宫颈细胞保存及dna快速提取一体试剂盒和提取方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及分子生物学领域。更具体地说，本发明设及宫颈细胞和病毒微生物DNA 快速提取方法及保存提取一体试剂盒。
【背景技术】
[0002] 宫颈癌是中国女性第二大常见的恶性肿瘤，研究证明，超过99%的宫颈癌都与人 乳头瘤病毒化PV)相关，同时宫颈癌还是唯一病因明确，可早期发现早期预防的癌症，因此 对HPV的筛查对预防宫颈癌有着重要意义。HPV的检测过程都要设及宫颈样本的采样、保 存、运输及DNA的提取。同时，由于HPV检测多数是用于临床检测，因此简单的实验操作和 对仪器设备更少的依赖是HPV检测用DNA提取试剂盒必须拥有的一个特点。
[0003] 目前宫颈细胞多使用液基细胞保存液进行保存，液基细胞保存液可W保证细胞形 态的完整性，用于后期的病理检测。但是液基细胞学中加有甲醇、甲醒等固定液，其对DNA 有较强的破坏性，对后期的PCR等检测有着较为严重的影响。而且甲醒和甲醇都具有一定 毒性，对操作人员的健康也存在着一定的危害。另外，目前大部分保存液都需要在干冰或冰 盒的保护下进行运输，运样也无疑增加了运输成本和工作量。
[0004] 目前使用DNA提取试剂盒进行DNA的提取工作一般主要分为裂解、洗涂和洗脱等 几个步骤，而对DNA产量最为关键的步骤为裂解步骤，如果裂解的时间较短，会导致DNA产 量过低，从而使得后期检测的灵敏度下降，目前一般是将细胞样本置于裂解液中，并于一定 溫度下解育10~15min，在解育期间还需颠倒混匀几次，W保证裂解的充分进行，裂解步骤 较为繁琐，
【发明内容】
阳〇化]本发明的一个目的是解决至少上述问题和/或缺陷，并提供至少后面将说明的优 点。
[0006] 本发明还有一个目的是提供一种宫颈细胞保存及DNA快速提取一体试剂盒，其保 护液可对置于其中的宫颈样本DNA稳定性进行长时间的保持，W保证临床检验质量，且在 DNA的后续提取时无需裂解步骤，操作简便快捷。
[0007] 本发明还有一个目的是通过提供一种DNA提取的方法，其利用简单的取液器和离 屯、机设备即可进行DNA的提取，且提取快速，得到的DNA纯度高，保证了后续的PCR检验结 果的准确性。
[0008] 为了实现根据本发明的运些目的和其它优点，提供了一种宫颈细胞保存及DNA快 速提取一体试剂盒，其包括细胞保存液、第一洗涂液、第二洗涂液、洗脱液及DNA纯化柱；
[0009] 其中，所述细胞保存液含有2~3mol/L盐酸脈或硫氯酸脈、5~50mmol/L的 Tris-HCl、l~lOmmol/L的邸TA和 5 ~7. 5v/v%的Trixon-100。
[0010] 其中，细胞保存液中的化ixon-100可破坏细胞膜，并解聚胞内与DM结合的蛋白， 较高浓度盐酸脈或硫氯酸脈的加入可进一步破坏核蛋白的二级结构，并使胞内的核酸酶失 活，不但利于DM的提取，且可防止其在后期胆存过程中的降解。此外，邸ΤΑ的添加也可通 过馨合金属离子，抑制核酸酶对DNA的降解作用，Tris-肥1缓冲液的添加可提高DNA在胆 存过程中的稳定性。将采集的宫颈样本置于本发明细胞保存液中lOmin左右，即可实现样 本DNA与其余物质的分离，且DNA在细胞保存液中的室溫储存时间可长达一周W后依然维 持较高的稳定性，有效避免的样本在运输过程中可能会发生降解或污染而对检测结果的可 靠性和敏感性所带来的影响，此外在后续DNA的提取步骤也不再需要繁琐的裂解工作，显 著降低了DNA提取时间，提高了提取效率。
[0011] 优选的是，其中，所述DM纯化柱包括硅胶膜柱及套设于所述硅胶膜柱外部的集 液管，其中硅胶膜可对DNA进行特异性的吸附，再经后续洗涂除杂和洗脱步骤，即可得到高 质量的dm。
[0012] 优选的是，其中，所述第一洗涂液含有50~60v/v%的乙醇、0. 1~Imol/L的盐酸 脈或硫氯酸脈、10~lOOmmol/L的化is-HCl和1~lOmmol/L的邸TA，用于去除硅胶膜和 DNA表面的蛋白质、糖、脂类等物质，其中盐酸脈或硫氯酸脈的可溶解蛋白，适当浓度的添加 提局蛋白的去除效率。
[0013] 优选的是，其中所述第二洗涂液含有65~80v/v%的乙醇、10~lOOmmol/L的 Tris-HCl和1~lOmmol/L的邸TA，用W去除硅胶膜和DNA表面的盐等杂质。
[0014] 其中第一和第二洗涂液中均添加有乙醇，其目的主要是维持DNA的沉淀状态，W 保证DNA与硅胶膜的紧密结合，防止在去除杂质的时候部分DNA的损失。
[0015] 优选的是，其中，所述洗脱液含有10~lOOmmol/L的Tris-HCl和1~lOmmol/L 的邸TA，用W有效得将吸附于硅胶膜上的DM洗脱下来，可得到较高的DM洗脱浓度。
[0016] 本发明的目的还可W进一步由应用所述试剂盒的DNA提取方法来实现，该方法包 括如下步骤：
[0017] 1)将采集的宫颈细胞放入加有所述细胞保存液的保存管内混合均匀，得到细胞样 本液；
[0018] 2)取200~500ul所述细胞样本液，加入150~250ul的无水乙醇混合均匀后，置 入所述DNA纯化柱，离屯、Imin，弃去集液管中的滤液，其中在样本DNA溶液中加入一定比例 的乙醇可提高DNA与硅胶膜的结合能力；
[0019] 3)向所述DNA纯化柱中加入500~750ul所述第一洗涂液，离屯、Imin，弃去集液 管中的滤液；
[0020] 4)向所述DNA纯化柱中加入500~750ul所述第二洗涂液，离屯、Imin，弃去集液 管中的滤液；
[0021] 5)将所述DNA纯化柱内的硅胶膜柱置于新的集液管内，加入50~200ul洗脱液， 依次静置Imin和离屯、Imin后，集液管中的液体即为提取得到的DNA。
[0022] 优选的是，其中，所述步骤1)中宫颈细胞采用宫颈刷进行采集取样，所述细胞保 存液的体积为0.8~1.2ml。 阳02引优选的是，其中，所述步骤2)~5)中离屯、的速度均高于1000化pm，W保证DNA表 面杂质去除的效果。
[0024] 优选的是，其中，所述步骤2)~5)中离屯、的溫度均为室溫，降低了对仪器的依赖 及仪器成本。
[00巧]优选的是，其中，所述步骤5)中静置的溫度为室溫。
[00%] 本发明至少包括W下有益效果：
[0027] (1)本发明试剂盒中的保存液可室溫保存宫颈样本DNA-周W上，有效提高了采 集样本在运输过程中质量的稳定性，从而可W保证后续PCR检验的准确性；
[00測 似本发明后续DNA的提取中不需要繁琐的裂解工作，整个提取步骤在lOminW内 即可完成，显著提高了DNA提取的效率，且提取得到的DNA纯度高，避免了杂质对PCR检验 的干扰，保证了检验结果的可靠性；
[0029] (3)本发明的保存提取操作只设及到移液器和离屯、机两种实验仪器，对仪器依赖 性低。
[0030] 本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本 发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。
【具体实施方式】
[0031] 下面结合具体实施例对本发明做进一步的详细说明，W令本领域技术人员参照说 明书文字能够据W实施。
[0032] 应当理解，本文所使用的诸如"具有"、"包含及"包括"术语并不配出一个或多 个其它元件或其组合的存在或添加。
[0033] < 实例1〉
[0034] 采用某妇幼保健院宫颈细胞采样结果，将宫颈刷采集到的宫颈细胞置于1ml的 细胞保存液中混合均匀得到细胞样本液，其中所述细胞保存液组分为：2mol/L盐酸脈、 5mmol/L的T;ris-HCl、5mmol/L的邸ΤΑ和5v/v%的Trixon-lOO,其余为去离子水。样本义 集后室溫运输2天后随机抽取1例样本进行提取，提取试剂组分如下：
[0035] 其中第一洗涂液含有50v/v%的乙醇、Imol/L的硫氯酸脈、lOmmol/L的Tris-肥1 和5mmol/L的邸TA;第二洗涂液含有65v/v%的乙醇、lOOmmol/L的Tris-HCl和Immol/L的 邸TA;洗脱液含有lOmmol/L的Tris-HCl和lOmmol/L的邸TA。
[0036] DNA提取步骤如下：
[0037] 1)取250ul所述细胞样本液，加入150ul的无水乙醇混合均匀后，置入所述DNA纯 化柱，10000巧m离屯、Imin，弃去集液管中的滤液；
[00測。向所述DNA纯化柱中加入500ul所述第一洗涂液，1000化pm离屯、Imin，弃去集 液管中的滤液；
[0039] 3)向所述DNA纯化柱中加入750ul所述第二洗涂液，15000巧m离屯、Imin，弃去集 液管中的滤液；
[0040] 4)将所述DNA纯化柱内的硅胶膜柱置于新的集液管内，加入50ul洗脱液，依次室 溫静置Imin和1200化pm离屯、Imin后，集液管中的液体即为提取得到的DNA。
[0041] 为验证本实例提取试剂盒的效率，取相同样本，采用市售某品牌DNA提取试剂盒 对该样本进行重复提取。该试剂盒首先加入蛋白酶K和RNA酶后解育2分钟，同时裂解10 分钟。
[0042] 提取完毕后进行巧光定量PCR实验，其中PCR Mastermix体积为20ul，临床样本 DNA体积为lOul，45个循环，实验结果见表1。
[0043] < 实例 2〉
[0044] 采用另一妇幼保健院宫颈细胞采样结果，将宫颈刷采集到的宫颈细胞置于0. 8ml 的细胞保存液中混合均匀得到细胞样本