专利名称：检测转基因作物的微流体蛋白质芯片及其试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及转基因成分检测和微流体蛋白质芯片的技术领域，具体涉及一种用于检测多种转基因成分的高通量微流体蛋白质芯片和相关试剂盒。
背景技术：
近十年来，转基因技术得到广泛发展。研究人员利用转基因技术培育出了抗除草齐U、抗干旱、耐盐碱、抗重金属和抗病虫害、营养价值高的品种，对提高粮食产量、减少收获后损失以及增加农产品营养价值具有重要作用。随着人们对转基因的不断研究、吸收、推广，转基因作物的多样性越趋丰富。多个国家和地区相继批准了转基因作物进入商业化生产，同时转基因作物的种植面积也大幅增加。转基因作物的发展为社会带来了巨大的经济效益。 然而，转基因技术同时也对人类的生活带来了一些潜在的威胁，如某些基因导入宿主之后会使食品产生毒性，转基因食物产生过敏原，使人产生抗药性，食品的营养价值发生改变等。人们对转基因的态度褒贬不一。因此，在进行转基因食品研究开发和商业化的同时，为了对转基因食品的安全性给予综合评估，使消费者能够快速区分转基因食品与天然食品，建立合适的方法对转基因食品中转基因成分进行鉴定与检测，能够促进农业转基因生物安全管理，保障人和动物以及微生物的安全，同时能够保护生态环境，促进农业转基因生物技术的进一步研究。为了保护消费者自由选择食品的权益，全球有40多个国家设定了转基因含量的上限，在欧盟，其标准为O. 9%，韩国为3%，德国为O. 5%，日本为5%。转入基因表达蛋白质是转基因监测的重要对象，其不但作为转基因测定的主要标志物，而且能够反映转基因物种的功能特性，因此对转基因蛋白的检测对转基因安全控制具有重要的意义。转基因蛋白质检测目前常用的方法是酶联免疫吸附法(ELISA)，但是这种方法具有低通量的局限性，不能对多种蛋白进行同时检测。随着转基因技术的发展及技术应用的扩散，含多种转基因成分的品种逐渐增多，并且在转基因产品的流通过程中逐渐出现“未知”样本，即来源于田间污染或违规种植。例如我国多省市场上发现了未允许商业化的转基因作物产品，在我国出口欧洲的产品中也被检出了转基因成分。不能被及时检测和发现的未知转基因产品的存在极大地损害了贸易信誉，并对人们的健康安全带来威胁。因此，对转基因蛋白的高通量检测方法，即实现在同一次试验中检出并判断所有“潜伏”的转基因蛋白成分，对中国的农作物贸易和人类的健康安全具有重要的意义。微流体蛋白质芯片是一项国内外先进的生物芯片技术，其采用特殊的流体构造，使生物芯片中的反应能够在液态环境中进行。微流体芯片系统一般包括泵、封闭的反应腔、流路等，负责微量流体的传感、输送、检测和控制，并结合扫描仪等成像系统对反应结果进行定量、全面的分析。微流体式相较点样式芯片具有众多的优点，如具有稳定、不易污染、检测样品用量小、微型、自动化等特性
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种检测转基因作物的微流体蛋白质芯片及其试剂盒。为了解决上述技术问题，本发明提供一种高通量检测转基因蛋白的微流体蛋白质芯片，包括基于μ Paraflo 微流体生物芯片合成的含六种核酸序列的核酸芯片以及6种抗体-寡核苷酸复合物探针，从而实现对转苏云金芽泡杆菌Bt杀虫晶体蛋白(CrylAc)、转苏云金芽泡杆菌Bt杀虫晶体蛋白(Cry I c )、转苏云金芽泡杆菌Bt杀虫晶体蛋白(Cry IF )、转苏云金芽泡杆菌Bt杀虫晶体蛋白(CrylAb)、大豆胰蛋白酶(SBTI)和新霉素磷酸基转移酶II基因(NPT II)这6种转基因蛋白的同时检测。作为本发明的高通量检测转基因蛋白的微流体蛋白质芯片的改进六种核酸序列为A:3’ CAC ACG CCT TTA CGA AGA CGA T 5， B:3’ CAG GTC AAA AGG GTC CTT AGG GA 5’C :3’ TAG TGT GTT TCC GTT GAA AAC A 5’D :3’ TAG TTG TCT GTA ATT AAC CCG CG 5’E:3’ AAA CCG TTA CCA TCT TGA GTG TGG C 5’F :3’ TTA ACG TGC CAT AGG TAG ACA T 5’ ；6种抗体-寡核苷酸复合物探针中的核酸序列和相应的检测抗体为a 5’ GTG TGC GGA AAT GCT TCT GCT A 3’，抗 CrylAc 兔单抗；b :5’ GTC CAG TTT TCC CAG GAA TCC CT 3，，抗 Crylc 兔多抗；c 5’ ATC ACA CAA AGG CAA CTT TTG T 3’，抗 CrylAb 兔单抗；d :5’ ATC AAC AGA CAT TAA TTG GGC GC 3，，抗 CrylF 兔多抗；e 5’ TTT GGC AAT GGT AGA ACT CAC ACC G 3’，抗 SBTI 兔多抗；f 5’ AAT TGC ACG GTA TCC ATC TGT A 3’，抗 NPT II 兔单抗。作为本发明的高通量检测转基因蛋白的微流体蛋白质芯片的进一步改进抗体-寡核苷酸复合物探针，其合成方法是按照SoluLink 交联试剂盒对相应抗体和寡核苷酸链进行交联。作为本发明的高通量检测转基因蛋白的微流体蛋白质芯片的进一步改进按照SoluLink 交联试剂盒对相应抗体和寡核苷酸链进行交联所得的复合物具备以下特征1)核酸的3’端与抗体上赖氨酸的自由氨基端相连；2)平均每个抗体上连有2-4条寡核苷酸；3)抗体具有良好的活性。本发明还同时提供了一种转基因检测试剂盒，包括以下成分①、含6种探针的μ Paraf Ιο 微流体DNA芯片(B卩，基于μ Paraf Ιο 微流体生物芯片合成的含六种核酸序列的核酸芯片)；②、6种抗体-寡核苷酸复合物探针；③、6种检测抗体；④、封闭缓冲液；⑤、洗涤缓冲液；⑥、反应缓冲液；所述成分①②④⑤用来即时生成如上所述的高通量检测转基因蛋白的微流体蛋白质芯片。作为本发明的转基因检测试剂盒的改进成分③的6种检测抗体为生物素标记抗CrylAc兔多抗、生物素标记抗Crylc兔单抗、抗CrylAb鼠抗、抗CrylF鼠抗、抗SBTI鼠抗和抗NPT II鼠抗。作为本发明的转基因检测试剂盒的进一步改进封闭缓冲液的制备方法为①准备6 X SSPE缓冲液，调节pH为6. 8 ;②取75mL上述①所得的调节pH后的6X SSPE缓冲液和25mL甲酰胺混合；
③准备BSA溶液称取O. 2mg的BSA粉末溶于ImL蒸馏水中；④制备100 μ L封闭缓冲液取5 μ L步骤③所得的BSA溶液加入95 μ L步骤②所得的溶液，混合；⑤常规灭菌；洗涤缓冲液的制备方法为将封闭缓冲液和水按照1:1的体积比混合，得混合液，在每500ml的混合液中加入Img的SDS均匀混合；常规灭菌；反应缓冲液的制备方法为每475 μ L的PBS缓冲液(ΡΗ=7. 4)中加入25 μ L的质量浓度为20%的BSA溶液；常规灭菌。本发明还同时提供了上述转基因检测试剂盒的使用方法，包括如下步骤I)、即时生成微流体蛋白质芯片；2)、在生成的蛋白质芯片(即微流体蛋白质芯片)上进行样品检测，具体步骤如下将转基因检测样品(转基因作物)经蛋白提取和纯化后得到样品检测液；将50 μ L样品检测液接入微流体系，将流速设置为20μ L/min,在4°C条件下过夜孵育；反应结束后，用PBST缓冲液在30°C下洗涤芯片20min，洗去芯片表面未结合的样品；3)、检测固定抗原 涉及6种检测抗体；涉及2种显色物质包括①Cy3标记链霉亲和素■级Cy3标记的羊抗鼠抗体；准备检测溶液取500 μ L反应缓冲液，将6种检测抗体分别以5000-50000倍稀释混合到反应缓冲液中，将2种显色物质均以1000倍稀释至反应缓冲液中；4)、将上述检测溶液接入循环系统，室温下反应2小时，室温下用PBST缓冲液对芯片洗涤20min，从而洗去多余的检测抗体和显色物质；5)扫描取出芯片，用芯片扫描仪GenepiXTM4000B对芯片结果进行提取，扫描参数选择PMT500，焦距190 ;观察芯片各位点上的信号。作为本发明的转基因检测试剂盒的使用方法的改进步骤I)包括以下步骤I、芯片循环系统的清洗；II、芯片表面的封闭将作为成分①的含6种探针的μ Paraflo 微流体DNA芯片置入微流体杂交室中进行芯片表面的封闭； III、探针在心片表面的固定将作为成分②的6种抗体-核酸复合物探针以各50nM浓度混合稀释在封闭缓冲液中，连接入芯片的循环系统，30°C下以流速20 μ L/分钟循环孵育2h ;探针固定反应完成后，将洗涤缓冲液移入样品管中，30°C下以20μ L/分钟循环洗涤芯片表面20分钟，将芯片表面多余未结合的抗体探针洗去。本发明的第一个目的是提供一种可即时生成的转基因微流体蛋白质芯片，该芯片具有特异性强、灵敏度高、通量高、试剂用量少、操作方便的特点。本发明的另一个目的是开发与该芯片检测技术相关的试剂盒，提供准确、有效、便于结果判定的检测转基因样品的方法。本发明中使用的微流体系统是基于μ Paraflo 芯片系统(LC SCIENCES，美国)，创新点是在于芯片部分。本发明的微流体蛋白质芯片，芯片的构成通过将6种抗体-寡核苷酸复合物探针在微流体核酸芯片表面反应，借助核酸的杂交将抗体固定到核酸芯片的表面。在检测需要前即时合成，以保证抗体探针的活性和检测的高灵敏度。每种探针合成6个重复位点，以保 证检测结果的可靠性。芯片上需要的试剂和反应样品的体积只需20-50 μ L。本发明的优点是(I)提供一种高通量(可同时检测6种转基因物质)的蛋白质芯片检测技术。(2)采用即时合成蛋白质芯片的方法，避免了蛋白质芯片在长期储存过程中探针活性下降，保证了芯片的高灵敏度。在试剂盒基础上，芯片合成过程只需2小时，且无需任何繁琐的步骤。(3)芯片中包含6个重复，使检测结果更可靠。(4)芯片的合成只需要50-100μ 的50ηΜ抗体-寡核苷酸复合物探针，试剂耗量小。(5)反应只需20-50 μ L样品检测液。(6)结合微流体装置，操作方便，节省了检测劳动量。
下面结合附图对本发明的具体实施方式
作进一步详细说明。图I是微流体蛋白质芯片用于单一转基因物质的检测结果；左图为CrylAc转基因叶片检测结果，右图为非转基因叶片检测结果。图2是微流体蛋白质芯片用于六种转基因物质的检测结果。
具体实施例方式备注说明以下所用到的各种缓冲液均需要进行常规灭菌。实施例I、一种高通量检测转基因蛋白的微流体蛋白质芯片的制备方法，依次进行以下步骤第一步基于μ Paraflo 微流体生物芯片原位合成六种不同序列的单链寡核苷酸，该核酸的3’端与芯片底部相连。对每种探针(即单链寡核苷酸)位置分别作A-F编号，每种探针重复6个位点，对每个位点编号，例如A种探针计为A1，A2，"4546,其他种类探针类同。故，芯片上一共有36个探针位点。每种探针的序列及编号如下表I :表I、探针的序列及编号
权利要求
1.高通量检测转基因蛋白的微流体蛋白质芯片，其特征是包括基于UParafIotm微流体生物芯片合成的含六种核酸序列的核酸芯片以及6种抗体-寡核苷酸复合物探针，从而实现对转苏云金芽泡杆菌Bt杀虫晶体蛋白(CrylAc)、转苏云金芽泡杆菌Bt杀虫晶体蛋白(Crylc)、转苏云金芽泡杆菌Bt杀虫晶体蛋白(CrylF)、转苏云金芽泡杆菌Bt杀虫晶体蛋白(CrylAb)、大豆胰蛋白酶(SBTI)和新霉素磷酸基转移酶II基因(NPT II)这6种转基因蛋白的同时检测。
2.根据权利要求I所述的高通量检测转基因蛋白的微流体蛋白质芯片，其特征是 所述六种核酸序列为A:3’ CAC ACG CCT TTA CGA AGA CGA T 5，B :3’ CAG GTC AAA AGG GTC CTT AGG GA 5’C:3’ TAG TGT GTT TCC GTT GAA AAC A 5’D :3’ TAG TTG TCT GTA ATT AAC CCG CG 5’E :3’ AAA CCG TTA CCA TCT TGA GTG TGG C 5’F :3’ TTA ACG TGC CAT AGG TAG ACA T 5’ ； 所述6种抗体-寡核苷酸复合物探针中的核酸序列和相应的检测抗体为 a 5’ GTG TGC GGA AAT GCT TCT GCT A 3’，抗 CrylAc 兔单抗； b :5’ GTC CAG TTT TCC CAG GAA TCC CT 3’，抗 Crylc 兔多抗； c 5’ ATC ACA CAA AGG CAA CTT TTG T 3’，抗 CrylAb 兔单抗； d :5’ ATC AAC AGA CAT TAA TTG GGC GC 3’，抗 CrylF 兔多抗； e 5’ TTT GGC AAT GGT AGA ACT CAC ACC G 3’，抗 SBTI 兔多抗； f 5’ AAT TGC ACG GTA TCC ATC TGT A 3’，抗 NPT II 兔单抗。
3.根据权利要求2所述的高通量检测转基因蛋白的微流体蛋白质芯片，其特征是 所述抗体-寡核苷酸复合物探针，其合成方法是按照SoluLink 交联试剂盒对相应抗体和寡核苷酸链进行交联。
4.根据权利要求3所述的高通量检测转基因蛋白的微流体蛋白质芯片，其特征是所述按照SoluLink 交联试剂盒对相应抗体和寡核苷酸链进行交联所得的复合物具备以下特征1)核酸的3’端与抗体上赖氨酸的自由氨基端相连；2)平均每个抗体上连有2-4条寡核苷酸；3)抗体具有良好的活性。
5.ー种转基因检测试剂盒，其特征是包括以下成分 ①、含6种探针的yParaf Iotm微流体DNA芯片； ②、6种抗体-寡核苷酸复合物探针； ③、6种检测抗体； ④、封闭缓冲液； ⑤、洗涤缓冲液； ⑥、反应缓冲液； 所述成分①②④⑤用来即时生成如权利要求1、2、3或4所述的高通量检测转基因蛋白的微流体蛋白质芯片。
6.根据权利要求5所述的转基因检测试剂盒，其特征是 所述成分③的6种检测抗体为生物素标记抗CrylAc兔多抗、生物素标记抗Crylc兔单抗、抗CrylAb鼠抗、抗CrylF鼠抗、抗SBTI鼠抗和抗NPT II鼠抗。
7.根据权利要求6所述的转基因检测试剂盒，其特征是 封闭缓冲液的制备方法为 ①准备6X SSPE缓冲液，调节pH为6. 8 ; ②取75mL上述①所得的调节pH后的6X SSPE缓冲液和25mL甲酰胺混合； ③准备BSA溶液称取0.2mg的BSA粉末溶于ImL蒸馏水中； ④制备100u L封闭缓冲液取5 ii L步骤③所得的BSA溶液加入95 y L步骤②所得的溶液，混合； ⑤常规灭菌； 洗涤缓冲液的制备方法为将封闭缓冲液和水按照1:1的体积比混合，得混合液，在每500ml的混合液中加入Img的SDS均勻混合；常规灭菌； 反应缓冲液的制备方法为每475 ii L的PBS缓冲液(PH=7. 4)中加入25 y L的质量浓度为20%的BSA溶液；常规灭菌。
8.如权利要求5 7任ー转基因检测试剂盒的使用方法，其特征是包括如下步骤 1)、即时生成微流体蛋白质芯片； 2)、在生成的蛋白质芯片上进行样品检测，具体步骤如下 将转基因检测样品经蛋白提取和纯化后得到样品检测液；将50 u L样品检测液接入微流体系，将流速设置为20ii L/min，在4°C条件下过夜孵育；反应结束后，用PBST缓冲液在30°C下洗漆芯片20min,洗去芯片表面未结合的样品； 3)、检测固定抗原 涉及6种检测抗体； 涉及2种显色物质包括①Cy3标记链霉亲和素 级Cy3标记的羊抗鼠抗体； 准备检测溶液取500 u L反应缓冲液，将6种检测抗体分别以5000-50000倍稀释混合到反应缓冲液中，将2种显色物质均以1000倍稀释至反应缓冲液中； 4)、将上述检测溶液接入循环系统，室温下反应2小吋，室温下用PBST缓冲液对芯片洗涤20min，从而洗去多余的检测抗体和显色物质； 5)扫描取出芯片，用芯片扫描仪Gen印iXTM4000B对芯片结果进行提取，扫描參数选择PMT500，焦距190 ;观察芯片各位点上的信号。
9.根据权利要求8的转基因检测试剂盒的使用方法，其特征是 所述步骤I)包括以下步骤 I、芯片循环系统的清洗； II、芯片表面的封闭 将作为成分①的含6种探针的y Paraflo 微流体DNA芯片置入微流体杂交室中进行芯片表面的封闭； III、探针在芯片表面的固定 将作为成分②的6种抗体-核酸复合物探针以各50nM浓度混合稀释在封闭缓冲液中，连接入芯片的循环系统，30°C下以流速20 y L/分钟循环孵育2h ;探针固定反应完成后，将洗涤缓冲液移入样品管中，30°C下以20 y L/分钟循环洗涤芯片表面20分钟，将芯片表面多余未结合的抗体探针洗去。
全文摘要
本发明公开了一种高通量检测转基因蛋白的微流体蛋白质芯片，包括基于μParafloTM微流体生物芯片合成的含六种核酸序列的核酸芯片以及6种抗体-寡核苷酸复合物探针，从而实现对转苏云金芽泡杆菌Bt杀虫晶体蛋白(Cry1Ac)、转苏云金芽泡杆菌Bt杀虫晶体蛋白(Cry1c)、转苏云金芽泡杆菌Bt杀虫晶体蛋白(Cry1F)、转苏云金芽泡杆菌Bt杀虫晶体蛋白(Cry1Ab)、大豆胰蛋白酶(SBTI)和新霉素磷酸基转移酶Ⅱ基因(NPTⅡ)这6种转基因蛋白的同时检测。本发明还同时提供了一种转基因检测试剂盒，包括含6种探针的μParafloTM微流体DNA芯片、6种抗体-寡核苷酸复合物探针和6种检测抗体等。
文档编号G01N33/573GK102759628SQ20121023284
公开日2012年10月31日 申请日期2012年7月5日 优先权日2012年7月5日
发明者周小川, 殷赟, 沙莎, 郑晓冬, 高晓莲 申请人:浙江大学