表达细胞；待细胞生长到对数生长期时；分别采用磷酸钙沉淀法介导0ct4、Sox2、MyC、Klf4重组核蛋白表达载体在细胞内表达；(2)核蛋白的提取荧光显微镜下观察核蛋白在细胞中的表达，待重组核蛋白在细胞内表达稳定后，分别选取核蛋白表达的四31~细胞，去除培养皿中的高糖DMEM培养液，添加含秋水仙素的高糖DMEM培养液处理细胞，待处理细胞形态出现变化后，将细胞连同培养液一起收集到离心管中4°C放置；取出4°C状态下的细胞悬液，4°C离心去上清液，用4°C预冷的高糖DMEM培养液重悬细胞沉淀，离心洗涤细胞并去上清液，用4°C预冷的高糖DMEM培养液再重悬细胞沉淀，同时加入蛋白酶抑制剂，轻轻吹打混勻后冰浴中超声破碎细胞，4°C离心去沉淀后收集上清液过滤除菌，4°C放置备用。上述重组核蛋白表达载体的基本重组结构为PCDNA3. 1-细胞穿透肽-外源核蛋白-绿色荧光蛋白。上述细胞穿透肽的11个氨基酸组成为酪氨酸-甘氨酸-精氨酸-赖氨酸-赖氨酸-精氨酸-精氨酸-谷氨酰胺-赖氨酸-赖氨酸-赖氨酸。细胞穿透肽(Cell penetrating peptide, CPP)是具有穿透细胞膜或核膜后定位于细胞质或细胞核的氨基酸序列。细胞穿透肽能够携带外源蛋白质或多肽进入细胞内，且不影响携带蛋白的生物学活性，同时不受细胞类型的影响。细胞穿透肽的氨基酸序列中具有蛋白转导作用的基本结构是富含碱性氨基酸的多肽片段，其中精氨酸和赖氨酸残基在细胞穿透肽功能发挥中起着重要作用。绿色荧光蛋白(Enhanced green fluorescent protin, EGFP)是荧光蛋白家族中最常用的一种，最初从水母中分离得到，发光基团主要是由丝氨酸、酪氨酸和甘氨酸三个氨基酸经过环化、氧化后形成的咪唑环，在钙离子激发下不需要其他辅酶能够单独或与其它蛋白融合时产生荧光，荧光具有高度稳定性。绿色荧光蛋白由于具有自发荧光的特性，常作为荧光标记在分子生物学、细胞生物学和发育生物学等领域得到广泛应用。本发明采用细胞穿透肽作为介导材料，其细胞穿透肽的氨基酸组成为酪氨酸-甘氨酸-精氨酸-赖氨酸-赖氨酸-精氨酸-精氨酸-谷氨酰胺-赖氨酸-赖氨酸-赖氨酸，共计11个氨基酸残基，连接细胞穿透肽、核蛋白和绿色荧光蛋白组成重组核蛋白，实验采用0ct4、Sox2、Myc, Klf4重组核蛋白目前已广泛应用于多能性干细胞诱导，实验所借助的细胞穿透肽和绿色荧光蛋白验证了采用新的核蛋白提取方法能够高效获得天然状态的高活性蛋白质，该方法能够用于少量或大量规模化细胞核蛋白的高效提取，提取的核蛋白不仅能够用于蛋白印记、蛋白质电泳、免疫共沉淀等常规的蛋白质分析检测，而且还可以直添加到接细胞培养液中进行细胞水平上蛋白功能应用分析。本发明的有益效果是相对于目前其它的核蛋白提取方法，本发明具有其它核蛋白提取方法所不具备的两大特色(1)细胞内核蛋白提取的关键药品为秋水仙素，秋水仙素作为一种生物碱最初是从百合科植物秋水仙中提取出来，为价格便宜的常规药品，目前已广泛应用于细胞工程。秋水仙素通过抑制有丝分裂，使染色体停滞在分裂中期。当有丝分裂处于抑制状态的细胞去除秋水仙素后，细胞则又恢复正常的有丝分裂状态。细胞在处于分裂中期时细胞内的核蛋白则从染色体上脱落下来，因此提取核蛋白不需要使用细胞培养液中严禁使用的蛋白变性剂，同时也避免了 Dnase I在37°C消化时细胞蛋白发生降解现象。目前，市场上常规的核蛋白提取方法均是采用蛋白变性剂或Dnase I。(2)细胞穿透肽-核蛋白-绿色荧光蛋白所形成的重组核蛋白能够直接明确地证实该核蛋白提取方法的简单高效性，并且提取的核蛋白具有生物学功能，能够直接用于核蛋白的功能验证。同时，绿色荧光蛋白作为指示标记能够清晰直接地掌握核蛋白在细胞内的状态和定位。
由上所述，本发明所提供的细胞内核蛋白提取方法具有提取过程高效简单，提取结果直观明了，使用极少量的细胞材料均可用于核蛋白提取。整个提取过程所使用的药品和试剂均在细胞培养操作中所应用，因此，提取的细胞核蛋白能够直接添加到细胞培养液中发挥核蛋白的生物学功能。下面结合附图和具体实施方式
对本发明作进一步详细的说明。
图1是本发明实施例自然状态下的山羊胎儿成纤维细胞形态。图2是本发明实施例提取的核蛋白限定因子诱导后的山羊胎儿成纤维细胞形态。1试验材料与方法1. 1主要实验材料核蛋白表达细胞为细胞；细胞穿透肽的11个氨基酸组成为酪氨酸-甘氨酸-精氨酸-赖氨酸-赖氨酸-精氨酸-精氨酸-谷氨酰胺-赖氨酸-赖氨酸-赖氨酸；重组核蛋白表达载体的基本重组结构为pcDNA3. 1_细胞穿透肽-外源核蛋白-绿色荧光蛋白；细胞培养皿直径为60mm ；细胞培养液为高糖DMEM培养液；1. 2主要操作方法1.2. 1核蛋白的表达用高糖DMEM培养液培养传代细胞，每个60mm培养皿细胞分别添加5ml 高糖DMEM培养液，经过多次培养传代后选择生长速度快、生长状态好的四31~细胞用作核蛋白表达细胞。待四31~细胞生长到铺满培养皿80%左右时。分别采用磷酸钙沉淀法介导Oct 4、Sox2、Myc、Klf4重组核蛋白表达载体在细胞内表达。1.2. 2核蛋白的提取转染24h后荧光显微镜下观察核蛋白在细胞中的表达，分别选取0ct4、Sox2、 Myc, Klf4核蛋白表达的细胞，去除培养皿中的高糖DMEM培养液，每个60mm培养皿 293T细胞分别添加含1 μ g/ml秋水仙素预热的高糖DMEM培养液:3ml，37°C培养箱中继续培养，12h后将细胞连同培养液一起收集到15ml离心管中，4°C放置他。从4°C冰箱取出细胞，4°C条件下在IOOOrpm离心3min，弃去上清液，用4°C预冷的高糖DMEM培养液重悬细胞沉淀，将细胞悬液转移至2ml离心管中，4°C条件下在IOOOrpm离心3min，轻轻吸掉上清液，然后加入4°C预冷的高糖DMEM培养液1ml，同时加入10 μ 1蛋白酶抑制剂，轻轻重悬细胞后冰浴中放置备用。将冰浴放置的细胞悬液一起放入超声波细胞破碎仪中，超声时间 3s,间隙时间5s，工作次数30次，超声波功率80w，超声破碎后，将破碎细胞悬液于4°C条件下12000rpm离心5min，在超净工作台中用0. 22 μ m的滤器过滤除菌，4°C放置备用。1. 2. 3核蛋白的功能验证用高糖DMEM培养液培养山羊胎儿成纤维细胞，待细胞处于对数生长期时，弃去高糖DMEM培养液，分别取200 μ 1核蛋白液与1800 μ 1高糖DMEM培养液添加到每个60mm细胞培养皿中，池后荧光显微镜下观察记录核蛋白进入细胞的情况。取来源于Oct4、Sox2、Myc、Klf4基因的核蛋白等量混合液共计200 μ 1与新鲜 1800 μ 1含4 μ g/ml bFGF和10U/ml LIF的高糖DMEM培养液混合，然后添加到山羊胎儿成纤维细胞培养液中，4h补充2ml含4 μ g/ml bFGF和10U/ml LIF的高糖DMEM培养液，8h后更换为含4 μ g/ml bFGF和10U/ml LIF的高糖DMEM培养液，连续重复操作进行10d，显微镜下观察记录山羊胎儿成纤维细胞的形态变化。2实验结果2. 1核蛋白在细胞中的核定位由于核蛋白基因同绿色荧光蛋白基因形成基因重组体，表达后的绿色荧光蛋白能够准确定位外源核蛋白的表达位置。在磷酸钙介导下0ct4、SOX2、Myc、Klf4核蛋白基因转染入细胞24h后，荧光显微镜下可以观察到这些核蛋白基因均在细胞的细胞核内表达，主要表现为核蛋白连接的绿色荧光蛋白定位在细胞核，绿色荧光蛋白表达的位置同细胞核特异性荧光染料DAPI的显色完全一致，在细胞的胞质内没有绿色荧光蛋白表达。2. 2核蛋白在胎儿成纤维细胞中的生物活性细胞穿透肽能够携带外源蛋白质进入细胞内，绿色荧光蛋白作为指示标记能够清晰反映蛋白所到达的位置。提取的核蛋白液加入细胞培养液池后，荧光显微镜下能够观察到山羊胎儿成纤维细胞的细胞质内聚集大量绿色荧光蛋白，细胞核内能够见到少量绿色荧光蛋白，4h后则可以看到山羊胎儿成纤维细胞的细胞质内聚集大量的绿色荧光蛋白，但细胞核内已经聚集较多的绿色荧光蛋白，绿色荧光蛋白已经穿越细胞核膜进入到细胞核内，通过定位于细胞核而在细胞核内发挥生物学作用，提取的核蛋白液中，0ct4、SOX2、Myc、 Klf4同细胞穿透肽和绿色荧光蛋白相结合组成重组核蛋白，在细胞穿透肽的作用下0ct4、 Sox2、MyC、Klf4核蛋白能够进入细胞核内发挥生物活性，提取的蛋白液中其它的细胞蛋白成分由于没有同细胞穿透肽重组连接不能进入到细胞内，仍然存留在细胞培养液中，并且伴随着培养细胞的换液而去除。2. 3核蛋白在胎儿成纤维细胞中的诱变效应0ct4、Sox2、Myc, Klf4四种核蛋白能够诱导成纤维细胞产生诱导多能性干细胞而发挥诱变效应。提取的0ct4、SOX2、Myc、Klf4四种核蛋白液添加到山羊胎儿成纤维培养液中，连续添加作用8d以后，在培养的山羊胎儿成纤维细胞中能够发现部分细胞出现形态特征的变化，主要表现为山羊胎儿成纤维细胞由纤维状形态(图1)转变成为圆形，并且细胞间相互聚集形成细胞簇或细胞克隆，呈现出诱导多能性干细胞所特有的细胞形态(图2)， 没有添加0ct4、SOX2、Myc、Klf4四种核蛋白液的山羊胎儿成纤维细胞在相同条件下仍保持纤维状形态，从而显示0ct4、Sox2、Myc, Klf4四种核蛋白已具有和发挥蛋白质的生物学活性，四种核蛋白共同作用产生诱变效应。
权利要求
1.一种动物细胞内核蛋白提取方法，其特征在于，包括以下步骤(1)核蛋白的表达用高糖DMEM培养液培养传代细胞，经过多次培养传代后选择生长速度快、生长状态好的细胞用作核蛋白表达细胞；待细胞生长到对数生长期时；分别采用磷酸钙沉淀法介导0ct4、SOX2、Myc、Klf4重组核蛋白表达载体在细胞内表达；(2)核蛋白的提取荧光显微镜下观察核蛋白在细胞中的表达，待重组核蛋白在细胞内表达稳定后， 分别选取核蛋白表达的四31~细胞，去除培养皿中的高糖DMEM培养液，添加含秋水仙素的高糖DMEM培养液处理细胞，待处理细胞形态出现变化后，将细胞连同培养液一起收集到离心管中4°C放置；取出4°C状态下的细胞悬液，4°C离心去上清液，用4°C预冷的高糖DMEM 培养液重悬细胞沉淀，离心洗涤细胞并去上清液，用4°C预冷的高糖DMEM培养液再重悬细胞沉淀，同时加入蛋白酶抑制剂，轻轻吹打混勻后冰浴中超声破碎细胞，4°C离心去沉淀后收集上清液过滤除菌，4°C放置备用。
2.根据权利要求1所述的动物细胞内核蛋白提取方法，其特征在于，所述的重组核蛋白表达载体的基本重组结构为pcDNA3. 1-细胞穿透肽-外源核蛋白-绿色荧光蛋白。
3.根据权利要求2所述的动物细胞内核蛋白提取方法，其特征在于，所述细胞穿透肽的11个氨基酸组成为酪氨酸-甘氨酸-精氨酸-赖氨酸-赖氨酸-精氨酸-精氨酸-谷氨酰胺-赖氨酸-赖氨酸-赖氨酸。
全文摘要
本发明公开了一种动物细胞内核蛋白提取方法。该方法通过利用细胞穿透肽、外源核蛋白和绿色荧光蛋白共同构建重组核蛋白表达载体，介导重组核蛋白在细胞核内表达，待重组核蛋白在细胞内表达稳定后，使用操作液处理细胞，收集细胞，超声波破碎，离心去沉淀后收集细胞上清液，上清液过滤除菌后添加到细胞培养液中，4h后提取的荧光标记外源重组核蛋白通过细胞质进入细胞核并定位于细胞核内。利用该方法提取的核蛋白能够发挥蛋白功能使细胞发生形态特征的改变，结果证实本发明能够简单、快速、高效地提取具有生物活性的细胞内核蛋白。
文档编号C12P21/02GK102277402SQ20111020413
公开日2011年12月14日 申请日期2011年7月20日 优先权日2011年7月20日
发明者丁建平, 任春环, 刘亚, 刘洪瑜, 张子军, 张运海, 方富贵, 曹鸿国, 李运生, 杨盼, 章孝荣, 蒲勇, 陶勇 申请人:安徽农业大学