专利名称：白菜育性相关基因及用于构建白菜类作物的人工雄性不育系的方法
技术领域：
本发明涉及一种白菜育性相关基因及用该基因构建白菜类作物的人工雄性不育系的方法。
背景技术：
杂种优势的利用在以提高作物的产量与品质，增强品种的抗病性与抗逆性等为目标的作物育种中具有重要意义。目前作物生产上利用杂种优势配制和生产杂种一代的方法主要有人工去雄、化学杀雄、利用自交不亲和系以及雄性不育系。然而，人工去雄的方法耗时耗力，制种成本高；化学去雄为杂交制种提供了一种新方法，但存在去雄效果不好，抑制植物生长，污染环境等缺点；作物自交不亲和性易受环境的影响而不稳定，用其制种存在杂种不纯，亲本繁种困难等不利因素；利用植物雄性不育系是杂交制种的一条比较好的途径，但优良的不育源在自然界非常缺乏，且雄性不育、保持系及其恢复系的选育也存在很大的困难。
发明内容
本发明的目的在于提供一种白菜育性相关基因及用该基因构建白菜类作物的人工雄性不育系的方法。
本发明提供的白菜育性相关基因具有SEQ ID No.1的序列。该基因长1667bp，含有起始密码子和完整的3’端序列，具有一个完整的长1578bp的开放阅读框；经GenBank BLAST查询表明，该基因与位于拟南芥第一条染色体上的编码细胞色素P450基因CYP86C4核苷酸序列有85.3％的同源性，氨基酸同源率为84.9％；Northern验证显示，该基因在白菜两用系不育株的表达受到了明显地抑制，并且该基因在花蕾中特异表达，而在叶片和茎中不表达。
本发明用白菜育性相关基因构建白菜类作物的人工雄性不育系的方法，包括以下步骤(1)根据育性相关基因的全长序列，在育性相关基因的内部第901个碱基至第1338个碱基之间设计引物，扩增438bp序列作为反义基因片段；(2)根据植物双元载体pBI121的多克隆酶切位点，分别设计两条含有BamHI和Xba I限制性内切酶位点以及三个保护碱基的PCR扩增引物，其序列为P15’-GCT GGA TCC ACC ATT AGG TTT TTT AGA CA-3’；P2 5’-GAT TCT AGA GCCACT AAC AAA CTT CCC TG-3’，回收PCR产物，并连接在T载体上，转化大肠杆菌，阳性克隆经PCR和限制性内切酶酶切鉴定后，提取质粒备用；(3)将阳性克隆质粒进行BamH I和Xba I双酶切，酶切片段电泳分离后回收，取该回收片段和经BamH I和Xba I双酶切的pBI121载体用T4连接酶连接，连接产物转化大肠杆菌，阳性克隆经PCR和限制性内切酶酶切鉴定，阳性克隆质粒命名为pBI35S-AMF；(4)按常规方法进行三亲杂交，将步骤3)构建的pBI35S-AMF质粒引入含Ti质粒的农杆菌中；(5)将上述三亲杂交的克隆转化白菜蔬菜作物的外植体，用组织培养的方法从转化的外植体中再生出植株，并通过PCR和Southern杂交等分子检测手段对育性相关基因反义片段是否整合在受体植物染色体中进行验证；(6)在转基因植株中观察其花粉的育性，并进行花粉萌发试验和剥蕾授粉试验，即可获得雄性不育植株。
上述的扩增的438bp反义基因片段来自育性相关基因，该反义基因片段具有SEQ ID No.2的序列；所说的农杆菌菌株可以采用LBA4404或EHA105；所说的外植体可以是带柄子叶；步骤6)中使用的花粉萌发试验液体培养基为15％蔗糖+0.01％硼酸+1mg/L GA3。
本发明利用植物基因工程的方法能快速构建各种白菜类蔬菜作物的雄性不育系，克服了从自然界寻找不育源所受的限制，同时也为植物基因工程技术在农业生产中的广泛应用开辟了一条新的途径。
图1是植物表达载体pBI121的图谱；图2是反义育性相关基因植物表达载体pBI35S-AMF的构建示意图具体实施方式
以构建‘上海青’普通白菜和‘油青’菜心为例。
育性相关基因反义片段的获得根据白菜育性相关基因的全长序列(SEQ ID No.1)，在该基因的内部第901个碱基至第1338个碱基之间设计引物，扩增438bp序列作为反义基因片段(SEQID No.2)。并根据植物双元载体pBI121的多克隆酶切位点(图1)，分别设计两条含有BamH I和Xba I限制性内切酶位点以及三个保护碱基的PCR扩增引物，其序列为P1 5’-GCT GGA TCC ACC ATT AGG TTT TTT AGA CA-3’；P2 5’-GATTCT AGA GCC ACT AAC AAA CTT CCC TG-3’。PCR扩增条件为94℃，预变性3min；94℃，变性1min；50℃，退火45s；72℃，延长45s；72℃，延长10min；4℃保存；35个循环。
PCR产物在1.2％的琼脂糖凝胶中电泳分离后，切下含目的片段的胶块，采用UNIQ-10柱式DNA胶回收试剂盒进行回收。取100ng-150ng回收产物与50ngpGEM-T Easy Vector(购自美国Promega公司)在T4连接酶作用下连接。连接产物转化大肠杆菌DH5α菌株感受态细胞，在LB/Amp/IPTG/X-gal平板上筛选重组子。挑选4~6个白色菌落，经LB液体培养后，碱裂解法抽提质粒DNA，分别经PCR和限制性内切酶酶切鉴定，提取质粒备用。
pBI35S-AMF表达载体的构建(1)双酶切pBI121载体制备pBI121用BanH I和Xba I双酶切，酶切产物用氯仿/异戊醇(24∶1)溶液抽提一次，乙醇沉淀，离心后用70％的乙醇清洗一次，空气干燥后溶解于适量的dd H2O中备用。
(2)反义育性相关基因片段的制备将上述提取的质粒进行BanH I和XbaI双酶切，酶切产物在1.5％的琼脂糖凝胶中电泳分离后，切下含目的片段的胶块，采用UNIQ-10柱式DNA胶回收试剂盒进行回收。
(3)表达质粒的构建过程取上述制备好的的反义育性相关基因片段和经BamH I和Xba I双酶切的pBI121以摩尔比1∶1混合，用T4连接酶连接。连接条件按照T4连接酶的说明书进行，4℃下反应过夜。连接产物转化DH5α感受态细胞；经转化的细菌涂于含Kan 50mg/L的固体LB培养基平板上，37℃培养过夜。用牙签挑取菌落，在5mL含Kan50mg/L的液体LB培养基中振荡培养过夜，碱裂解法少量抽提其质粒DNA，采用PCR和限制性内切酶酶切等方法鉴定阳性克隆。阳性克隆质粒命名为pBI35S-AMF(见图2)。
三亲杂交将pBI35S-AMF导入农杆菌从超低温冰箱中取出LBA4404或EHA105菌株，划于空白的固体LB培养基平板上，28℃培养过夜，以活化处于休眠状态的菌株；挑取LBA4404或EHA105单菌落划于含Rif和Str各50mg/L的固体LB培养基平板上，28℃培养过夜；挑取单菌落接种于含Rif和Str各50mg/L的液体LB培养基中，28℃振荡培养。
从超低温冰箱中取出含帮助质粒pRK2013的HB101大肠杆菌菌株，划于空白的固体LB培养基平板上，37℃培养过夜，以活化处于休眠状态的菌株；挑取单菌落划于含Kan50mg/L的固体LB培养基平板上，37℃培养过夜；挑取单菌落接种于含Kan50mg/L的液体LB培养基中，37℃振荡培养。将含目的质粒pBI35S-AMF的DH5α单菌落接种于含Kan50mg/L的液体LB培养基中，37℃振荡培养。
等上述三个菌株培养至对数生长期(OD值约为0.6)，分别取0.5mL等体积混合于1.5mL离心管中，4℃下3500rpm离心10min，去上清，100μL液体LB悬浮沉淀的细菌，涂于固体LB平板上，28℃过夜，用少量的液体LB洗下菌落，经适当的倍比稀释后，涂于含75mg/L Rif、100mg/L Str和100mg/L Kan的LB平板上，28℃培养48h，挑取单菌落接种在含有上述三种同样抗生素同样浓度的液体LB中，进行振荡培养。取1.5mL转化的农杆菌培养液，碱裂解法少量制备农杆菌中的质粒，随后用所提取的质粒转化DH5α感受态细胞，在含有Kan50mg/L的LB固体培养基平板上培养筛选，挑取单菌落接种于含有Kan50mg/L的LB液体培养基中振荡培养过夜，再抽提质粒，进行PCR和限制性酶酶切鉴定。
通过组织培养获得人工雄性不育植株(1)培养基组织培养的培养基可以采用其他的激素配比的培养基，本试验采用以下配比的培养基。
基本培养基1/2倍浓度NH4+的MS培养基的盐类及维生素+2％蔗糖+0.8％琼脂+60mL/L椰子汁+2mg/L BAP+0.45mg/L NAA+7.5mg/L AgNO3(pH值5.8)；预培养培养基 同基本培养基；共培养培养基基本培养基+10mg/L Kan(pH值5.8，并在培养基表面铺一张比培养皿口径略大的灭菌滤纸)；分化培养基基本培养基+10mg/L Kan+300mg/L Amp(pH值5.8)；生根培养基1/2MS培养基的盐类及维生素+0.8％琼脂+10mg/L Kan(pH值5.8)。
(2)遗传转化的具体操作将带柄子叶外植体在预培养基上预培养3d后，用LBA4404/pBI35S-AM感染10～15min，在灭菌滤纸上吸干菌液，置于共培养培养基上培养2d，随后把外植体转入含10mg/L Kan的选择分化培养基上诱导不定芽，3个星期转瓶一次，当抗性幼苗长至2～3cm时，从愈伤组织处切下幼苗在生根培养基上诱导不定根，20d左右后等不定根长成即可开瓶炼苗，继而移栽至营养土中，正常管理至开花结果。
转基因植株的分子检测及其育性观察(1)转基因植株的PCR检测参照GUS基因内部371bp的uidA片段两端序列设计PCR引物(Ying et al.，1999)，引物的序列为P5 5’-ACG TCC TGTAGA AAC CCC AAC C-3’，P6 5’-TCC CGG CAA TAA CAT ACG GCG T-3’。在25μL的反应体系中，含有1×的Pfu Buffer(10mM Tris-HCl(pH8.8，25℃)，50mM KCl，0.08％Nonidet P40，1.5mM MgCl2和0.001％BSA)，0.2μM的dNTPs，0.2μM的引物(每条)，1u的Taq酶。PCR扩增条件为95℃，预变性3min；95℃，变性30s；59℃，退火1min；72℃，延长45s；35个循环；72℃，延长10min；4℃保存。循环反应于PE公司和Biometra公司生产的热循环仪上进行。PCR扩增结束后，分别吸取10μL PCR反应产物点样于1.2％的琼脂糖凝胶(Gene Co.产品)进行电泳。拍照。
(2)转基因植株的Southern杂交检测 以pBI35S-AMF质粒为模板，按照PCR检测的反应体系扩增得到GUS基因的uidA片段，琼脂糖凝胶电泳后回收，作标记探针的模板用。探针标记的操作如下在1.5mL离心管中加入5μL回收的uidA片段DNA作为模板(10ng～1μg)，随机引物2μL(浓度为1nmol/μL)和9μL灭菌的双蒸水，混匀，95℃变性3min，迅速置于冰上5min；依次加入10×Buffer，dNTPs(缺dATP)各2.5μL，[α-32P]dATP 3μL；加入1μL Exo-free K1enow酶，37℃反应15～20min，65℃加热5min使Klenow酶失活(或加Na2EDTA30mM)；95℃变性3min后迅速放到冰上。小心将探针反应液加入经过预杂交的杂交管中杂交过夜。
经PCR检测为阳性的植株进一步作Southern印迹杂交检测。设非转化植株为阴性对照，用Hind III和BamH I酶切。利用毛细管法进行DNA的转移，具体操作参照Sambrook J.et al.(1989)的方法。
(3)转基因不育植株花粉萌发试验取经分子检测为阳性的转基因植株及其对照株的花粉进行花粉萌发试验，并统计分析数据。以萌发率作为衡量花粉生活力强弱的指标。花粉的培养采用液体培养基为15％蔗糖+0.01％硼酸+1mg/L GA3。采集花朵的时间均为上午900左右，每株采10朵花药刚裂开的花朵，采后先将花粉抖落到硫酸纸上，充分混匀，将其点涂在载玻片上的培养基中，不加盖玻片，将载玻片置于铺有湿润滤纸的培养皿中，置于黑暗、恒温条件下培养，白菜花粉的培养温度为20℃～25℃，培养4h后在倒置显微镜下观察萌发率，以花粉管长度超过花粉粒直径1/2为萌发花粉，每株制作2张玻片，每张玻片观察15个不同的视野。
(4)转基因不育植株的Northern杂交检测取Southern印迹杂交检测为阳性的不育植株，进一步作Northern印迹杂交检测。设非转化植株为阴性对照。利用毛细管法进行RNA的转移，具体操作参照Sambrook J.等(1989)的方法。
探针制备的操作同(2)。其中，用育性相关基因的反义片段为模板进行探针的标记。
按照上述的操作步骤，即可以获得‘上海青’普通白菜和‘油青’菜心的人工雄性不育系。SEQ ID No.1的信息(i)序列特征(A)长度1667bp(B)类型核酸(C)链型单链拓扑结构线性(ii)分子型cDNA(xi)序列描述SEQ ID No.1(xii)ATGCCTTTAA CAGAGTGAAT TTATAATCAT CTTTCTCTCT TCGATCTATC TCTTGCGTTG TTAGGTCTGTTTGTTTTTTG TTGTTTGCGT GAGAAGTTAA CCAATAAGCA CGGGCCAATG CTGTGGCCAG TGTTCGGCATTACCCTAGAG TTTTTCATTC ATAAAAATGA TGTCTATGCA TGGGTCACAA AGTCTTTAAA AAAATCCCGAAACACGTTTC TTTACCGCGG GTTCTGGCTT GATGGATCTC ATGGAGCCGT GACTTGTTCT CCTGCCAATGTTGAGTACAT GCTCAAGACC AACTTCAAGA ACTTCCCCAA AGGTACCTTC TTCAAAGACC GGTTCAAAGATCTCCTCGAG GAGGGTATCT TTAACGCTGA TGATGAGTCC TGGAAAGAGC AACGACGGGT CATCATAACCAAATGCATTC GAACTCGGTT CATGGAGCAT TCCTTTCAAA CAACACAACG TTTAGTAAGG AAGAAGCTGTTGAAGGTTAT GGAGAGTTTC GCTAGGTCAC AAGAAGCTTT TGATCTCCAA GACGTGCTCT TGCGCTTGACGTTTGACATC ATATGCATCG CGGGTCTTGG AGATGACCCG GAGACTCCAG CTCAAGATCT TCCTCAAGTTCCATTTGCTA AAGCTTTTGA TGAAGCAACG GAGTCTACGT TGTTTAGGTT CATGATCCCT CCATTTATATGGAAACCAAT GAGGTTCTTA GACATAGGGT ATGAGAAAGG TCTAAGAAAA GCTATTGACG TCGTGCATGGATTCGTGAAT AGATGATTAT GGATCGTATC TGCATGGTCA ATGATGATGA GACGTTAGAT AATAGATCTGATCCTTACAA GAATTATTCA GATAGAGAGT CATAAAAAAG GTAACGAGAT TGGTCCTTCA ACCATTAGGTTTTTTAGACA GTTTTGCACA AGTTTCATCT TAGCGGGACG TGACACAAGT TCTGTTGCAA TTTCATGGTTCTTCTGGGTG ATACAAAGAC ACCCACAAGT TGAAAACAAA ATCATCCAGG AGATCAGAGA AATCTTGAAACAGAGAGGAG ATCCTTCAGA CAGTAGTCTC TTCACGGTCA GAGAACTAAA CAACATGGTG TATCTACAAGCAGCAATTTC AGAAACTCTA AGACTTTACC CACCAATCCC TATGGAGATG AAACAAGCCA TTGAAGATGATATGTTTCCA GATGGGACAT TTATAAAAAA GGGTTCAAGG GTTTACTTCT CTATCTATGC CATGGGAAGGATGGAATCAG TATGGGGTAA AGACTGTGAA GACTTCGGAC CAGAGAGATG GATCCATGCA GGGAAGTTTGTTAGTGGCGA CCAATCCAAA TATGTTGTGT TCAATGCTGG GCCTAGGCTG TGTCTAGGGA AAACATTTGCTTACTTACAA ATGAAGATGA TAGCTGCTTC AGTCTTGTTA GGTATTCAAT CAAGGTTGCT CAAGATCATGTGGTTGTCCC GAGAGTTACT ACTAACTTGT AACATGAAGT ACGGTCTCAA GGTGACCATC ACGCCAAGGTCGCTGGAAGA GAAGATACTA GAGTCATTCC ACATGTAGAA AGCATTTTAA TTAGAATACA ATACTTTCTAGAGTTACTTA GTTTTTATGA TTAATACTAA ACCCACAATT TAAGCAAAA AAAAAAAASEQ ID No.2的信息(i)序列特征(D)长度438bp(E)类型核酸(F)链型单链拓扑结构线性(ii)分子型cDNA(xi)序列描述SEQ ID No.2(xii)ACCATTAGGT TTTTTAGACA GTTTTGCACA AGTTTCATCT TAGCGGGACG TGACACAAGT TCTGTTGCAATTTCATGGTT CTTCTGGGTG ATACAAAGAC ACCCACAAGT TGAAAACAAA ATCATCCAGG AGATCAGAGAAATCTTGAAA CAGAGAGGAG ATCCTTCAGA CAGTAGTCTC TTCACGGTCA GAGAACTAAA CAACATGGTGTATCTACAAG CAGCAATTTC AGAAACTCTA AGACTTTACC CACCAATCCC TATGGAGATG AAACAAGCCATTGAAGATGA TATGTTTCCA GATGGGACAT TTATAAAAAA GGGTTCAAGG GTTTACTTCT CTATCTATGCCATGGGAAGG ATGGAATCAG TATGGGGTAA AGACTGTGAA GACTTCGGAC CAGAGAGATG GATCCATGCAGGGAAGTTTG TTAGTGGC
权利要求
1.一种白菜育性相关基因，其特征在于该基因具有SEQ ID No.1的序列。
2.用白菜育性相关基因构建白菜类作物的人工雄性不育系的方法，包括以下步骤(1)根据育性相关基因的全长序列，在育性相关基因的内部第901个碱基至第1338个碱基之间设计引物，扩增438bp序列作为反义基因片段；(2)根据植物双元载体pBI121的多克隆酶切位点，分别设计两条含有BamHI和Xba I限制性内切酶位点以及三个保护碱基的PCR扩增引物，其序列为P15’-GCT GGA TCC ACC ATT AGG TTT TTT AGA CA-3’；P2 5’-GAT TCT AGA GCCACT AAC AAA CTT CCC TG-3’，回收PCR产物，并连接在T载体上，转化大肠杆菌，阳性克隆经PCR和限制性内切酶酶切鉴定后，提取质粒备用；(3)将阳性克隆质粒进行BamH I和Xba I双酶切，酶切片段电泳分离后回收，取该回收片段和经BamH I和Xba I双酶切的pBI121载体用T4连接酶连接，连接产物转化大肠杆菌，阳性克隆经PCR和限制性内切酶酶切鉴定，阳性克隆质粒命名为pBI35S-AMF；(4)按常规方法进行三亲杂交，将步骤3)构建的pBI35S-AMF质粒引入含Ti质粒的农杆菌中；(5)将上述三亲杂交的克隆转化白菜蔬菜作物的外植体，用组织培养的方法从转化的外植体中再生出植株，并通过PCR和Southern杂交等分子检测手段对育性相关基因反义片段是否整合在受体植物染色体中进行验证；(6)在转基因植株中观察其花粉的育性，并进行花粉萌发试验和剥蕾授粉试验，即可获得雄性不育植株。
3.按权利要求2所述的构建白菜类蔬菜作物的人工雄性不育系的方法，其特征在于扩增的438bp反义基因片段来自育性相关基因，该反义基因片段具有SEQ ID No.2的序列。
4.按权利要求2所述的构建白菜类蔬菜作物的人工雄性不育系的方法，其特征在于所说的农杆菌菌株为LBA4404或EHA105。
5.按权利要求2所述的构建白菜类蔬菜作物的人工雄性不育系的方法，其特征在于所说的外植体为带柄子叶。
6.按权利要求2所述的构建白菜类蔬菜作物的人工雄性不育系的方法，其特征在于步骤5)所说的组织培养基中的基本培养基为1/2倍浓度NH4+的MS培养基的盐类及维生素+2％蔗糖+0.8％琼脂+60mL/L椰子汁+2mg/L BAP+0.45mg/L NAA+7.5mg/L AgNO3(pH值5.8)；
7.按权利要求2所述的构建白菜类蔬菜作物的人工雄性不育系的方法，其特征在于步骤6)所说的花粉萌发试验液体培养基为15％蔗糖+0.01％硼酸+1mg/L GA3。
全文摘要
本发明公开了一种白菜育性相关基因及用该基因构建白菜类作物的人工雄性不育系的方法。本发明利用植物基因工程将育性相关基因的内部第901个碱基至第1338个碱基之间设计引物，扩增438bp序列作为反义基因片段同时引入植物染色体中，获得再生植株，并获得人工雄性不育的普通白菜和菜心。该方法适用于芸薹属植物，能快速构建各种白菜类蔬菜作物的雄性不育系，克服了从自然界寻找不育源所受的限制，同时也为植物基因工程技术在农业生产中的广泛应用开辟了一条新的途径。
文档编号C12N15/74GK1453359SQ03128960
公开日2003年11月5日 申请日期2003年5月27日 优先权日2003年5月27日
发明者曹家树, 余小林, 叶纨芝 申请人:浙江大学