专利名称：细胞角蛋白19片段化学发光免疫分析测定试剂盒及其制备方法
技术领域：
本发明涉及免疫分析医学领域，具体地，本发明提供了一种细胞角蛋白19片 段化学发光免疫分析定量测定试剂盒及其制备方法。
背景技术：
肺癌具有恶性程度高、病程发展快的特点。近年来其发病率呈上升趋势，是 危害人类健康和导致人类死亡的常见肿瘤之一。肺癌可分为非小细胞肺癌 (NSCLC)和小细胞肺癌(SCLC)。 NSCLC是肺癌中最常见的一种，约占肺癌病 例的70%~80%，各期肺癌的五年存活率只有13%。因此提高肺癌的诊断水平， 对患者的及时治疗和预后监测具有重要意义。
可溶性细胞角蛋白19片段(cytokeratin 19 fragment, CYFRA21-1)是一种新 的肿瘤标记物，尤其对非小细胞肺癌(nonsmall cell lung cancer, NSCLC)的诊断有 重要意义。
细胞角蛋白19片段(cytokeratin 19 fragment)中的CYFRA21-1是一种分化特 异的蛋白质，是一种等电点为5.2，相对分子质量为40,000的酸性胞浆蛋白，属于 细胞结构蛋白范畴，广泛存在于上皮细胞，是组成细胞骨架的蛋白质之一。由它 形成的细胞体中间丝的某些片段是可溶的，并且可以用两种单克隆抗体(BM19.21 和KS19.1)识别出细胞角蛋白19的21和1两个表位(抗原决定簇)。该片段即取 名为可溶性细胞角蛋白19片段(cytokeratin 19 fragment, CYFRA21-1)，它在正常 人血清中含量较低，在上皮源性恶性肿瘤时常有过量表达，并且由于患恶性肿瘤 时激活的蛋白酶加速细胞角蛋白19的降解，使得大量CYFRA21-1产生。在上皮 细胞恶性转化过程中，激活的蛋白酶加速角蛋白的降解，使得大量角蛋白片段释
放人血循环，尤其是CYFRA21-1在肺癌患者血循环中含量丰富，是近年来被推广 的一种新型肺癌标志物。
CYFRA21-1是细胞角蛋白19的片段，由细胞结构中主要成分细胞角蛋白19 的两个单克隆抗体(BM19.21和KS19.1)组成，它是一种可溶性酸性多肽。近年 来，国内外学者利用针对细胞角蛋白19片段的两种特异性单克隆抗体(BM19.21 和KS19.1)建立起了多种检测各种体液或血液中细胞角蛋白19片段的特异性方法。 同时测定神经特异烯醇化酶(NSE)和癌胚抗原(CEA)含量，可以显著提高肺癌 诊断的特异性。
自从1959年，Yallow和Berson发明了免疫分析之后，免疫分析在临床化学领 域中日益成为主要的分析工具。免疫分析可以分为以放射免疫分析(RIA)为代表 的第一代免疫分析技术，以酶联免疫吸附分析(ELISA)为代表的第二代免疫分析 技术，以化学发光免疫分析(CLIA)为代表的第三代免疫分析技术，以及新兴起 的第四代微粒体发光免疫分析技术。
对CYFRA21-1的定量分析，目前常用的是放射免疫分析(RIA)和酶联免疫 吸附分析(ELISA)，其中RIA必须用^I等放射性元素标记，检测设备复杂，必 须用专门的仪器测定，其放射性核素的半衰期短，不能长期保存，同时也给实验 操作人员带来了放射性伤害。ELISA检测灵敏度不够高，检测范围窄，影响因素 较多，易造成假阴性和假阳性等缺点也不能满足临床的要求，因此，化学发光免 疫分析方法(CLIA)应运而生。
20世纪70年代，Arakawe首次报道利用化学发光分析超微量物质，尤其是临 床分析微量的活性物质，随后化学发光在临床上的应用进入一个飞速发展的时期。 化学发光免疫分析方法(CLIA)灵敏度高，可以达到10—18mol/L;快速，发光信
号在几秒钟内产生；操作简便，测试过程中不使用有害试剂。化学发光免疫分析 法因标记方法的不同而分为直接标记法和化学发光酶免疫分析方法。
现有技术中的化学发光免疫分析定量试剂盒为封闭式全自动化学发光测量系 统，需要昂贵的全自动化学发光测量仪，从而限制了推广使用，无法广泛地应用 于临床诊断和科研工作。本发明是在酶联免疫分析的基础上应用酶催化发光底物， 通过检测发光底物产生的光信号代替酶联免疫分析中的显色底物，因而其灵敏度 大大提高，并且操作简便适用性广，既可应用于开放式的半自动化学发光测量仪， 也可用于全自动的测量系统，可实现大批量快检测，使用成本低，更易推广应用。
发明内容
本发明的发明人为了解决上述问题提出并完成了本发明。
本发明的目的是提供一种细胞角蛋白19片段化学发光免疫分析定量测定试 剂盒。
本发明的再一目的是提供一种制备上述试剂盒的方法。
根据本发明的细胞角蛋白19片段化学发光免疫分析定量测定试剂盒包括
1) 细胞角蛋白19片段CYFRA21-1校准品；
2) 细胞角蛋白19片段CYFRA21-1单克隆抗体包被的固相载体；
3) 酶标记的细胞角蛋白19片段CYFRA21-1单克隆抗体；以及
4) 上述酶所作用的化学发光底物。
根据本发明的试剂盒，其中，所述细胞角蛋白19片段CYFRA21-1单克隆 抗体优选为BM19.21和/或KS19.1。
根据本发明的试剂盒，其中，所述固相载体为微孔板、塑料珠、塑料管 或磁性颗粒。
根据本发明的试剂盒，其中，所述标记酶为碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶。
根据本发明的试剂盒，其中，所述化学发光底物为1,2-二氧乙垸类衍生 物、鲁米诺或异鲁米诺。
优选地，上述试剂盒中，所述1，2-二氧乙烷类衍生物为(金刚垸)-1，2-二 氧乙烷、3-(2'-螺旋金刚烷)-4-甲氧基-4-(3"-磷酰氧基)苯基-l， 2-二氧乙垸、 CSPD或CDP- Star。
本发明提供了一种制备上述试剂盒的方法，包括以下步骤
1) 配制细胞角蛋白19片段CYFRA21-1校准品；
2) 以细胞角蛋白19片段CYFRA21-1单克隆抗体包被固相载体；
3) 用酶标记细胞角蛋白19片段CYFRA21-1单克隆抗体；
4) 分装上述细胞角蛋白19片段CYFRA21-1校准品、酶标记的细胞角蛋 白19片段CYFRA21-1单克隆抗体和该酶所作用的化学发光底物；以及
5) 组装为成品。
根据本发明的方法，优选，所述包被固相载体的步骤2)包括以下步骤 I)包被
采用0.05M pH值为9.6的碳酸盐缓冲液或0.046M pH值为4.6的柠檬酸 缓冲液与适当浓度的细胞角蛋白19片段CYFRA21-1单克隆抗体混合制成包被 液，并将其负载于固相载体上；
II) 用生理盐水洗涤上述固相载体；以及
III) 封闭
配制封闭液，基于lOOOmL所述封闭液包含0.2g NaH2P04'2H20、 2.9g NaH2P04'12H20、 10gBSA禾H lmL生物防腐剂，所述封闭液的pH值为7.0 7.6,然后将所得封闭液负载于上述洗涤后的固相载体上。
具体地，所述包被方法可以包括
I) 包被
采用1000mL的0.05MpH值为9.6的碳酸盐缓冲液包含1.59g的无水碳 酸钠和2.94g的碳酸氢钠去离子水溶液，或lOOOmL的0.046MpH值为4.6的 柠檬酸缓冲液包含4.44g的柠檬酸和7.3g的柠檬酸三钠去离子水溶液制成缓 冲液，与适当浓度的细胞角蛋白19片段CYFRA21-1单克隆抗体混合制成包被 液，并将其负载于固相载体上；
II) 用生理盐水洗涤上述固相载体；以及
III) 封闭
配制封闭液，基于lOOOmL所述封闭液包含0.2g NaH2P(V2H20、 2.9g NaH2P04'12H20、 10gBSA和lmL生物防腐剂，所述封闭液的pH值为7.0 7.6，然后将所得封闭液负载于上述洗涤后的固相载体上。在上述方法中，优选，所述固相载体为微孔板、塑料珠、塑料管或磁性 颗粒。
在上述方法中，优选，所述酶为碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶。
在上述方法中，优选，所述化学发光底物为1,2-二氧乙烷类衍生物、鲁 米诺或异鲁米诺。
在上述方法中，优选，所述1,2-二氧乙烷类衍生物为(金刚烷)-1,2-二氧 乙烷、3-(2'-螺旋金刚烷)-4-甲氧基-4-(3"-磷酰氧基)苯基-l，2-二氧乙垸、CSPD 或CDP- Star。
具体的上述试剂盒可以包括细胞角蛋白19片段CYFRA21-1校准品、包被有 细胞角蛋白19片段CYFRA21-1单克隆抗体的微孔板、酶标记物、化学发光底物 液、洗漆缓冲液等。其中，所述细胞角蛋白19片段CYFRA21-1校准品为标准级， 纯度不低于90%,包被的微孔板为48或96孔的微孔板条，标记抗体的酶为偶联 辣根过氧化物酶(HRP)或碱性磷酸酶(ALP)，化学发光底物液为鲁米诺(Luminol) 或3-(2'-螺旋金刚烷)-4-甲氧基-4-(3〃-磷酰氧基)苯基-l ， 2-二氧乙垸 (AMPPD)，洗涤缓冲液为Tris-HCl。
本发明"细胞角蛋白19片段化学发光免疫分析定量测定试剂盒"可以检测 出非小细胞肺癌病人体内的细胞角蛋白19片段CYFRA21-1含量，根据细胞角蛋 白19片段CYFRA21-1含量的多少判断治疗效果及其病情的变化。它具有简便、 快速、灵敏、稳定等优点。该细胞角蛋白19片段化学发光免疫分析定量测定试 剂盒的各项指标均达到同类进口试剂盒的分析法水平。并且，根据本发明的检测 系统为开放式操作，简便快速，不需要昂贵的全自动化学发光测量仪，特别适合 广大的中小医院推广使用，为临床诊断和科研工作提供一种非常有价值的检测手 段。
根据本发明的试剂盒，酶标记的抗体与载体上包被的抗体和被测样品的细胞 角蛋白19片段CYFRA21-1形成"包被抗体-抗原-抗体-酶"的夹心复合物结构， 因此本发明采用的"双抗体夹心一步法"反应模式，既有效地利用了化学发光技 术原理，又应用酶催化发光底物，通过检测发光底物产生的光信号代替酶联免疫 分析中的显色底物，因而具有与酶联免疫分析同等的特异性，而灵敏度大大提高， 比现今的酶联免疫吸附分析灵敏度提高约10倍，可为临床诊断提供更为特异、快 速、可靠的依据。
图1为实施例1所制备的试剂盒中的校准品线性图
具体实施例方式
实施例l制备本发明的细胞角蛋白19片段化学发光免疫分析定量测定试剂
一、酶标细胞角蛋白19片段CYFRA21-1单克隆抗体的制备
(1) 辣根过氧化物酶标记细胞角蛋白19片段CYFRA21-1单克隆抗体的制
备
溶解4.4mg HRP于lmL蒸馏水中，加入0.4mL过碘酸钠(5Ommol/L)室温 搅拌20min，经lmmol/L醋酸钠缓冲液，pH4.4透析后加入8mg的细胞角蛋白19 片段CYFRA21-1单克隆抗体，搅拌2h，最后用200mmol/L的NaBH4进行还原， 经0.02MPBS缓冲液透析后，加等体积甘油，一20'C以下保存。
(2) 碱性磷酸酶标记细胞角蛋白19片段CYFRA21-1单克隆抗体的制备
细胞角蛋白19片段CYFRA21-1单抗用戊二醛法与碱性磷酸酶偶联，对PBS 充分透析，加等体积甘油，一20'C以下保存。
二、 酶标抗体浓度选定
试验证明，采用方阵法选择酶标抗体的工作浓度范围为1:500- 50000。
三、 细胞角蛋白19片段CYFRA21-1校准品的制备
本发明试剂盒中，细胞角蛋白19片段CYFRA21-1系列校准品，以小牛血清 为基质，将细胞角蛋白19片段CYFRA21-1抗原纯品，以国家标准品为准系列稀 释而成。分装浓度范围为0、 1、 3、 9、 27、 81ng/mL的校准品共6瓶。
四、 以细胞角蛋白19片段CYFRA21-1单克隆抗体包被固相微孔板 (1)包被
采用0.05M pH值为9.6的碳酸盐缓冲液或0.046M pH值为4.6的柠檬酸 缓冲液与适当浓度的细胞角蛋白19片段CYFRA21-1单克隆抗体混合制成包被 液，并将其负载于固相载体上；
具体地，所述包被方法可以包括 无水碳酸钠 1.59g 碳酸氢钠 2.94g 去离子水 lOOOmL
溶解混匀后，调整pH值至9.6，加入5.0mg细胞角蛋白19片段CYFRA21-1 单克隆抗体混匀，然后加入微孔板各孔中，每孔110^L， 4'C过夜。
或者，
柠檬酸 4.44g 柠檬酸三钠 7.3g去离子水 lOOOmL
溶解混匀后，调整pH值至4.6，加入5.0mg细胞角蛋白19片段CYFRA21-1 单克隆抗体混匀，然后加入微孔板各孔中，每孔110pL， 4'C过夜。
(2) 洗涤用生理盐水洗三次。
(3) 封闭
NaH2P04.2H20 0.2g Na2HP04.12H20 2.9g BSA 10g Proclin 300 lmL
双蒸水 定容至lOOOmL
将上述试剂称量好放入洁净容器中，加双蒸水定容，溶解混匀，测定pH值为
7.0。
每孔分别加入封闭液300pL，室温放置3小时。甩掉封闭液，在吸水纸上拍干。 室温除湿干燥24小时。立即进行真空封袋。封袋后放置15分钟检查无漏气，如 果有漏气需重新封袋。贴签后置2 8'C保存。
五、 酶标单抗稀释液
Tris 12.120g BSA 5g Proclin lmL 双蒸水 lOOOmL
六、 化学发光底物
本发明所使用的辣根过氧化物酶(HRP)的化学发光底物液的配制方法
A液在双蒸水中加入Tris和浓HCl配成O.IM pH值为8.5的Tris-HCl缓冲 液。在此缓冲液中加入4.0mg/mL的Luminol和0.3mg/mL的对碘苯酚。
B液在双蒸水中加入柠檬酸三钠和柠檬酸，配制成O.IM pH值为4.6的柠檬
酸缓冲液，在此溶液中加入200mg/mL的过氧化氢溶液。
使用方法使用前将A液与B液按1:1比例混合后使用。 本发明所使用的碱性磷酸酶(ALP)的化学发光底物液的配制方法
Tris24g
NaCl160g
KC14g
HCl15mL
双蒸水lOOOmL
Proclin 300lmL
AMPPD200mL
七、洗涤缓冲液
Tris24g
NaCl160g
KC14g
HCl15mL
去离子水lOOOmL
调整pH值至7.4。
八、半成品及成品组成
上述步骤所得产品分装即为半成品。抽出三份经过特异性、精密性、灵敏度 及稳定性检定合格才能组装成本发明的定量测定试剂盒。组装成试剂盒后还需抽 检合格后才能出厂。
本发明试剂盒中的固相抗体为提前包被好的，不需要现场包被；校准品为液 体；标记抗体也是已经稀释到工作浓度的工作溶液，均可以直接使用。校准品/待 测样品、酶标记抗体溶液以及发光底物加样体积均为50pL，实验过程中，不需要 调节加样体积，最大程度的方便使用。以本发明上述测试方法按上述程序进行测 定，所用时间短，方便，快速。
利用本发明的试剂盒进行检测，灵敏度高，特异性强，检测范围宽，操作简 单，无放射性污染，试剂盒成本低，临床适用性强，更适用于我国临床检测筛查。
实施例2 3制备本发明的细胞角蛋白19片段化学发光免疫分析定量测定试
剂盒
除分别以塑料珠、磁性颗粒作为载体外，其余均以与实施例1相同的方法 制备本发明的定量测定试剂盒。
实施例4本发明的试剂盒的使用方法
在利用实施例1的试剂盒实验前需首先取出固相抗体、校准品/检测样品、标 记抗体溶液室温放置15 30分钟，使平衡到室温；然后将恒温温箱或者水浴锅调 至37°C;再后准备好合适的微量加样器及对应吸头并且检查化学发光仪以及辅助
仪器如洗板机等是否正常工作。
利用本试剂盒按照实施例1进行实验的操作步骤如下
1) 将实验需要的板条(巳包被好抗体，96/48孔可拆为12/6*8*1 L)放置在 板架上；
2) 反应孔中分别加待测样品和各浓度校准品，校准品每孔加0、 1、 3、 9、 27、 81ng/mL各50pL，每次试验设空白1孔，然后除空白孔外各孔加酶标记抗体溶液 50nL;
3) 微量振荡器上振荡30秒混匀；
4) 37'C恒温温育60分钟；
5) 弃去孔中溶液，用Tris-HCl洗液，自动洗板机或者手工洗板5次，在吸水 纸上拍干；
6) 每孔加发光底物液5(HiL，用微量震荡器充分振荡混合均匀，室温(20 28'C) 反应30 90分钟；
7) 化学发光仪检测相对发光值(RLU)，测量时间1秒/孔；
8) 分别对校准品浓度和对应RLU取对数，在建立的双对数曲线上建立标准 曲线，以各待测血清RLU值在标准曲线上查出该血清的细胞角蛋白19片段 CYFRA21-1的浓度，计算检测结果(见附图l);
9) 打印检测结果报告。
实施例5本发明的试剂盒的方法学鉴定
按照本领域中常规的制造及检定规程对实施例1中制备的试剂盒进行鉴定， 经过大量的实验证明，本发明的试剂盒在用于细胞角蛋白19片段(CYFRA21-1) 浓度水平测定时，该方法学指标如下
检测范围0 81ng/mL;
灵敏度最小检出限为0.10ng/mL;
精密度分析内精密度(高、中、低三个质量控制范围)均小于7% (n=10)， 分析间精密度(高、中、低三个质量控制范围)均小于7% (n-10);
准确性加标回收率在90 110%之间；
特异性与CEA、 AFP、 CA199等CA系列常见肿瘤标志物交叉反应率不
高于0.5%; 、
稳定性各试剂组分置37'C，考察6天后，各组分仍稳定。
本发明的试剂盒所用样品量少， 一次检测只要5(^L，体外检测对测试对象没 有任何毒副作用。同时本发明采用的化学发光酶免疫分析方法，不产生放射性污 染，各指标也优于目前广泛应用的酶联免疫吸附分析方法(ELISA)。利用本发明 方法进行检测，灵敏度高，特异性强，检测范围宽，操作简单，无放射性污染， 试剂盒成本低，临床适用性强，更适用于我国临床检测筛査实验室。因此本发明 为临床检测细胞角蛋白19片段(CYFRA21-1)，辅助诊断非小细胞肺癌以及手术 后观察提供了一种更准确，特异，方便，快捷的方法。
实施例6使用本发明的试剂盒与国外公司进行临床诊断的实验数据的对照 本发明试剂和美国DRG公司ELISA系列检测试剂盒细胞角蛋白19片段 (CYFRA21-1)试剂对1240份临床血清样品检测结果总符合率达99.8%，数据如下
本发明试剂检测结果
_=_+ 合计
DRG公司试剂检测结果 一759 4 763
+ 3 454 457
合计 762 458 1240
从所列出两种试剂检测结果数据分析，本发明试剂检测结果阴性中有3份阳 性，阳性结果中有4份阴性和DRG试剂检测结果不符，这一差异可能由于试剂采 用的抗原/抗体材料不同，及抗原/抗体的结合位点不同而引起的，本发明试剂盒的
灵敏度、特异性、准确性与同类进口试剂盒无明显差异；便于推广应用，安全可
权利要求
1、一种细胞角蛋白19片段化学发光免疫分析测定试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括1)细胞角蛋白19片段CYFRA21-1校准品；2)细胞角蛋白19片段CYFRA21-1单克隆抗体包被的固相载体；3)酶标记的细胞角蛋白19片段CYFRA21-1单克隆抗体；以及4)上述酶所作用的化学发光底物。
2、 如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述细胞角蛋白19片段 CYFRA21-1单克隆抗体优选为BM19.21和/或KS19.1。
3、 如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述固相载体为微孔板、 塑料珠、塑料管或磁性颗粒。
4、 如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述酶为碱性磷酸酶或 辣根过氧化物酶。
5、 如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述化学发光底物为1,2-二氧乙垸类衍生物、鲁米诺或异鲁米诺。
6、 如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述1,2-二氧乙烷类衍 生物为(金刚烷)-l，2-二氧乙垸、3-(2'-螺旋金刚烷)-4-甲氧基-4-(3"-磷酰氧基) 苯基-1， 2-二氧乙烷、CSPD或CDP-Star。
7、 一种制备权利要求l所述试剂盒的方法，其特征在于包括以下步骤1) 配制细胞角蛋白19片段CYFRA21-1校准品；2) 以细胞角蛋白19片段CYFRA21-1单克隆抗体包被固相载体； 3) 用酶标记细胞角蛋白19片段CYFRA21-1单克隆抗体；4) 分装上述细胞角蛋白19片段CYFRA21-1校准品、酶标记的细胞角蛋 白19片段CYFRA21-1单克隆抗体和该酶所作用的化学发光底物；以及5) 组装为成品。
8、 如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述细胞角蛋白19片段 CYFRA21-1单克隆抗体优选为BM19.21禾口/或KS19.1。
9、 如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述包被固相载体的步骤 2)包括以下步骤I) 包被采用0.05M pH值为9.6的碳酸盐缓冲液或0.046M pH值为4.6的柠檬酸 缓冲液与适当浓度的细胞角蛋白19片段CYFRA21-1单克隆抗体混合制成包被 液，并将其负载于固相载体上；II) 用生理盐水洗涤上述固相载体；以及III) 封闭配制封闭液，基于1000mL所述封闭液包含0.2g NaH2P(V2H20、 2.9g NaH2P04'12H20、 10gBSA和lmL生物防腐剂，所述封闭液的pH值为7.0 7.6，然后将所得封闭液负载于上述洗漆后的固相载体上。
10、 如权利要求7或9所述的方法，其特征在于，所述固相载体为微孔 板、塑料珠、塑料管或磁性颗粒。
11、 如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述酶为碱性磷酸酶或辣 根过氧化物酶。
12、 如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述化学发光底物为1，2-二氧乙垸类衍生物、鲁米诺或异鲁米诺。
13、 如权利要求12所述的方法，其特征在于，所述1,2-二氧乙烷类衍 生物为(金刚垸)-l,2-二氧乙烷、3-(2'-螺旋金刚烷)-4-甲氧基-4-(3"-磷酰氧基) 苯基-1， 2-二氧乙烷、CSPD或CDP-Star。
全文摘要
本发明涉及免疫分析医学领域，具体地，本发明提供了一种细胞角蛋白19片段化学发光免疫分析测定试剂盒及其制备方法。根据本发明的试剂盒包括1)细胞角蛋白19片段CYFRA21-1校准品；2)细胞角蛋白19片段CYFRA21-1单克隆抗体包被的固相载体；3)酶标记的细胞角蛋白19片段CYFRA21-1单克隆抗体；以及4)上述酶所作用的化学发光底物。进一步，根据本发明制备上述试剂盒的方法包括以下步骤1)配制细胞角蛋白19片段CYFRA21-1校准品；2)以细胞角蛋白19片段CYFRA21-1单克隆抗体包被固相载体；3)用酶标记细胞角蛋白19片段CYFRA21-1单克隆抗体；4)分装上述校准品、酶标记物和化学发光底物；以及5)组装为成品。本发明的试剂盒具有简便、快速、灵敏、稳定等优点。
文档编号G01N21/76GK101377501SQ20071012116
公开日2009年3月4日 申请日期2007年8月31日 优先权日2007年8月31日
发明者应希堂, 林金明, 栩 王, 根 石, 胡国茂 申请人:北京科美东雅生物技术有限公司