专利名称：蛋白质nt5e在制备诊断胃癌的试剂中的应用及诊断试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物科学领域，更具体地说，涉及一种蛋白质NT5E在制备诊断胃癌的试剂中的应用及诊断试剂盒。
背景技术：
胃癌是危害人类健康的常见恶性肿瘤，根据世界卫生组织(WHO) 2008年的统计(世界卫生组织年度统计，2008)，在全世界范围，胃癌病人的死亡率高居第二。在2006年 WHO的统计中显示有接近950，000个新发病例，同时有约700，000人死于这一种疾病。在我国，每年胃癌新发患者数超过30万，死于胃癌的人数约16万，病死率居恶性肿瘤之首，严重威胁人民生命健康(陈竺，全国第三次死因回顾抽样调查报告，2008)。为降低死亡率，提高胃癌的疗效，关键是胃癌的“三早”工作，即早期发现、早期诊断及早期治疗。然而，由于绝大多数胃癌患者缺乏特异性的临床症状，故早期胃癌诊断率很低，手术率不足10% (吴云林外科理论与实践，2005，10:401);术后病人的生存期也较短。目前，我国胃癌总体5年生存率为43. 4%，术后病理分期(pathological TNM，pTNM)I、II、III、IV期患者的术后5年生存率分别为75. 65%,58. 73%,28. 01%和8. 42% (刘炳亚中华胃肠外科杂志，2010，13:163)。因此，提高胃癌的早期诊断率非常重要。而一般体检和影像学检查作用有限，待能够发现和明确诊断时，往往已到了中、晚期，缺少预警价值。因此，从长远角度看，应致力于发现敏感性和特异性均较好的肿瘤标志物。此外，胃癌异质性大，预后及对治疗的反应性差别较大，对于临床评估预后以及对治疗反应性的预测与评价，均需良好的肿瘤标志物。理想的肿瘤标志物应符合以下条件(I)敏感性高；(2)特异性高；(3)肿瘤标志物浓度和肿瘤大小、转移、恶性程度有关，能协助肿瘤分期和判断预后；(4)半衰期短，有效治疗后浓度很快下降，能较快反映体内肿瘤的实际情况；(5)存在于体液，特别是血液中，易于检测(刘炳亚中华胃肠外科杂志，2010，13:163)。肿瘤血清标志物的研究一直是本领域的研究重点。现已有多种胃癌肿瘤标识物如癌胚抗原(CEA)，存在于胃癌及其它腺癌患者的血清中，但对早期胃癌的诊断意义较小，主要用于胃癌治疗前后的动态观察(Lipkin M:Cancer Research, 1988, 48:235 ；Lipkin: JBCSupplymental, 1992，16:1) ;CA125、CA 19-9, CA50、CA724 以及 CA242 等部分糖抗原在部分胃癌患者中可升高，但其敏感性仅20 40 % (Kodera Y:The Americanjournal of gastroenterology, 1996，91:49 ；Chou M:Disease Markers, 2000，16:105 ；Lai IR etal:Hepato—gastroenterology，2002，49:115 Edip U et al!Advances inTheray, 2008, 25:1075);还有研究发现肿瘤相关糖蛋白抗原_72 (TAG-72)对胃癌的敏感性为69%，特异性为84% (刘军等实用医学杂志，1999，15:4);糖蛋白抗原MG7_Ag在血清中有40% -60%的阳性检出率，在胃癌组织中有80% -94%的阳性检出率(Ren JiCancer,2000,88 :280);核小体组蛋白类抗原(ΙΡ0 — 38)作为胃癌诊断的敏感性为57. 4%，特异性超过90% (Hao Y etal: J Proteome Res, 2008，7:3668)以上这些指标均有利于早期胃癌的诊断。某些肿瘤基因，如DDC、C-myC、C-erb-2、p53以及nm23等对胃癌的发生、转移也有一定意义，但广泛应用于临床仍受限制(刘倩等，人民卫生出版社，2004)。由于现有的胃癌生物标识物在灵敏度和特异性上的缺陷，虽然在疗效监测、提示复发、判断预后和高危人群的普查中具有一定的价值，但目前仍不能用于胃癌的确诊。为了实现对胃癌的早期高灵敏性，高特异性的诊断，急需在分子水平上寻找到更敏感、更特异的胃癌生物标志物。我们在前期研究中利用人蛋白质组芯片高通量、快速分析的优势，分析了胃癌病人相关血清101份(胃癌病人37份、高危病人14份、健康人血清50份)，在较短时间内比较了患者和健康人样品中的不同，给出了候选血清生物标志物，以期早期诊断和有效治疗胃癌。蛋白NT5E(CD73)是胞外-5’-核苷酸酶(Ecto-5’-nucleotidase, eNT)通过糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚定于质膜的一种糖蛋白。NT5E广泛表达于人体内皮细胞、淋巴细胞等组织细胞表面。NT5E具有胞外核苷酸酶活性，水解AMP产生腺苷。腺苷与受体结合可促进 血管新生、预防组织缺血再灌注损伤、抑制炎症和免疫反应。最近发现腺苷能够抑制人类血管内皮细胞的前炎症反应(Grunewald JK et al J Inflamm, 2010, 7:10)o NT5E可因内源性磷脂酶C水解GPI而从质膜表面脱落，进而腺苷生成降低。NT5E还具有非水解酶活性，参与细胞的黏附和信号转导。研究发现NT5E能通过CD3/TCL复合物，参与T细胞的激活(Linden J :Annu Rev Pharmacol Toxicol, 2001，41:775)。研究表明NT5E在肿瘤的生长、凋亡、侵袭和转移中发挥重要作用。Stagg J et al =PNAS, 2010, 107:1547 ；Zhi X et al =ClinExp Metastasis, 2007, 24:439 ；ffang L et al J Cancer Res Clin Oncol, 2008, 134:365 ；Mikhailov A et al J Immunol, 2008, 181:464)。但目前为止，尚未见有将NT5E蛋白质作为胃癌生物标志物的报导。
发明内容
针对上述现有技术中存在的技术问题，本发明提供一种蛋白质NT5E在制备诊断胃癌的试剂中的应用及诊断试剂盒，来定性检测人血清中的抗蛋白质NT5E的IgG抗体的水平，作为辅助胃癌早期诊断的一种手段，大大提高胃癌早期诊断的敏感性和特异性。为达到上述目的，本发明所采用的技术方案如下蛋白质NT5E在制备诊断胃癌的试剂中的应用。—种制备诊断胃癌疾病的诊断试剂盒,该试剂盒采用现在临床广泛使用的ELISA技术，应用间接法定性检测人血清中抗蛋白质NT5E的IgG抗体；具体是用纯化的人蛋白质NT5E抗原通过包被缓冲液稀释后包被在酶标板上的微孔内制成固相抗原，加入封闭液；将标准品与待测血清样品用样品稀释液稀释后加入各自的抗原测定孔中，每孔加入含有辣根过氧化物酶(HRP)标记的anti-Human IgG抗体的酶标试剂,形成NT5E-抗体-酶标二抗复合物，经洗涤液彻底洗涤后加酶底物溶液显色，酶底物溶液反应时间到后加入酸性终止液；所述酶底物溶液在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色，利用颜色的深浅来检测样品中抗蛋白质NT5E的IgG抗体的水平。所述纯化的人蛋白质NT5E (带GST标签)是从酿酒酵母中过量表达，亲和纯化而得到，浓度为25μ8/ Λ。
所述标准品包括OU/mL标准血清I和100U/mL标准血清2,分别为正常人血清以及NT5E抗体为阳性的血清稀释于样品稀释液中。所述酶标试剂含HRP- 二抗O. 1-1 μ g/mL。所述酶底物溶液包括显色剂A:500mL溶液中含醋酸钠13.6g，柠檬酸1.6g，30%双氧水 O. 3mL、显色剂 B 500mL 溶液中含 TMB350mg，DMS020mL，柠檬酸· H2O 5. lg。所述包被缓冲液为O. 05M pH9. 6的碳酸盐缓冲液，即I升溶液中含I. 59g Na2CO3,
2.93g NaHCO3。所述封闭液为O. 5%BSA的O. Olmol/L pH7. 4磷酸盐-NaCl缓冲液(PBS)溶液，即I升溶液中含 5g 牛血清白蛋白(BSA)，8g NaCl, 0. 2g KH2PO4, 2. 9g Na2HPO4 · 12H20，0. 2g KCl。
所述样品稀释液为0. 01mol/L pH7. 4磷酸盐-NaCl缓冲液(PBS)。所述洗涤液为0. 01mol/L pH7. 4磷酸盐-NaCl缓冲液(PBST)，PBST内含0. 05%Tween-20，即 I 升溶液中含 8g NaCl, 0. 2g KH2PO4, 2. 9g Na2HPO4 · 12H20，0. 2g KCl,0.5mL Tween-20o所述终止液为2mol/L H2SO4溶液。所述试剂盒中的试剂均可以加入防腐剂，以便于保存。本发明的有益效果在于1.提供的血清生物标志物的特异性为90%，敏感性为92%，具有高特异性和高敏感性的特点。2.提供一种灵敏、安全、可靠、易操作的商品化试剂盒，定性测定人血清中抗蛋白质NT5E的IgG抗体的水平，有助于辅助早期诊断胃癌。
图I是银染鉴定NT5E的表达浓度、纯化状况示意图；图中I表示标准BSA溶液浓度为5 μ g/mL2表示标准BSA溶液浓度为10 μ g/mL3表示标准BSA溶液浓度为25 μ g/mL4表示标准BSA溶液浓度为50 μ g/mL5表示标准BSA溶液浓度为100 μ g/mL6表示经琼脂糖亲和介质(谷胱甘肽)(国家生化工程技术研究中心)分离纯化后的NT5E蛋白质样品(含GST标签)。7表示蛋白质分子量marker，从大到小分子量分别是170KD，130KD，95KD，72KD，55KD。图2是Western-Blotting鉴定NT5E的表达、纯化状况示意图；图中I表示经琼脂糖亲和介质(谷胱甘肽)(国家生化工程技术研究中心)分离纯化后的NT5E蛋白质样品(含GST标签)。2表示蛋白质分子量marker，从大到小分子量分别是130KD，95KD，72KD，55KD。图3是正常人、高危、胃癌患者血清中抗蛋白质NT5E的IgG抗体的浓度变化。
具体实施方式
本发明结合实施例和附图做进一步的说明。I.表达、纯化及鉴定NT5E 蛋白质NT5E是从前期研究中的经过基因工程改造过的酿酒酵母，利用半乳糖诱导过量表达，琼脂糖亲和介质(谷胱甘肽)分离纯化，并经过Western-Blotting鉴定,分别如图I和图2所示。为了更清楚的表达，图中采用了带有灰度的背景。2.血清样品的准备全血标本于室温放置2小时或4°C过夜后于IOOOg离心20分钟左右，取上清即可立即检测；或进行分装，并将标本放于_20°C或_80°C保存，但应避免反复冻融。解冻后的样品应再次离心，然后检测。所检测样品中不能含有NaN3,因为NaN3抑制辣根过氧化物酶的(HRP)活性。 3. ELISA法各种缓冲液及试剂的配制方法(I)包被缓冲液0. 05 M pH 9. 6 的 Na2CO3-NaHCO3
权利要求
1.蛋白质NT5E在制备诊断胃癌的试剂中的应用。
2.ー种制备诊断胃癌疾病的诊断试剂盒，其特征在于，该试剂盒采用现在临床广泛使用的ELISA技术，应用间接法定性检测人血清中抗蛋白质NT5E的IgG抗体；具体是用纯化的人蛋白质NT5E抗原通过包被缓冲液稀释后包被在酶标板上的微孔内制成固相抗原，加入封闭液；将标准品与待测血清样品用样品稀释液稀释后加入各自的抗原测定孔中，每孔加入含有辣根过氧化物酶(HRP)标记的anti-Human I gG抗体的酶标试剂,形成NT5E-抗体-酶标ニ抗复合物，经洗涤液彻底洗涤后加酶底物溶液显色，酶底物溶液反应时间到后加入酸性終止液；所述酶底物溶液在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最終的黄色，利用顔色的深浅来检测样品中抗蛋白质NT5E的IgG抗体的水平。
3.根据权利要求I所述的制备诊断胃癌疾病的诊断试剂盒，其特征在于，所述纯化的人蛋白质NT5E是从酿酒酵母中过量表达，亲和纯化而得到，浓度为25ii g/mL。
4.根据权利要求I所述的制备诊断胃癌疾病的诊断试剂盒，其特征在于，所述标准品包括O U/mL标准血清I和100 U/mL标准血清2，分别为正常人血清以及NT5E抗体为阳性的血清稀释于样品稀释液中。
5.根据权利要求I所述的制备诊断胃癌疾病的诊断试剂盒，其特征在于，所述酶底物溶液包括显色剂A :500 mL溶液中含醋酸钠13. 6 g，柠檬酸I. 6 g，30 %双氧水0.3 mL、显色剂 B :500 mL 溶液中含 TMB 350 mg, DMSO 20 mL，柠檬酸 H2O 5. I g。
6.根据权利要求I所述的制备诊断胃癌疾病的诊断试剂盒，其特征在于，所述包被缓冲液为0. 05 M pH 9. 6的碳酸盐缓冲液，即I升溶液中含I. 59 g Na2CO3, 2. 93 g NaHCO3o
7.根据权利要求I所述的制备诊断胃癌疾病的诊断试剂盒，其特征在于，所述封闭液为0. 5 % BSA的0. 01 mo I/L pH 7. 4磷酸盐-NaCl缓冲液(PBS)溶液，即I升溶液中含5g 牛血清白蛋白(BSA)，8 g NaCl, 0. 2 g KH2PO4, 2. 9 g Na2HPO4 12H20,0. 2 g KC1。
8.根据权利要求I所述的制备诊断胃癌疾病的诊断试剂盒，其特征在于，所述样品稀释液为0. 01mol/L pH 7. 4磷酸盐-NaCl缓冲液(PBS)。
9.根据权利要求I所述的制备诊断胃癌疾病的诊断试剂盒，其特征在于，所述洗涤液为 0. 01 mol/L pH 7. 4 磷酸盐-NaCl 缓冲液(PBST)，PBST 内含 0. 05 % Tween-20,即 I 升溶液中含 8 g NaCl, 0. 2 g KH2PO4, 2. 9 g Na2HPO4 12H20,0. 2 g KCl, 0. 5 mL Tween-20
10.根据权利要求I所述的制备诊断胃癌疾病的诊断试剂盒，其特征在于，所述终止液为 2 mol/L H2SO4 溶液。
11.根据权利要求2至10中任一所述的制备诊断胃癌疾病的诊断试剂盒，其特征在干，所述试剂盒中的试剂均可以加入防腐剤，以便于保存。
全文摘要
本发明提供一种蛋白质NT5E在制备诊断胃癌的试剂中的应用及诊断试剂盒，采用现在临床广泛使用的ELISA技术，应用间接法定性检测人血清中抗蛋白质NT5E的IgG抗体；用纯化的人蛋白质NT5E抗原包被微孔板，制成固相抗原，往包被抗原的微孔中依次加入待测血清，再加入含有辣根过氧化物酶(HRP)标记的anti-HumanIgG抗体的酶标试剂，形成NT5E-抗体-酶标二抗复合物，经过彻底洗涤后加酶底物溶液TMB显色。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色，用颜色的深浅检测样品中NT5E的IgG抗体的水平。本发明所提供的试剂盒，作为辅助胃癌早期诊断的一种手段，大大提高胃癌早期诊断的敏感性和特异性。
文档编号G01N33/543GK102798722SQ20121027196
公开日2012年11月28日 申请日期2012年8月1日 优先权日2012年5月14日
发明者杨丽娜, 陶生策, 刘炳亚, 王靖方, 郭书娟, 朱正纲, 李建芳, 燕敏 申请人:上海交通大学