专利名称：巴马汀及其衍生物在蛋白质荧光检测中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及蛋白质荧光检测技术，具体地说涉及蛋白质的一种 新的荧光染料。
背景技术：
在生命科学研究领域中，离不开对生命的基本物质蛋白质和DNA的研究，也就离不开对蛋白质的检测技术。尤其是近几年，随 着基因组学和蛋白质组学的飞速发展，使我们对蛋白质的分离检测 技术有了更高的要求。蛋白质的监测方法有很多，包括浊度法、凯氏定氮法、吸光光 度法、荧光光度法，以及新发展起来的共振瑞利散射法、高效液相 色谱法、毛细管电泳分析法。荧光光度法是目前研究最多、应用最 广、操作较为简便、灵敏度高的检测方法。巴马汀属于异喹啉生物碱的原小檗碱类，它存在于许多植物中， 在民间广泛的作药用。到目前为止，还没有将其用于蛋白质荧光染 色的报道。发明内容本发明的目的在于提供巴马汀及其衍生物在蛋白质荧光检测中 的应用。本发明所述的巴马汀相关化合物是指以巴马汀阳离子为母核的 盐酸盐、硫酸盐或氢碘酸盐等。 本发明还利用巴马汀母核和SDS (十二烷基硫酸钠)结合，形 成刚性的配合物，产生强烈的荧光。下面是本发明一个可用的凝胶检测方法，其包括步骤1) 将SDS-PAGE电泳后的蛋白质样品凝胶置于固定液中固定 1-30 min,弃固定液，然后用去离子水冲洗0.01-10 min;优选的固 定时间为5min，去离子水冲洗时间为3min，固定液可以是含有40 %乙醇和10%乙酸的水溶液；2) 加入荧光染色液染色l-30min,用去离子水冲洗1-10 min, 其中所述染色液为含按重量体积比0.0001~0.01%的巴马汀或其衍生 物及按体积比1-20%醋酸的水溶液；优选的染色的时间为10 min，去 离子水冲洗时间为0.5 min,优选的巴马汀或其衍生物的浓度是 0.0005%,醋酸浓度为2%;3) 检测，检测波长为250-370 nm,优选为312nm。 用巴马汀作为蛋白质荧光染料具有如下优点1) 高敏感度荧光染料比普通染料的灵敏度要高很多倍2) 操作简单迅速操作步骤少，可在半个小时内完成；3) 重现性好受温度、摇床摆动频率等外部条件影响较小；4) 染色背景好釆用独特的离子对技术，即小檗碱和溶液中的SDS 结合成配合物，减少对胶体背景的染色并产生比单纯使用小檗碱 更强烈的荧光，确保染料对蛋白质的高度选择性和灵敏性；5) 线性关系好能在较大范围内对蛋白质进行半定量测定；6) 可逆性好容易脱色；7) 兼容性好可与MALDI-TOF等质谱仪高度兼容；8) 使用安全釆用毒性很低的天然荧光染料，提高实验操作的安全 性，对环境污染小；9) 成本低。
图1.巴马汀的化学结构；图2.巴马汀染色法中，染色前冲洗3min和不冲洗的影响，其 中A是未经冲洗得凝胶，B是经过冲洗的凝胶，蛋白质载样量(每 条带)如下带1, 1000ng;带2， 2500ng;带3, 250ng;带4， 125ng; 带5， 63ng;带6, 32ng;带7， 16ng;带8， 8ng;带9， 4ng;带 10， 2ng;图3. (A)染色液中巴马汀的不同浓度对染色效果的影响，巴 马汀的浓度分别为(a) 0.0001%, (b) 0.0003%, (c) 0.0005%, (d) 0.0007%, (e) 0.0009%; ( B )染色液中乙酸不同浓度对染色效果的 影响，乙酸的浓度分别为(a)O, (b)1.0%, (c)2.%， (d)3.0%, (e)4.0%; (C)不同染色时间对染色效果的影响，染色时间分别 为(a) 5min, (b) 10min, (c) 20min, (d) 40min， (e) 80min; 标准蛋白质上样质量由4ng到1000ng/条带，蛋白质带的亮度用Tina 2.09图象分析软件分析；图4.用巴马汀染色标准蛋白质的线形动态范围。五种不同分 子量的标准蛋白质(a，B-半乳糖苷酶、b，磷酸化酶、c，碳酸酐酶、 d，BSA、 e，卵白蛋白)在10%聚丙烯酰胺凝胶中分离。染色后，蛋 白质带用Tina 2.09图象分析软件分析。蛋白质质量的范围在 4-1000ng;图5.巴马汀荧光染色与其它的蛋白质检测方法灵敏度的比 较。 一系列稀释2倍的标准蛋白质分别上样2ng/条带到1000ng/条 带到凝胶上，观察以下染色方法的灵敏度(A)考马斯亮蓝G-250 染色；(B) SYPRORed染色；(C)巴马汀荧光染色；图6.五.co"提取液用分别用巴马汀荧光染色与SYPRO Red染 色后，2-D凝胶图像的比较。
具体实施方式
下面结合具体的实施例来进一步阐述本发明。应当理解，这些实
施例仅用于说明本发明，而不能限制本发明的保护范围。 实施例l巴马汀蛋白质荧光染色图l是巴马汀的化学结构式。巴马汀蛋白质荧光染色实验釆用下 述步骤进行1 )将经SDS-PAGE电泳后的蛋白质样品(SDS-6H， Sigma-Aldrich Co， USA)凝胶置于固定液中5 min,去离子水冲洗3 min,固定液为体积百分含量40%乙醇，10%乙酸水溶液；2) 在染色液中染色IO min,再用去离子水冲洗0.5 min，染色 液为含0.0005% (W/V)巴马汀含2%乙酸的水溶液；3) 被染色的胶直接放在透射仪上，312nm处透射，记录影像。 按照上述方法分别用巴马汀的盐酸盐、硫酸盐或氢碘酸盐进行蛋白质染色，结果表明用这些衍生物均能够得到类似于巴马汀的检 测结果。(SDS-PAGE参照《分子克隆实验指南》第三版相关部分进行) 实验例l凝胶染色前去离子水冲洗对灵敏度的影响按照实施例1的方法进行染色，A是染色前未经冲洗得凝胶， B是染色前冲洗3 min的凝胶，蛋白质(蛋白样式)载样量(每条 带)如下带l, 1000ng;带2, 2500ng;带3， 250ng;带4, 125ng; 带5, 63ng;带6, 32ng;带7， 16ng;带8, 8ng;带9， 4ng;带 10， 2ng。说明步骤2中冲洗是必要的，其能显著提高染色效果。 实验例2巴马汀浓度对染色效果的影响按照实施例l的方法，用不同浓度的巴马汀进行染色，巴马汀 的浓度分别为(a) 0.0001%, (b) 0.0003%, (c) 0.0005%， (d) 0.0007%, (e) 0.0009%,结果如图3A所示，实验表明当巴马汀浓 度为0.0001%仍能获得较好的染色效果，但以0.0005%效果较佳。 标准蛋白质上样质量由4ng到1000ng/条带，蛋白质带的亮度用Tina 2.09图象分析软件分析(下同)。 实验例3乙酸浓度对染色效果的影响按照实施例l的方法，染色液中使用不同浓度的乙酸，乙酸浓 度分别为(a) 0, (b ) 1.0%, (c) 2.0%, (d ) 3.0%， (e ) 4.0% V/V。 结果如图3B所示，实验表明乙酸浓度为2.0%时染色效果较好。说 明步骤2中2%的乙酸浓度能显著提高染色效果。 实验例4染色时间对染色效果的影响按照实施例l的方法，釆用不同的染色时间进行染色，染色时 间分别为(a ) 5min， ( b ) 10min, ( c ) 20min, ( d ) 40min, ( e ) 80min。结果如图3C所示，实验表明染色10分钟效果较佳，20分 钟次之，时间过长或过短效果均会降低。说明步骤2中IO分钟的染 色时间能显著提高染色效果。 实验例5巴马汀与其它染料染色效果对比釆用不同染料进行染色，(A)考马斯亮蓝G-250染色，(B) SYPRORed染色，(C)巴马汀荧光染色。带1， 1000ng;带2， 2500ng; 带3, 250ng;带4， 125ng;带5, 63ng;带6, 32ng;带7, 16ng; 带8， 8ng;带9, 4ng;带10, 2ng。结果如图5所示，考马斯亮蓝 G-250染色和SYPRO Red染色在带7之后就已经检测不出来了 ，而 巴马汀在带9仍隐约可见。其中巴马汀染色釆用实施例1的方法进行，考马斯亮蓝及SYPRO Red染色分别按下述方式进行 考马斯亮蓝G-250染色法[11 )将电泳后的凝胶置于固定液(12 % trichloroacetic acid水溶液) 中1小时；2) 在染色工作液(0.1% w/v CBBG-250 , 20%甲醇，2% w/v 磷酸，10% w/v硫酸氨)中染色2小时，再用25%甲醇冲洗0.5 min;3) 被染色的胶放在透光板，记录影像或直接干胶。
SYPRO Red染色法[2]:1) 将电泳后的凝胶置于250 ml固定液(40%乙醇，2%乙酸，0. 0005% SDS)中2小时，然后用2%乙酸，0.0005% SDS)水溶液 冲洗3次每次20min;2) 在染色工作液中染5小时，再用7%乙酸冲洗0.5min;3) 被染色的胶直接放在透射仪上，312nm处透射，记录影像。 实验例6五.coft'提取液的染色对比取Kco/Z菌液，12000rpm离心收集菌体，加入0.02mol/L的磷酸盐缓冲液(pH7.0)重悬菌体。利用超声波破碎仪破碎细胞。 18000rpm离心30分钟，收集上清，即得五.co&'提取液(粗蛋白制 品)，将上述粗蛋白制品经双向凝胶电泳后，分别釆用实施例l及 实验例5中SYPRO Red染色法进行染色，结果如图6所示。由图 6可以看出经SYPRO Red染色后可视化的大多数蛋白质斑 点，经过巴马汀染色后也可以看见,显示巴马汀染色法是一种简单 的、灵敏的方法。参考文献1, Neuhoff， V., Arold， N., Taube， D.， Ehrhardt W,五Z/Tto; /wresi;y 1998， 9， 255-262.2. Malone, J.， Radabaugh, M.， Leimgruber， R., Gerstenecker, G.， ￡7e"rap/ioresis. 2001， 22， 919-932.
权利要求
1、巴马汀及其衍生物在蛋白质荧光检测中的应用。
2、 如权利要求l所述的应用，其特征在于所述的巴马汀衍生物 为巴马汀的盐酸盐、硫酸盐或氢碘酸盐。
3、 一种蛋白质的荧光检测方法，其包括步骤1) 将经SDS-PAGE电泳后的蛋白质样品凝胶置于固定液中固 定l-30min，弃固定液，然后用去离子水冲洗0.01-10 min;2) 加入荧光染色液染色l-30min,用去离子水冲洗1-10 min， 其中所述染色液为含按重量体积比0.0001~0.01%的巴马汀或其衍生 物及按体积比1-20%醋酸的水溶液；
4、 如权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤l)中蛋白质 固定的时间为5min，然后用去离子水冲洗3min。
5、 如权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤2)中染色的 时间为10min，然后用去离子水冲洗0.5min。
6、 如权利要求3~5任一项所述的方法，其特征在于，步骤2) 染色液中巴马汀的浓度按重量体积比为0.0005%。
7、 如权利要求3 5任一项所述的方法，其特征在于，步骤2) 中醋酸的浓度为2%。
8、 如权利要求3 5任一项所述的方法，其特征在于，步骤3) 检测波长为250-370 nm。
9、 如权利要求3~5任一项所述的方法，其特征在于，步骤3) 检测波长为312nm。
全文摘要
本发明涉及蛋白质荧光检测技术，具体地说是巴马汀及其衍生物在蛋白质荧光检测中的应用。本发明还提供了应用巴马汀进行蛋白荧光凝胶检测的方法，包括步骤将蛋白质样品电泳后的凝胶在固定液中固定，去离子水冲洗；染色，去离子水冲洗；检测。本发明具有敏感度高、操作简单迅速、重现性好、染色背景好、线性关系好、可逆性好、兼容性好、使用安全、成本低等优点。
文档编号G01N33/52GK101113983SQ20071012113
公开日2008年1月30日 申请日期2007年8月30日 优先权日2007年8月30日
发明者金利泰 申请人:温州医学院