专利名称：：籽粒富铁/锌和尼克酰胺的转基因农作物的培育法及应用的制作方法
技术领域：
：本发明属于农作物育种和基因工程领域，特别涉及一种新的水稻转基因材料、相关基因及功能；具体地讲，涉及胚乳超表达尼克酰胺合成酶(NAS)基因后培育的转基因水稻及其在富铁锌保健方面的应用。
背景技术：
：铁锌等微量元素虽然含量甚微，却是人体50%-70%的酶的组成成分，在维持正常生命活动过程中担任了不可替代的作用。由于不合理的饮食结构和生活方式，铁锌微量营养元素缺乏症已成为影响人类健康的重要因素，被称为"第二饥饿"。据报道，世界人口的66%80%可能存在铁缺乏，其中20亿人是贫血，主要是由铁素缺乏造成的[1'21;缺铁性贫血可导致不良怀孕、母婴的死亡率提高、影响婴儿的心智发育、降低免疫功能、增加疲劳感以及使工作效率低下等，对人类的健康造成很大的烕胁。锌缺乏在发展中国家也是很普遍，影响着约20亿人口，锌缺乏可导致侏儒、男性不育症和免疫功能降低等。根据我国政府最近公布的数据表明，我国目前22%的5岁以下儿童患由缺铁引起的贫血症，而在农村高达50%的6个月以下婴儿患缺铁引起的贫血症。同时由于缺乏锌等微量元素而引起的疾病也在不断蔓延。根据国家统计局调查的数据，因铁锌等微量元素缺乏引起的营养不良造成的年度损失高达300亿人民币(相当于36亿美元)，占国民生产总值的3%-4%。因此，微量元素强化营养对维持人众健康至关重要。因此，通过各种传统育种及现代生物技术手段来提高各种主要粮食，尤其是作为超过半数的人口的主粮水稻的铁、锌含量及生物有效性一直受到各国所重视，并成为国际生物强化(Harve鄉lus)计划的研究重点3]。通过改良稻米品质从而改善民众的铁营养状况包括二方面的工作。一是要提高稻米中铁锌素的绝对含量；二是要提高稻米中微量元素的营养效价，即生物有效性。在提高铁含量方面，国际水稻所对几千份的水稻种质资源进行了元素含量分析，发现其中一些所谓的高铁水稻品种，其铁元素成份主要集中于水稻种子的外层，在经过加工的精米中铁含量没有显著提高，因此对改善民众的缺铁状况并无帮助。用植物转基因技术的方式，将大豆铁蛋白(Ferritin)基因在水稻的胚乳中高效表达，能提高稻米的铁素含量[4，5]，但由于稻米中存在着大量植酸等营养抑制剂，这些超积累铁蛋白并不能被人体或动物很好地吸收[5]，即铁素的生物有效性不高。提高铁的生物有效性可以通过降低或消除营养抑制剂的方法。只有当稻米中存在分解植酸的植酸酶或者铁吸收的促进剂(如维生素C)存在时，稻米中的铁素才能很好地被利用[5'6]。此外，二价铁盐(如FeS04)，合成性螯合剂(EDTA)等形式存在的铁素，较易被动物及人类吸收利用，是铁强化食品的主要形式。但由于这些铁强化制剂都不是天然存在的，作为食品的添加剂在使用时有较高的成本，在我国或其他的发展中国家推广有一定的困难。尼克酰胺(NA)在水稻中主要行使了两个方面的功能[7首先，它在代谢途径中作为麦根酸类物质(MAs)的合成前体，可以促进铁素从土壤中的吸收；另一方面，它自身又广泛存在于植物体内，作为Fe(II)/Zn等二价金属离子的鳌合物存在，参与铁锌等金属离子在体内的运输与固定。通过转基因的手段在植物体组织中超量表达尼克酰胺合成酶(NAS)基因，以提高NA的含量，不仅可提高植物的铁锌的吸收效率，提高可食用部分的铁锌等微量元素的含量；还能通过其与铁素螯合作用，提高食用植物器官的铁生物有效性，因而具有明显的应用价值。目前尚无在水稻胚乳中表达NAS基因，提高水稻铁素含量和有效性的报道。上述参考文献具体如下[l].WHO.(2003)(http:〃www.who.int/nut/malnutrition—\vorldwide.htm#ida).[2].FrossardE,BucherM,MachlerF，MozafarA，HurrellR(2000).PotentialforincreasingthecontentandbioavailabilityofFe,Zn,andCainplantsforhumannutrition.JSciFoodAgric80:861-879.[3].http:〃www.harvestplus.org/index.html,GotoF，YoshiharaT，ShigemotoN,SeiichiT,TakaiwaF(1999)Ironfortificationofriceseedbythesoybeanferritingene.Naturebiotech17:282-286.[5].LuccaP，HurrellR,Potrykus(2001)Geneticengineeringapproachestoimprovethebioavailabilityandthelevelofironinricegrains.TheorApplGenet102:392-397.[6].CookJD，ReddyMB，BumJ，JuilleratMA,Hurrell(1997)Theinfluenceofdifferentcerealgrainsonironabsorptionfrominfantcerealfoods.AmJClinNutr65:964-969.[7].vonWir6nN,KlairS，BansalS,BriatJF,KhodrH，ShioiriT，LeighRA，HiderRC(1999)NicotianaminechelatesbothFeIIIandFell:Implicationsformetaltransportinplants.PlantPhysiol.119:1107-1114[8].Murray-KolbL，TakaiwaF，GotoF，YoshiharaT，TheilEC，BeardJL(2002)TransgenicRiceIsaSourceofIronforIron-DepletedRats.JNutr132:957-960
发明内容本发明要解决的技术问题是提供一种籽粒富铁/锌和尼克酰胺的转基因农作物的培育方法，采用该方法能通过提高农作物的籽粒中铁锌含量和NA的含量、从而得到含高生物有效性铁素的农作物。为了解决上述技术问题，本发明提供一种籽粒富铁/锌和尼克酰胺的转基因农作物的培育方法，包括以下步骤-1)、选用尼克酰胺合成酶基因，选用胚乳特异表达基因的启动子和终止子；2)、胚乳特异表达转基因载体的构建所述胚乳特异表达基因的启动子、尼克酰胺合成酶基因与常用的植物表达用终止子正向串联连接，得到农作物胚乳过量表达NAS基因的基因表达框；从而获得转基因载体；3)、转基因农作物的培育通过转基因培育法获得转基因农作物。作为本发明的转基因农作物培育方法的改进，当农作物为水稻时，包括以下步骤1)、选用水稻尼克酰胺合成酶基因0sNASl，该基因具有SEQIDNO:l所示的核苷酸序列；选用水稻谷蛋白合成酶基因启动子pGluB-1，该基因启动子具有SEQIDNO:2所示的核苷酸序列；选用根癌农杆菌胭脂碱合成酶基因终止子Tnos，该终止子具有SEQIDNO:3所示的核苷酸序列；2)、胚乳特异表达转基因载体的构建水稻谷蛋白合成酶基因启动子pGluB-1、水稻尼克酰胺合成酶基因0sNASl与根癌农杆菌胭脂碱合成酶基因终止子Tnos正向串联连接，得到水稻胚乳过量表达NAS基因的基因表达框；从而获得转基因载体pLU14;3)、转基因水稻的培育通过转基因培育法获得转基因水稻NASE-9。作为本发明的转基因农作物培育方法的进一步改进步骤2)中在双元载体pTF10L1的多克隆位点，利用酶切连接方法插入水稻谷蛋白合成酶基因启动子pGluB-1和根癌农杆菌胭脂碱合成酶基因终止子Tnos，得到中间载体pLU10;然后在中间载体pLUlO的pGluB-l启动子和Tnos终止子之间正向插入水稻尼克酰胺合成酶基因0sNASl，得到转基因载体pLU14。作为本发明的转基因农作物培育方法的进一步改进步骤3)中将转化了pLU14载体的农杆菌EHA101侵染粳稻品种"秀水110"的愈伤组织，经过转基因的共培养、选择、分化、生根步骤获得转基因水稻NASE-9。在本发明中，胚乳特异表达基因的启动子的选用规则为现有的已证明包含能够在种子中增强表达的转录调控元件的启动子；尼克酰胺合成酶基因的选用规则为具有尼克酰胺合成酶活性的植物基因，即为0sNASl的同源基因。终止子的选用规则为植物转基因表达载体常用的终止子。在本发明的步骤2)中，基因表达框通过农杆菌介导的转基因方式在农作物(特别是水稻)中的表达导致了农作物(特别是水稻)籽粒中尼克酰胺、铁、锌含量和生物有效性铁含量的提高。本发明还提供了同一发明构思下的按照上述方法获得的转基因农作物的用途将该种转基因农作物所得的籽粒作为食品添加剂，加入到食物或饲料中；从而提高食物或饲料的铁吸收率。作为本发明的转基因农作物的用途的改进每lkg食物中添加0.2lkg的食品添加齐U，每lkg饲料中添加0.10.25的食品添加剂。本发明是针对现有农作物所存在的微量元素营养缺陷的问题，其提供了能使农作物具有良好营养和保健功能的添加剂一尼克酰胺，通过转基因方法使农作物籽粒中高效积累尼克酰胺；因此采用本发明方法所得的农作物籽粒中富集铁、锌微量元素。本发明具体是通过下述技术方案来实现利用水稻的胚乳特异表达启动子，在水稻种子中超表达水稻尼克酰胺合成酶(NAS)基因，提高了水稻种子中尼克酰胺的含量，由于尼克酰胺对于铁具有很高的鳌合能力，其含量的提高促进了更多的铁向水稻种子中的转运，从而提高水稻籽粒中的铁含量。通过铁生物有效性营养学细胞模型Caco2实验证明，此种形式的铁的生物有效性为未转基因水稻籽粒的5-6倍，在现有水稻品种中从未有报导。本发明提供一种胚乳过量表达NAS基因转基因双元载体的构建方法水稻胚乳特异性启动子(pGluBl)与目的基因OsNASl和根癌农杆菌胭脂碱合成酶基因终止子(Tnos)正向串联连接，得到水稻胚乳过量表达NAS基因的基因表达框。该基因表达框通过农杆菌介导的转基因方式在水稻中的表达导致了水稻籽粒中尼克酰胺、铁、锌含量和生物有效性铁含量的提高。具体说，可以通过胚乳过量表达NAS基因的方法，获得水稻籽粒中高尼克酰胺、铁、高锌、高生物有效性铁的转基因水稻种质资源。本发明的优点在于，利用本发明提供的转基因策略能够达到同时提高植物食用部分(以籽粒为例)中尼克酰胺、铁元素含量及生物有效性铁。尼克酰胺除了具有提高铁生物有效性、缓解目前全球流行的缺铁性营养不良症外，还能通过抑制血管紧縮素转化酶的活性，起到降血压的功能。因此，本发明提供的培育新型转基因农作物(特别是水稻)的途径，具有重大的应用前景。实现本发明的具体技术步骤如下-一.水稻尼克酰胺合成酶基因的分离-通过对水稻基因库数据的挖掘，我们获得了水稻尼克酰胺合成酶基因(0sNASl，基因库序列号AB046401)的序列，如SEQIDNO:l所示；以及水稻谷蛋白合成酶基因启动子(pGluB-1,基因库序列号AY427569)的序列，如SEQIDNO:2所示，并根据这二个序列设计引物，运用聚合酶链式反应的程序分别从水稻的cDNA和基因组DNA中扩增到以上二段DNA序列。二.胚乳特异表达转基因载体的构建在双元载体pTF101.1(图l)的多克隆位点，利用酶切连接方法插入水稻谷蛋白合成酶基因启动子pGluB-l和根癌农杆菌胭脂碱合成酶基因终止子Tnos，得到中间载体pLU10(图2);在中间载体pLU10的pGluB-l启动子和Tnos终止子之间正向插入水稻尼克酰胺合成酶基因(0sNASl)，得到转基因载体pLU14(图2)。三.转基因水稻的培育将转化了pLU14载体的农杆菌EHA101侵染粳稻品种"秀水110"的愈伤组织，经过转基因的共培养、选择(除草剂抗性筛选)、分化、生根等步骤获得转基因水稻NASE-9，转基因水稻农艺性状与"秀水110"无殊(图4)。为了证明本发明方法所得的转基因水稻所具有的优越性，发明人作了如下的对比实验1、水稻籽粒微量元素含量的测定分别将秀水110和NASE-9转基因材料(即本发明)最终所得的糙米和精米取样烘干、磨粉各0.3克左右，加入5毫升硝酸进行消煮，然后用10%硝酸溶解消煮产物，定容，用ICP仪测定铁、锌的含量。结果表明转基因(NASE-9)水稻糙米中铁、锌含量分别比非转基因(秀水U0)对照增加了59.75%和37.38%，精米中铁、锌含量分别比非转基因(秀水110)对照增加了36.01%和54.48%。具体见表l。表1.秀水110和NASE-9转基因水稻籽粒的铁锌含量<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>2、水稻铁尼克酰胺含量测定-秀水110和NASE-9转基因籽粒尼克酰胺含量分析表明，转基因籽粒的尼克酰胺含量为84.2|ig/g,是秀水110的4.3倍。3、水稻铁生物有效性测定利用CaCo-2实验细胞学模型，我们对秀水110和NASE-9籽粒糙米和精米的铁生物有效性进行了测定，结果表明在用糙米样品用的试验中，NASE-9米样培养的Caco2细胞中铁蛋白含量为11.22，较对照秀水110高3.3倍;用精米样品时,NASE-9米样培养的Caco2细胞中铁蛋白含量为11.75，较对照秀水il0高5.7倍，比美国农业部标准稻米样品Nishiki髙4.78倍。具体见表2。因此证明本发明所得的转基因水稻NASE-9，其铁素生物有效性远高于现有的水稻品种。表2.Caco2细胞中铁蛋白的含量<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>*:取水稻籽粒提取物培养Caco2细胞系后从Caco2细胞中测得的值。据此说明，本发明证明了在食物中添加尼克酰胺能提高铁素的生物有效性，而在水稻胚乳中特异性地表达尼克酰胺合成酶基因可使水稻籽粒尼克酰胺、铁和锌等微量元素的绝对含量提高。本发明的技术途径在农业生产和科学研究上具有很高的价值。我们一方面可以利用本发明的技术方法，培育具有高铁、锌和高铁生物有效性稻米，解决民众普遍存在的微量元素缺乏营养的食品。另一方面，本发明的技术方法可用于生产高尼克酰胺稻米，可用于高血压病人的辅助治疗。本发明的转基因品种在农业生产和科学研究上具有很高的价值。一方面，该转基因品种材料所具有的高铁高锌，特别是高生物有效性铁含量，填补了目前缺少有效方法和手段提高稻米中生物有效性铁的现状，其对于通过生物强化解决目前全球流行的缺铁、缺锌性相关性疾病具有重大的推动作用，甚至还可直接用于农业生产，给人们提供高微量元素营养的食品。另一方面，高锌含量对于进一步分析其营养学价值具有重要意义。此外，由于尼克酰胺对于治疗和缓解高血压等心脑血管疾病具有显著作用，该转基因水稻品种还有其作为功能性食品的重要价值。下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。图1是双元载体pTF101.1的示意图；图2是转基因双元载体的构建过程图；图3是NASE-9中目的基因在胚乳和叶片中的表达图；图4是田间生长条件下的秀水110和NASE-9转基因水稻的状态图。具体实施例方式下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明范围。实施例1、水稻尼克酰胺合成酶基因的分离-通过对水稻基因库数据的挖掘，我们获得了水稻尼克酰胺合成酶基因(OsNASl,基因库序列号AB046401)的序列，如SEQIDNO:1所示；以及水稻谷蛋白合成酶基因启动子(GluB-l，基因库序列号AY427569)的序列，如SEQIDNO:2所示。并根据这二个序列设计引物，该引物序列如下0sNAS1-U:AACCATGGAGGCTCAGAACCAAGAOsNAS1-L:TATCTAGAGATCGTCCGGCTGTTAGACGluB-U:ATGAATTCTTGCTACCAACAACTTCACGluB-L:AACCATGGGCTGGGCCATAGAACCGTGGCATA然后，运用聚合酶链式反应的程序分别从水稻的cDNA和基因组DNA中扩增得到以上二段DNA序列，即SEQIDNO:1和SEQIDNO:2。实施例2、胚乳特异表达转基因载体的构建双元载体pTF101.1(图l)中是一个用于农杆菌介导的植物转基因载体，在载体中已有一个完整的筛选标记基因表达框，即由双倍35S启动子驱动的草丁膦抗性基因。在该基因表达框的边上有一个可用于基因克隆的多克隆位点。本试验中利用DNA片段酶切和连接方法在多克隆位点上插入了水稻谷蛋白合成酶基因启动子GluB-l和根癌农杆菌胭脂碱合成酶基因终止子Tnos(如SEQIDNO:3所示)，得到中间载体pLU10(图2);在中间载体pLU10的GluB-l启动子和Tnos终止子之间正向插入水稻尼克酰胺合成酶基因(0sNASl)，得到转基因用的最终载体pLU14(图2)。实施例3、水稻转化双元转基因载体pLU14及其空白载体pLU10通过电击的方法转入农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)株系EHA105中转化水稻。将秀水110的成熟种子脱壳、消毒，经过诱导培养基培养3周后，挑选生长旺盛愈伤用作转化的受体。用含有双元质粒载体的EHA105菌株侵染水稻愈伤，在黑暗、25。C条件下培养3天后，在含有2mg/L双丙氨膦(bialaphos)的选择培养基上筛选四周后获得抗性愈伤组织，经愈伤分化、再生后获得转基因幼苗。幼苗经叶片喷洒100mg/L的草丁膦剔除假阳性幼苗后，转基因苗被转到溶液培养2周后，移栽到水田栽培收获转基因一代(T,代)种子。实施例4、目的基因表达量的分子检测pLU10(空白载体)和pLU14(含Glubl::NASl)二载体的转基因植株的叶片的幼嫩种子(授粉后18天)取样提取RNA，经逆转录-PCR后获得目的基因NASI在叶片和种子中的RNA表达量。pLU10载体的转基因植株作为空白对照，Osactin这一持家基因用于控制RT-PCR中cDNA的加样量。图3所示pLU10-T和pLU14-T分别为用空白载体pLU10和目的基因载体pLU14进行转基因后获得的转基因植物叶片和种子标本的RT-PCR结果。0sactin为持家基因对照。从图3可以看到，与空白对照转基因植株相比，NASE-9植株中NASI基因在叶片和种子中均大量表达。实施例5、转基因水稻的用途-将该种转基因水稻所得的籽粒作为食品添加剂，加入到食物或饲料中；从而提高食物或饲料的铁吸收率。一般情况下，每lkg食物中添加0.2lkg的转基因水稻籽粒，每lkg饲料中添加O.10.25的转基因水稻籽粒。最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。序列表SEQIDNO:1atcaagcagttcgaacactccatttggttgtgcaacatcagctcactcgtgttcccaaccaccaagaggtcgctgccctggtcg已g犯gatgccgtcgctgagcccatccgccgaggtgggcgtcccggcgagccccgtcgacgtggccaaggagctcatccgcctctgctccgccgccgtgctcgccgccttcgacaacccgctcgaccacgtcaacctgagcaagctggagtacgacccceicccgcgtcgccttcgtcgggtcgggcccgcaccacctgccggacgcggtgttcgacagggcg鄉aggctgttccgcggcgccgacgccgccgacgtggcgaccctgacgggggagccgctcgtgggcatggcggccgagg卿aggtggcggscggcgcggcgctcgtcgtgcggaCgatCgtCgatCCCg￡Lgg￡LCgtCaggCgtgcggaggacgaggtgatc犯ctccgtcatcgccgccgcggcgcgcag卿cgagctcgcggggccgccgtccacgtgctgcaaggtggaggccgccaac犯ggagctgtccgtctaacagcc犯taaatcatttgattatacttatgctgccatatgtttgtgttcgtacgtgttgtttggagtactga^gtgttcacagtagatcacaiagcsgtgtasacgaggaacatgccatctgtgtttttgtgactcattttcaa.ct.t33tcceiccacaactcg60gcgacaaagcttcacagatggaggctc卿120tcgccggcctccacgccgccatctccaagc180acgcgctcttcaccgacctcgtcacggcgt240agctcggcccggaggcgcaggcgatgcggg300agggccacctcgaagcgcactacgccgaca360acctcgcccgcttcccgtactacggcaact420tcctcgtccgctacgtccccggcattgccc480cgctgccgttcagctccctcgtgctcgccg540actacgaccggtgcggcgcggccaacgagc600agggcctcggcgcgcgcatggcgttccaca660tcggcgcgtacgacgtcgtgt.tcctggcgg720ccggggtgatcgcgcacctgggcgcgcaca780gcgcgcacggggcgcgcgggttcctgtacc840gcgggttcgacgttctggcggtgtgccacc900tcgcccgcaaggtcggtgccgccgccgccg960actcgcgcggcgtggttctgccggtggtcg1020cgagcgcggttg卿aggcagaagagtttg1080cggacgatcgaaaggcgcactatattatgg1140atttgcgaagctaaggtatsctatgcaagc1200gacgtacagttgtgttgttgtacgtcgtga1260ttcacagcaatcaatgaggaccctgtaagc1320atgacagtgagaaattat3taagaaaaa_c￡i13801389SEQIDNO:2gicagattcttgctacc犯caacttcacaaatcacctcacttccgcccatgaccgtgagca犯agaaggtacactttacctacacaacgcctagccacgtcttgtgacttaagggatttcgacaccttatgaaaactggaggggtcccacattgtgccaggaa犯atccaaggggtcctccattggcatcaagatttgcctgacctagctacatgtggtcaceLcatgttgLggttgg已gaaac肪gaccg3gaaaccataccaccagtactttgttttcaaggcacccgacccaggtgtgtctttacccatagttgatcattc犯attttga3Cg3￡lt3Ctg3g3CCt3gC3ttgt3gtCg3gggcctgttggttatattgcaaactgcggcgtagtagtcaaccaaaactatgctaaggaa60cgactgttcaaac已gtttgttaatctctac120actaacctgagttacccagcccatgcaaaa180cg3c犯ggcatttcgaaagcccacacaagg240gacc犯caaca已gttaggtcccaaaccatg300cccg3ca犯tccacttgtcc360attactcagccaggcatgtcaicaattc3cc420ttctaaagga犯gg城cggtccatatgag■ctsccgaaatacgagtttagtaaactcatt540gggttttccagggattttgt8aacccEL3gt600gg鄉gtc已ttggtaitccgtacctgagggc660CC犯gg3ggttaatgcagca3ttgt鄉tg720caacatttcatgtgtaattt卿gatgtgc780attttgagaaccttgcttgacg犯gctac3gagtactaagagtcaatcgaCtgC"t"ttttgacacgacggaggacgagtgcctgcaaacaccaaatccgtcgtggtc卿taggcsLagttaaccaatatgctaaa&atacatttgctatttgcaag犯ggctttt3ca3g3tc犯gteiaatatatagcttgctcatcttctatacatacatC^l2ieigCElCCttgcctttcctgtctttgaatatcttgagccgtggaacgatgtgccactgacagacagttggctgaaggcgcagctacgaac犯ggctaggcctgggtgggtgta^犯tttatgggtcaacttactgtctagttacttatttatgacatgcaac3犯gttctacgcaaaa3ttMgagtaagaagtttgtttttgtactgcaccatgtatctcacatcaattcttcctcg犯tagatctcg犯gagatatgaatt.aaatgggcgtgtggccgaacgggggtggactcggtgagcgggcagettttgagtgaatcataatattaagcagtaagatatattttcaattgtagtc11aaaaaaag犯aaattax:at已已gtatgttgacaacatg3gCttt3tggtgg已cagac已catggct眺tgttttaacacccaagatgcttagctt犯gttatgggctctattccgcgcca朋acg3ccgstttttgagggattttctacagcgtgctgaccgagtggaccccgcgcggacgcgggagccacggcccacgtgtttttcaaaaggcttatacatgacaacgtatcaagtatC朋t3ggC3catttaaaaagttattttgacttacaagtttttctttaactcatgaaatgctacaagccattttttattgtttcc已taagaaat犯tgaaactaggagataaggaaaagcg犯ttttagasgattaattgcgtgcggacaCCggSCg3ggtatcccgagtcgtcctaggtgtgtagcctcgacatggtaaaatgacaacaatgctttatttacaagttacaggaac3cctattatcatctaaactccatttatattgtctctatataaaccaagtacaaaaggtgacctacttctggctctcgtattagtagttgaacagattctctgtag卿tggcttgcgsgcg咖3tgtggcctaggtccactgtgcaccgg犯gacagctctccgtaCgtC8Ltttc犯t犯actgtccggtatattatcaa/ttgt犯3gtt3gaC33ggC3犯gtgtattactctcttgca犯ggtacgtgcaatagcttggtctagct84090096010201080114012001260132013801440150015601620168017401800186019201960202021002160222022802335SEQIDNO:3caaacatttggca^taaagttcatataatttctgttgaattatttatgagatgggttttta犯acaa38teitagcgcgcatagatcgggaattttcttaagattg犯tcctgttacgtt犯gcatgtaat犯tatgattagagtcccgcaatt犯ctaggat已aattatcgcgtgccggtcttgcgatgatta60taacatgt犯tgcatgscgt120atacattt犯tacgcgatag180cgcggtgtcatctatgttac24025权利要求1、一种籽粒富铁/锌和尼克酰胺的转基因农作物的培育方法，其特征是包括以下步骤1)、选用尼克酰胺合成酶基因，选用胚乳特异表达基因的启动子和终止子；2)、胚乳特异表达转基因载体的构建所述胚乳特异表达基因的启动子、尼克酰胺合成酶基因与常用的植物表达用终止子正向串联连接，得到农作物胚乳过量表达NAS基因的基因表达框；从而获得转基因载体；3)、转基因农作物的培育通过转基因培育法获得转基因农作物。2、一种籽粒富铁/锌和尼克酰胺的转基因农作物的培育方法，其特征是该农作物为水稻，包括以下步骤-1)、选用水稻尼克酰胺合成酶基因OsNASl，该基因具有SEQIDNO:l所示的核苷酸序列；选用水稻谷蛋白合成酶基因启动子pGluB-1，该基因启动子具有SEQIDNO:2所示的核苷酸序列；选用根癌农杆菌胭脂碱合成酶基因终止子Tnos，该终止子具有SEQIDNO:3所示的核苷酸序列；2)、胚乳特异表达转基因载体的构建水稻谷蛋白合成酶基因启动子pGluB-l、水稻尼克酰胺合成酶基因0sNASl与根癌农杆菌胭脂碱合成酶基因终止子Tnos正向串联连接，得到水稻胚乳过量表达NAS基因的基因表达框；从而获得转基因载体pLU14;3)、转基因水稻的培育通过转基因培育法获得转基因水稻NASE-9。3、根据权利要求2所述的籽粒富铁/锌和尼克酰胺的转基因农作物的培育方法，其特征是所述步骤2):在双元载体pTF101.1的多克隆位点，利用酶切连接方法插入水稻谷蛋白合成酶基因启动子pGluB-l和根癌农杆菌胭脂碱合成酶基因终止子Tnos，得到中间载体pLU10;然后在中间载体pLU10的pGluB-l启动子和Tnos终止子之间正向插入水稻尼克酰胺合成酶基因0sNASl，得到转基因载体pLU14。4、根据权利要求3所述的籽粒富铁/锌和尼克酰胺的的转基因农作物的培育方法，其特征是所述步骤3):将转化了pLU14载体的农杆菌EHA101侵染粳稻品种"秀水110"的愈伤组织，经过转基因的共培养、选择、分化、生根步骤获得转基因水稻NASE-9。5、按照权利要求14中任意一种方法获得的转基因农作物的用途，其特征是将该种转基因农作物所得的籽粒作为食品添加剂，加入到食物或饲料中；从而提高食物或饲料的铁吸收率。6、根据权利要求5所述的转基因农作物的用途，其特征是每lkg食物中添加0,2lkg的食品添加剂，每1kg词料中添加0.10.25kg的食品添加剂。全文摘要本发明公开了一种籽粒富铁/锌和尼克酰胺的转基因农作物的培育方法，包括以下步骤1)选用尼克酰胺合成酶基因，选用胚乳特异表达基因的启动子和终止子；2)胚乳特异表达转基因载体的构建胚乳特异表达基因的启动子、尼克酰胺合成酶基因与常用的植物表达用终止子正向串联连接，得到农作物胚乳过量表达NAS基因的基因表达框；从而获得转基因载体；3)转基因农作物的培育。采用该方法能通过提高农作物的籽粒中铁锌含量和NA的含量、从而得到含高生物有效性铁素的农作物。本发明还公开了上述转基因农作物的用途将其所得的籽粒作为食品添加剂，加入到食物或饲料中；从而提高食物或饲料的铁吸收率。文档编号C12N15/09GK101200714SQ20071007156公开日2008年6月18日申请日期2007年10月9日优先权日2007年10月9日发明者平吴,寿惠霞,程龙军,贝晓姝,晔郑,郑录庆,雷新根申请人:浙江大学