专利名称：一种天然2-苯乙醇的制备方法
技术领域：
本发明涉及一种微生物转化法生产天然2-苯乙醇的方法，具体说，涉及一种以酿酒酵母 为完整细胞催化剂，以酶催化法或微生物发酵法生产的L-苯丙氨酸为底物，采用有机溶剂/ 水的两相体系进行原位产物分离法生物转化生产天然2-苯乙醇的方法。技术背景2-苯乙醇(2-phenylethano1， 2-PE)是一种具有柔和细腻玫瑰气味的芳香醇，自然界中 许多植物因含2-苯乙醇而芳香怡人，如玫瑰、茉莉、黄兰和百合等。2-苯乙醇的香气颇受人 欢迎，是国际香精香料的主流风格，大量应用于玫瑰型及其他类型的香精配方中，在食品和 日化等领域中均有广泛应用。目前，2-苯乙醇主要采用苯-环氧乙烷合成法和氧化苯乙烯加氢 法生产，存在诸如原料毒性高、产品纯度低、合成过程污染大等弊端。随着人们生活水平的 提高和对健康的关注，越来越崇尚绿色和天然产品。在欧美国家，能标记为天然的产品必须 是采用物理方法从天然材料中提取、酶催化或微生物发酵法生产。从玫瑰等植物的精油中提 取天然2-苯乙醇，由于原料来源和提取成本等原因而难以满足市场需求，而生物技术迅猛发 展，为天然2-苯乙醇的生产提供了新的途径。许多发酵食品也具有香甜的芬芳气味，其香味物质是酵母菌在生长过程中自身合成的2-苯乙醇。许多酵母菌具有合成2-苯乙醇能力，但也可以通过艾氏代谢途径将胞外的L-苯丙氨 酸转化合成为2-苯乙醇，转化的反应过程见下图。因酵母自身合成2-苯乙醇浓度比较低，直 接发酵法生产2-苯乙醇的工业化前景不大，而以L-苯丙氨酸为底物，由酵母细胞生物转化合 成2-苯乙醇则具有很大的可行性。用生物转化合成的2-苯乙醇，按欧洲立法规定，可以标称 为天然，因为作为其前体的原料L-苯丙氨酸也是采用酶法或微生物发酵法生产，属天然产品， 目前市场上L-苯丙氨酸供应充足，价格便宜，可满足大规模生物转化法生产2-苯乙醇的需要。 由此可见，采用生物转化法合成的2-苯乙醇，产品具天然属性，还有气味纯正，生产过程污 染小等优点。<formula>formula see original document page 5</formula>
由于产物2-苯乙醇对作为催化剂的酵母细胞有一定的毒性，转化反应体系中2-苯乙醇 达到一定浓度后就抑制细胞生长，从而限制了 2-苯乙醇的转化合成浓度，这严重阻碍了生物 转化法合成2-苯乙醇的工业化运用。克服产物对酵母细胞的毒性，最好的方法是采用原位产 物分离技术(/"wYw product-removal,简称ISPR)。原位产物分离技术就是在发酵过程中，采 用萃取法、吸附法、膜过滤法移走产物，达到减少产物抑制，提高产物浓度和生产率的目的。 生物转化法生产2-苯乙醇过程中，采用原位产物分离技术，可以降低水相培养基中的2-苯乙 醇浓度，从而解除对酵母细胞的毒害作用，利于L-苯丙氨酸向2-苯乙醇转化反应的进行，从 而提高了 2-苯乙醇合成浓度和生产率，将转化发酵和提取分离相耦合，既克服产物对酵母细 胞的毒性，又实现了产物的萃取分离，提高了2-苯乙醇的浓度和转化率，可以实现大规模工 业化应用。发明内容本发明目的在于提供一种转化发酵过程与分离提取过程耦合的原位产物分离生产天然2-苯乙醇的方法。为达到发明目的，本发明采用以下技术方案以酿酒酵母(Sacc/wraw3;cMcewv/w'ae)经过种子扩大培养的种子液为生物催化剂，所述 的种子液接种于转化培养基，再加入酶催化法或微生物发酵法生产的L-苯丙氨酸为底物，在 有机溶剂存在的条件下进行摇床振荡或通气搅拌转化，温度控制在25 3(TC，转化18 24h， 转化液后处理得到天然2-苯乙醇，所述的L-苯丙氨酸加入浓度以培养基体积计为10~20g/L， 所述的有机溶剂为油酸或聚丙二醇。所述种子液接种于转化培养基的接种量为5~10%体积比，所述的种子液菌体浓度为稀释 20倍后的00660=0.4-0.6。本发明所述2-苯乙醇的制备方法，转化培养基组成为蔗糖100~140 g/L，酵母浸出粉 5.0~7.5 g/L， KH2P04 7.5 g/L， K2HP04.3H20 12.6 g/L， MgS04'7H20 0.5 g/L，溶剂为水，pH 自然。本发明所述有机溶剂的体积用量与转化培养基体积比为1:1~3。本发明所述酿酒酵母是安琪酒精活性干酵母经分离纯化而获得。本发明使用的酒精活性 干酵母是湖北安琪酵母股份有限公司生产，商品名为"安琪酒精活性干酵母"。所述的酿酒酵母采用如下方法获得用湿接种环挑取安琪酒精活性干酵母粉(湖北安琪 酵母股份有限公司生产，商品名安琪酒精活性干酵母，批号051225)少许到斜面培养基上，斜面于25 3(TC恒温培养24 36h，斜面菌体生长丰满，再挑取上述斜面菌体少许于装有 数十粒玻璃珠和50mL无菌水的三角瓶中，三角瓶于室温下振荡20min，制得酵母细胞悬液， 细胞数为2.6xl(^个/mL。酵母细胞悬液经稀释20000倍后，吸取0.2mL涂布平板培养基，平 板于25 3(TC恒温培养24 36h，待菌落长出后，挑取形态隆起、边缘整齐、乳白色的菌落转 接斜面培养基，斜面于25 30。C恒温培养24 36h。将所得菌株进行摇瓶转化合成2-苯乙醇筛 选实验，转化合成2-苯乙醇浓度最高的菌株作为本发明的转化菌种。分离得到的菌种在无有 机溶剂存在的条件下，转化合成2-苯乙醇的浓度可达4.82 g/L。所述的平板培养基成分为 葡萄糖10 20g/L，蛋白胨5~10g/L，酵母浸出粉3~5g/L， 2-苯乙醇3g/L，琼脂15 20g/L， 溶剂为水，pH自然。本发明分离转化合成2-苯乙醇的酿酒酵母时，所述的平板培养基中均加入3 g/L的2-苯乙 醇作为定向筛选的压力，抑制对2-苯乙醇耐受性差的菌株生长，有利于高转化活性菌株的选 出，提高了筛选效率。本发明所述转化液后处理方法如下先以4000r/min 5000r/min高转速离心，使两相体系 分为有机溶剂相、培养基相和酵母菌体三层，上层有机溶剂相中的2-苯乙醇采用减压蒸馏法 分离，收集馏分得2-苯乙醇；中层培养基相中的2-苯乙醇采用有机溶剂萃取法或大孔树脂吸 附法分离，有机溶剂萃取法是采取有机溶剂萃取培养基相制得萃取液，萃取液减压蒸馏除去 有机溶剂，得所述的2-苯乙醇，所述的有机溶剂为乙酸乙酯或乙酸丁酯。本发明所述酿酒酵母种子液按如下步骤制备得到将酿酒酵母接种至斜面培养基，经活 化培养得到斜面活化菌种，斜面活化菌种再接种至液体种子培养基，经过种子培养得到酿酒 酵母种子液。本发明所述活化培养步骤如下将酿酒酵母接种于斜面培养基，于25 3(TC的恒温培养 24 36h得斜面活化菌种，所述斜面培养基组成为葡萄糖10 20g/L，蛋白胨5 10g/L，酵 母浸出粉3~5g/L，琼脂15 20g/L，溶剂为水，pH自然。
本发明所述种子培养按如下步骤进行无菌条件下用接种环挑取2~3环经斜面活化培养得到菌种到到一级种子培养基中，于25 3(TC温度旋转振荡培养箱中，150-250 r/min振荡培 养20 24h，，获得一级种子液；再按5~10%体积比的接种量，将一级种子液接种至二级种子 培养基于25 30'C下、150 250r/min振荡培养20 24h，得酿酒酵母种子液。所述一级种子培 养基或二级种子培养基组成为葡萄糖20-40 g/L、蛋白胨10 20g/L、酵母浸出粉5~10 g/L， 溶剂为水，pH自然。具体的本发明所述的2-苯乙醇制备方法推荐按如下顺序步骤进行(1) 斜面培养将酿酒酵母菌株接种于斜面培养基，于25 3(TC的恒温培养24 36h，获得 斜面活化菌种；斜面培养基组成为葡萄糖10 20g/L，蛋白胨5 10g/L，酵母浸出粉3~5g/L， 琼脂15-20 g/L，溶剂为水，pH自然。(2) 种子扩大培养无菌条件下，以2 3环/40 50mL培养基的接种量，将斜面活化菌种 接种至种子培养基，于25 3(TC下、150 250r/min振荡培养20-24 h，获得一级种子液；再按 5~10%体积比的接种量，将一级种子液接种至二级种子培养基于25 3(TC下、150~250 r/min 振荡培养20 24h，得酿酒酵母种子液。所述一级种子培养基或二级种子培养基组成为葡萄 糖20 40g/L、蛋白胨10 20g/L、酵母浸出粉5~10 g/L，溶剂为水，pH自然；(3) 转化发酵将步骤(2)制备的酿酒酵母种子液为生物催化剂，按5~10%体积比的接 种量接种于转化培养基，再加入酶催化法或微生物发酵法生产的L-苯丙氨酸为底物，在有机 溶剂存在的条件下进行摇床振荡或通气搅拌转化，温度控制在25~30°C。转化反应过程可在 摇瓶或发酵罐中进行，在摇瓶中进行时，控制摇床转速150 300r/tnin;在发酵罐中进行时， 通入空气并搅拌，通气量为0.6~1.0V/V'min，搅拌转速为400~600r/min，控制转化液中的溶 氧水平不低于60%。转化18-24 h结束，得到含2-苯乙醇的有机溶剂/水的两相体系。所述的 L-苯丙氨酸加入浓度以培养基体积计为10~20g/L。转化培养基的组成为蔗糖100 140g/L， 酵母浸出粉5.0~7.5g/L， KH2P04 7.5 g/L， K2HP04.3H20 12.6 g/L， MgS04'7H20 0.5 g/L，溶 剂为水，pH自然。(4) 发酵液预处理将含2-苯乙醇的有机溶剂/水的两相体系，以4000 5000r/min转速离 心20min，使含菌体的两相体系分为有机溶剂相、培养基相和酵母菌体三层，将上层的有机 溶剂相和中层的培养基相分别移出，用于2-苯乙醇的提取分离。(5) 2-苯乙醇的提取分离有机溶剂相中的2-苯乙醇采用减压蒸馏法进行分离，收集馏分 得2-苯乙醇；培养基层中的2-苯乙醇采用有机溶剂萃取制得萃取液，萃取液减压蒸馏除去有
机溶剂，得所述的2-苯乙醇，所述的有机溶剂为乙酸乙酯或乙酸丁酯。 本发明所述的培养基均经过12rC高压蒸汽灭菌20 30min。本发明在转化发酵过程中，在转化体系中加入有机溶剂油酸或聚丙二醇，选择的有机溶 剂对酵母细胞生长基本没有毒性，不影响酵母细胞生长，但可以将酵母细胞转化合成的2-苯 乙醇萃取出来，降低水相培养基中的2-苯乙醇浓度，减轻2-苯乙醇对酵母细胞的毒性，提高 转化反应体系中的2-苯乙醇浓度和转化率。本发明实现了原位产物分离，把2-苯乙醇的转化合成和萃取分离耦合起来，转化反应进 行同时，加入的有机溶剂油酸或聚丙二醇，将2-苯乙醇从转化液中萃取出来，收集有机溶剂 相就可以直接进行减压蒸馏，收集馏分得产品2-苯乙醇。本发明生产过程简单，可以实现大规模工业化应用，生产的2-苯乙醇气味纯正，属天然 产品，还有生产周期短，环境污染小等优点。
附图l:本发明的方法工艺流程图。附图2: 2-苯乙醇标准品(3g/L)液相色谱图附图3:实施例1样品1的高效液相色谱图。 附图4:实施例1样品2的高效液相色谱图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此。本发明 的酿酒酵母来自安琪酒精活性干酵母(湖北安琪酵母股份有限公司生产，商品名"安琪酒精 活性干酵母")，按说明书方案中所说的方法筛选得到。实施例l本实施例的培养基配方为斜面培养基葡萄糖10g/L，蛋白胨5g/L，酵母浸出粉3g/L，琼脂15g/L，溶剂为水， pH自然，121t;高压蒸汽灭菌20min。
种子培养基葡萄糖20g/L、蛋白胨10g/L、酵母浸出粉5g/L，溶剂为水，pH自然， 121'C高压蒸汽灭菌20 min。转化培养基蔗糖100g/L，酵母浸出粉5g/L， KH2P04 7.5 g/L， K2HP04'3H20 12.6 g/L， MgS04'7H20 0.5 g/L，溶剂为水，pH自然，121'C高压蒸汽灭菌20min。先将冰箱保存的酿酒酵母斜面菌种挑取一满环菌体，接种于新鲜斜面培养基，斜面于25°C 生化培养箱中培养基36h，得活化的酿酒酵母菌株斜面。从活化的菌种斜面中挑取2环菌体 到装有40mL种子培养基的250 mL的三角瓶中，种子培养基于25 。C恒温振荡摇床中，150 r/min振荡培养24 h，取样测种子液菌体浓度，稀释20倍后OD66o=0.404，得到符合要求的 酿酒酵母种子液。用无菌移液管吸取此种子液3 mL到装有27mL转化培养基的250mL的三 角瓶中，再分别加入0.30g (10g/L)的L-苯丙氨酸和10mL的油酸，三角瓶于25。C恒温振 荡摇床中，200 r/min振荡转化培养24 h。转化培养结束后，将40mL的油酸和培养基混合的转化反应液于50mL离心管中，于大 容量离心机中5000r/min离心20min，两相转化反应液分为三层，即上层的为油酸相、中层 的培养基相和下层的酵母菌体，将油酸相和培养基相分别移出，用于2-苯乙醇浓度分析。离 心管中的残留的沉积菌体用50%的丙酮水溶液洗涤并离心，重复两次，105'C烘至恒重称菌体 干重，菌体干重达到15.83 g/L。2-苯乙醇浓度分析采用高效液相色谱法高效液相色谱为岛津LC-10AT型，SPD-10A紫 外检测器，色谱柱为Alltimad8柱(4.6mmx250mm， 5nm)，流动相为甲醇:水=50:50，流速 lmL/min，检测波长260nm。含2-苯乙醇的油酸相样品用无水乙醇稀释5倍，经0.45pm微 孔滤膜过滤得样品l，进行液相分析，进样量10pL，液相色谱图见附图3。培养基相样品无 需稀释，经0.45pm微孔滤膜过滤得样品2，进行液相分析，进样量10pL，液相色谱图见附 图4。经液相色谱分析，在此条件下进行原位产物分离法生物转化生产天然2-苯乙醇，油酸中 的2-苯乙醇浓度达到12.84 g/L，水相培养基中的2-苯乙醇浓度达到1.48 g/L， L-苯乙醇转化 为2-苯乙醇的总摩尔转化率为0.78。上述所有接种过程均按无菌操作要求进行。实施例2本实施例的培养基配方为 斜面培养基葡萄糖20g/L，蛋白胨10g/L，酵母浸出粉5g/L，琼脂20g/L，溶剂为 水，pH自然，12rC高压蒸汽灭菌20min。种子培养基葡萄糖顆g/L、蛋白胨20g/L、酵母浸出粉10g/L，溶剂为水，pH自然，， 121°C高压蒸汽灭菌20 min。转化培养基蔗糖I幼g/L，酵母浸出粉&0 g/L， KH2P04 7.5 g/L， K2HP04'3H20 12.6 g/L， MgS047H20 0.5 g/L，溶剂为水，pH自然，121'C高压蒸汽灭菌20min。先将冰箱保存的酿酒酵母斜面菌种挑取一满环菌体，接种于新鲜斜面培养基，斜面于30°C 生化培养箱中培养基24h，得活化的酿酒酵母菌株斜面。从活化的菌种斜面中挑取2环菌体 到装有50 mL种子培养基的250 mL的三角瓶中，种子培养基于30 r恒温振荡摇床中，250 r/min振荡培养24 h，取样测种子液菌体浓度，稀释20倍后OD66Q=0，5^，得到符合要求的 酿酒酵母种子液。用无菌移液管吸取此种子液3 mL到装有27mL转化培养基的250 mL的三 角瓶中，再分别加入0.42g (14g/L)的L-苯丙氨酸和10mL的油酸，三角瓶于，0。C恒温振 荡摇床中，250r/min振荡转化培养18h。转化培养结束后，将40mL的油酸和培养基混合的转化反应液于50mL离心管中，于大 容量离心机中5000r/min离心20min，两相转化反应液分为三层，即上层的为油酸相、中层 的培养基相和下层的酵母菌体，将油酸相和培养基相分别移出，用于2-苯乙醇浓度分析。离 心管中的残留的沉积菌体用50%的丙酮水溶液洗涤并离心，重复两次，105'C烘至恒重称菌体 干重，菌体干重达到17.23 g/L。按实施例l方法制备液相色谱分析样品，样品经液相色谱分析后计算得出，，在此条件下 进行原位产物分离法生物转化生产天然2-苯乙醇，油酸中的2-苯乙醇浓度达到14.73 g/L，水 相培养基中的2-苯乙醇浓度达到1.67 g/L， L-苯乙醇转化为2-苯乙醇的总摩尔转化率为0.64。上述所有接种过程均按无菌操作要求进行。 实施例3本实施例的培养基配方为斜面培养基葡萄糖10g/L，蛋白胨5g/L，酵母浸出粉3g/L，琼脂15g/L，溶剂为水， pH自然，12rC高压蒸汽灭菌20min。种子培养基葡萄糖20g/L、蛋白胨10g/L、酵母浸出粉5g/L，溶剂为水，pH自然， 一级种子培养基和二级种子培养基组成相同，12rC高压蒸汽灭菌20min。转化培养基的组成为蔗糖120g/L，酵母浸出粉6.0g/L， KH2P04 7.5 g/L， K2HP04'3H20 12.6 g/L， MgSO4'7H2O0.5g/L，溶剂为水，pH自然，121。C高压蒸汽灭菌30min。将冰箱保存的酿酒酵母斜面菌种挑取一满环菌体，接种于新鲜斜面培养基，斜面于3(TC 生化培养箱中培养基24h，得活化的酿酒酵母菌株斜面。从活化的菌种斜面中挑取2环菌体 到装有50 mL种子培养基的250 mL的三角瓶中，于30'C恒温振荡摇床中，200 r/min振荡培 养20h，取样测种子液菌体浓度，稀释20倍后0066()=0.473，得到符合要求的一级酿酒酵母 种子液。用无菌移液管吸取一级种子液5 mL到装有100 mL种子培养基的500 mL的三角瓶 中，于3(TC恒温振荡摇床中，250 r/min振荡培养20 h，取样测二级种子液菌体浓度，稀释 20倍后OD66()=0.494，制备得符合要求的二级酿酒酵母种子液300 mL。将制备的二级酿酒酵母种子液300 mL接种到装有2.7 L的转化培养基(其中的成分按3.0 L用量称取)成分的5 L发酵罐(机械搅拌通风型)中。接种后，加入42 g (14g/L)的L-苯丙氨酸和1L油酸。搅拌并通入空气，发酵罐温度控制在3(TC，发酵初期，发酵罐的通气 量初期为0.6 V/V*min，搅拌转速500 r/min。当培养基溶氧水平下降时，通过调节通气量和搅 拌速度控制发酵液中的溶液水平不低于60%,发酵液pH无需控制，转化培养18h结束。转化培养结束后，用大容量离心机对上述转化发酵得到的4 L含2-苯乙醇的油酸/培养基 混合物，进行4000 r/min离心20 min，最后分别收集得1.0 L的油酸相和3.0 L的培养基相， 按实施例l方法制备液相色谱分析样品，样品经液相色谱分析后计算得出，在5L机械搅拌 通风型发酵罐中，以体积与转化培养基体积比1:3的油酸为萃取溶剂，进行原位产物分离法 生物转化生产天然2-苯乙醇，油酸中的2-苯乙醇浓度达到14.48 g/L，水相培养基中的2-苯乙 醇浓度达到1.65 g/L，总摩尔转化率为0.63。实施例4本实施例的培养基配方为斜面培养基葡萄糖20g/L，蛋白胨10g/L，酵母浸出粉5g/L，琼脂20g/L，溶剂为 水，pH自然，12rC高压蒸汽灭菌20min。种子培养基葡萄糖40g/L、蛋白胨20g/L、酵母浸出粉10g/L，溶剂为水，pH自然， 一级种子培养基和二级种子培养基组成成分相同，12rC高压蒸汽灭菌20min。转化培养基的组成为蔗糖140g/L，酵母浸出粉7.5g/L， KH2P04 7.5 g/L， K2HPO(3H20 12.6 g/L， MgSO4'7H2O0.5g/L，溶剂为水，pH自然，121。C高压蒸汽灭菌30min。将冰箱保存的酿酒酵母斜面菌种挑取一满环菌体，接种于新鲜斜面培养基，斜面于3(TC
生化培养箱中培养基36h，得活化的酿酒酵母菌株斜面。从活化的菌种斜面中挑取2环菌体 到装有50mL种子培养基的250mL的三角瓶中，于30。C恒温振荡摇床中，200r/min振荡培 养24h，取样测种子液菌体浓度，稀释20倍后0066。=0.528，得到符合要求的一级酿酒酵母 种子液。用无菌移液管吸取一级种子液5 mL到装有100 mL种子培养基的500 mL的三角瓶 中，于3CTC恒温振荡摇床中，250 r/min振荡培养24 h，取样测二级种子液菌体浓度，稀释 20倍后OD66。=0.583，制备得符合要求的二级酿酒酵母种子液200 mL。将制备的二级酿酒酵母种子液200 mL接种到装有1.8 L的转化培养基(其中的成分按2.0 L用量称取)成分的5L发酵罐(机械搅拌通风型)中。接种后，加入40g (20g/L)的L-苯丙氨酸和2L油酸。搅拌并通入空气，发酵罐温度控制在3(TC，发酵初期，发酵罐的通气 量初期为0.8V/VTiiin，搅拌转速600 r/min。当溶氧水平下降时，通过调节通气量和搅拌速度 控制发酵液中的溶液水平不低于60%，发酵液pH无需控制，转化培养24h结束。转化培养结束后，用大容量离心机对上述转化发酵得到的4 L含2-苯乙醇的油酸/培养基 混合物，进行4000 r/min离心20 min，最后分别收集得2.0 L的油酸相和2.0 L的培养基相， 按实施例l方法制备液相色谱分析样品，样品经液相色谱分析后计算得出，在5 L机械搅拌 通风型发酵罐中，以体积与转化培养基体积比1:1的油酸为萃取溶剂，进行原位产物分离法 生物转化生产天然2-苯乙醇，油酸中的2-苯乙醇浓度达到10.73 g/L，水相培养基中的2-苯乙 醇浓度达到1.21 g/L，总摩尔转化率为0.81。实施例5本实施例的培养基配方为斜面培养基葡萄糖10g/L，蛋白胨5g/L，酵母浸出粉3g/L，琼脂15g/L，溶剂为水， pH自然，121'C高压蒸汽灭菌20min。种子培养基葡萄糖20g/L、蛋白胨10g/L、酵母浸出粉5g/L，溶剂为水，pH自然， 一级种子培养基和二级种子培养基组成成分相同，121°C高压蒸汽灭菌20 min。转化培养基的组成为蔗糖120g/L，酵母浸出粉6.0g/L， KH2P04 7.5 g/L， K2HP(V3H20 12.6 g/L, MgS(V7H20 0.5 g/L，溶剂为水，pH自然，121。C高压蒸汽灭菌30 min。将冰箱保存的酿酒酵母斜面菌种挑取一满环菌体，接种于新鲜斜面培养基，斜面于3(TC 生化培养箱中培养基24h，得活化的酿酒酵母菌株斜面。从活化的菌种斜面中挑取2环菌体 到装有50 mL种子培养基的250 mL的三角瓶中，于30。C恒温振荡摇床中，200 r/min振荡培
养20h，取样测种子液菌体浓度，稀释20倍后0066()=0.469，得到符合要求的一级酿酒酵母 种子液。用无菌移液管吸取一级种子液5 mL到装有100 mL种子培养基的500 mL的三角瓶 中，于3(TC恒温振荡摇床中，250 r/min振荡培养20 h，取样测二级种子液菌体浓度，稀释 20倍后OD66。=0.477，制备得符合要求的二级酿酒酵母种子液300 mL。将制备的二级酿酒酵母种子液300 mL接种到装有2.7 L的转化培养基(其中的成分按3.0 L用量称取)成分的5 L发酵罐(机械搅拌通风型)中。接种后，加入45 g (15 g/L)的L-苯丙氨酸和l.OL聚丙二醇，聚丙二醇的聚合度为1500。搅拌并通入空气，发酵罐温度控制 在3(TC，发酵初期，发酵罐的通气量初期为0.6 V/V*min，搅拌转速400 r/min。当溶氧水平 下降时，通过调节通气量和搅拌速度控制发酵液中的溶液水平不低于60%，发酵液pH无需 控制，转化培养18h结束。转化培养结束后，用大容量离心机对上述转化发酵得到的4 L含2-苯乙醇的聚丙二醇/培 养基的混合物，进行4000 r/min离心20 min，最后分别收集得1.0 L聚丙二醇相和3.0 L的培 养基相，按实施例1方法制备液相色谱分析样品。样品经液相色谱分析后计算得出，在5 L 机械搅拌通风型发酵罐中，以体积与转化培养基体积比1:3的聚丙二醇为萃取溶剂，进行原 位产物分离法生物转化生产天然2-苯乙醇，聚丙二醇中的2-苯乙醇浓度达到22.67 g/L，水相 培养基中的2-苯乙醇浓度达到0.40 g/L，总摩尔转化率为0.72。实施例6本实施例的培养基配方为斜面培养基葡萄糖20g/L，蛋白胨10g/L，酵母浸出粉5g/L，琼脂20g/L，溶剂为 水，pH自然，12rC高压蒸汽灭菌20min。种子培养基葡萄糖40g/L、蛋白胨20g/L、酵母浸出粉10g/L，溶剂为水，pH自然， 一级种子培养基和二级种子培养基组成成分相同，12rC高压蒸汽灭菌20min。转化培养基的组成为蔗糖140g/L，酵母浸出粉7.5g/L， KH2P04 7.5 g/L， K2HP04'3H20 12.6 g/L， MgS(V7H20 0.5 g/L，溶剂为水，pH自然，121'C高压蒸汽灭菌30min。将冰箱保存的酿酒酵母斜面菌种挑取一满环菌体，接种于新鲜斜面培养基，斜面于3(TC 生化培养箱中培养基36h，得活化的酿酒酵母菌株斜面。从活化的菌种斜面中挑取2环菌体 到装有50mL种子培养基的250mL的三角瓶中，于30'C恒温振荡摇床中，200r/min振荡培 养24h，取样测种子液菌体浓度，稀释20倍后OD66o二0.514，得到符合要求的一级酿酒酵母 种子液。用无菌移液管吸取一级种子液5 mL到装有100 mL种子培养基的500 mL的三角瓶 中，于3(TC恒温振荡摇床中，250 r/min振荡培养24 h，取样测二级种子液菌体浓度，稀释 20倍后OD66()=0592，制备得符合要求的二级酿酒酵母种子液200 mL。将制备的二级酿酒酵母种子液200 mL接种到装有1.8 L的转化培养基(其中的成分按2.0 L用量称取)成分的5L发酵罐(机械搅拌通风型)中。接种后，加入40g (20g/L)的L-苯丙氨酸和1.0L聚丙二醇，聚丙二醇的聚合度为1500。搅拌并通入空气，发酵罐温度控制 在3(TC，发酵初期，发酵罐的通气量初期为0.8 V/V，min，搅拌转速500 r/min。当溶氧水平 下降时，通过调节通气量和搅拌速度控制发酵液中的溶液水平不低于60%，发酵液pH无需 控制，转化培养24h结束。转化培养结束后，用大容量离心机对上述转化发酵得到的4 L含2-苯乙醇的聚丙二醇/培 养基的混合物，进行4000 r/min离心20 min，最后分别收集得2.0 L聚丙二醇相和2.0 L的培 养基相，按实施例1方法制备液相色谱分析样品。样品经液相色谱分析后计算得出，在5 L 机械搅拌通风型发酵罐中，以体积与转化培养基体积比1:1的聚丙二醇为萃取溶剂，进行原 位产物分离法生物转化生产天然2-苯乙醇，聚丙二醇中的2-苯乙醇浓度达到12.85 g/L，水相 培养基中的2-苯乙醇浓度达到0.20 g/L，总摩尔转化率为0.88。实施例7取实施例3制备的油酸相500mL，用于2-苯乙醇的提取分离。因2-苯乙醇的沸点低于油 酸，采用减压蒸馏法从有机溶剂相中提取2-苯乙醇，收集馏分得2-苯乙醇。采用此法得2-苯 乙醇成品6.93 g，经液相色谱检测，纯度为95.3%，有机溶剂相中的2-苯乙醇回收率为91.2%。取实施例3制备的培养基相500 mL，采用有机溶剂萃取法提取其中的2-苯乙醇，方法是: 将500mL的上述培养基相置于分液漏斗中，加入500mL的乙酸乙酯，分液漏斗充分振荡后 静置12 h，下层的培养基相弃去，将剩余的乙酸乙酯部分转移到旋转蒸发仪的蒸发瓶中，45°C 水浴中减压旋转蒸发至无乙酸乙酯流出，蒸发瓶中剩余部分即为2-苯乙醇。采用此法得2-苯 乙醇0.88 g成品，成品经液相色谱分析，纯度为88.7%，培养基相中的2-苯乙醇回收率为 94.6%。取实施例5制备的聚丙二醇相500mL，用于2-苯乙醇的提取分离。采用减压蒸馏法从有 机溶剂相中提取2-苯乙醇，收集馏分得2-苯乙醇。采用此法得2-苯乙醇10.53 g成品，经液 相色谱检测，纯度为96.3%，有机溶剂相中的2-苯乙醇回收率为89.5%。实施例4制备的培 养基相中的2-苯乙醇浓度较低，不做提取分离。
权利要求
1.一种天然2-苯乙醇的制备方法，其特征在于该方法为以酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)经过扩大培养的种子液为生物催化剂，所述的种子液接种于转化培养基，再加入酶催化法或微生物发酵法生产的L-苯丙氨酸为底物，在有机溶剂存在的条件下进行摇床振荡或通气搅拌转化，温度控制在25～30℃，转化18～24h，转化液后处理得到天然2-苯乙醇，所述的L-苯丙氨酸加入浓度以培养基体积计为10～20g/L，所述的有机溶剂为油酸或聚丙二醇。
2. 如权利要求1所述天然2-苯乙醇的制备方法，其特征在于所述种子液接种于转化培养基 的接种量为5~10%体积比，所述的种子液菌体浓度为稀释20倍后OD66o=0.4-0.6。
3. 如权利要求1所述天然2-苯乙醇的制备方法，其特征在于所述转化培养基组成为蔗糖 100~140 g/L，酵母浸出粉5.0~7.5 g/L， KH2P04 7.5 g/L， K2HP04'3H20 12.6 g/L, MgS04'7H20 0.5 g/L，溶剂为水，pH自然。
4. 如权利要求1所述天然2-苯乙醇的制备方法，其特征在于所述有机溶剂的体积用量与转 化培养基体积比为1:1~3。
5. 如权利要求1所述天然2-苯乙醇的制备方法，其特征在于所述酿酒酵母是安琪酒精活性 干酵母经分离纯化而获得，所述的分离纯化采用平板定向筛选法，即在平板培养基中加 入3g/L的2-苯乙醇作为定向筛选的压力，抑制对2-苯乙醇耐受性差的菌株生长，选出用 于2-苯乙醇生物转化合成的酿酒酵母。
6. 如权利要求1所述天然2-苯乙醇的制备方法，其特征在于所述转化液后处理方法如下 先以4000r/min 5000r/min转速离心，使两相体系从上到下分为有机溶剂相、培养基相和 酵母菌体三层，有机溶剂相中的2-苯乙醇采用减压蒸馏法分离，收集馏分得2-苯乙醇； 培养基相中的2-苯乙醇采用有机溶剂萃取制得萃取液，萃取液减压蒸馏除去有机溶剂， 得所述的2-苯乙醇，所述的有机溶剂为乙酸乙酯或乙酸丁酯。
7. 如权利要求1所述天然2-苯乙醇的制备方法，其特征在于所述种子液按如下步骤制备得 至U:将酿酒酵母接种至斜面培养基，经活化培养得到斜面活化菌种，斜面活化菌种再接 种至液体种子培养基，经过种子培养得到所述的酿酒酵母种子液。
8. 如权利要求7所述天然2-苯乙醇的制备方法，其特征在于所述斜面活化培养方法为将 酿酒酵母接种于斜面培养基，于25 30'C的恒温培养24 36h得斜面活化菌种，所述斜面 培养基组成为葡萄糖10-20 g/L，蛋白胨5~10 g/L，酵母浸出粉3~5 g/L，琼脂15~20 g/L， 溶剂为水，pH自然。
9. 如权利要求7所述天然2-苯乙醇的制备方法，其特征在于所述种子培养方法为在无菌 条件下用接种环挑取2~3环经斜面活化培养得到菌种到一级种子培养基中，于25 3(TC旋 转振荡培养箱中，150~250 r/min振荡培养18~24 h，获得一级种子液；再按5~10%体积 比的接种量，将一级种子液接种至二级种子培养基于25 3(TC下、150-250 r/min振荡培 养20 24h，得酿酒酵母种子液。所述一级种子培养基或二级种子培养基组成为葡萄糖 20-40 g/L、蛋白胨10 20g/L、酵母浸出粉5~10 g/L，溶剂为水，pH自然；
10. 如权利要求l所述的天然2-苯乙醇制备方法，其特征在于所述方法按如下顺序步骤进行(1) 斜面培养将酿酒酵母接种于斜面培养基，于25 30。C的恒温培养24~36h，获得 斜面活化菌种；斜面培养基组成为葡萄糖10 20g/L，蛋白胨5 10g/L，酵母浸 出粉3~5g/L，琼脂15 20g/L，溶剂为水，pH自然；(2) 种子扩大培养无菌条件下，以2 3环/40 50mL培养基的接种量，将斜面活化菌 种接种至种子培养基，于25 3(TC下、150~250 r/min振荡培养20 24h，获得一级 种子液；再按5~10%体积比的接种量，将一级种子液接种至二级种子培养基于 25-30。C下、150 250 r/min振荡培养20 24h，得酿酒酵母种子液，所述一级种子 培养基或二级种子培养基组成为葡萄糖20-40 g/L、蛋白胨10 20g/L、酵母浸出 粉5 10g/L，溶剂为水，pH自然；(3) 转化发酵以步骤(2)制备的酿酒酵母种子液为生物催化剂，按5~10%体积比的 接种量接种于转化培养基，再加入酶催化法或微生物发酵法生产的L-苯丙氨酸为 底物，在有机溶剂存在的条件下进行摇床振荡或通气搅拌转化，温度控制在 25~30°C，转化18-24h结束，得到含2-苯乙醇的有机溶剂冰的两相体系，所述的 L-苯丙氨酸加入浓度以培养基体积计为10~20 g/L，转化培养基的组成为蔗糖 100~140g/L，酵母浸出粉5.0~7.5g/L， KH2P04 7.5 g/L， K2HP04.3H20 12.6 g/L， MgSCV7H20 0.5 g/L，溶剂为水，pH自然；所述有机溶剂的体积用量与转化培养 基体积比为1:1 3;(4) 发酵液预处理将含2-苯乙醇的有机溶剂/水的两相体系离心，使两相体系分为有 机溶剂相、培养基相和酵母菌体三层，将上层的有机溶剂相和中层的培养基相分 别移出，用于2-苯乙醇的提取分离；(5) 2-苯乙醇的提取分离有机溶剂相中的2-苯乙醇采用减压蒸馏法进行分离，收集馏分得2-苯乙醇；培养基相中的2-苯乙醇采用有机溶剂萃取制得萃取液，萃取液减压蒸馏除去有机溶剂，得2-苯乙醇，所述的有机溶剂为乙酸乙酯或乙酸丁酯。
全文摘要
本发明涉及一种生产天然2-苯乙醇的方法，以酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)为生物催化剂，接种于转化培养基，再加入酶催化法或微生物发酵法生产的L-苯丙氨酸为底物，在有机溶剂存在的条件下进行摇床振荡或通气搅拌转化，温度控制在25～30℃，转化18～24h，转化液后处理得到天然2-苯乙醇，所述的L-苯丙氨酸的加入浓度以水相计为10～20g/L，所述的有机溶剂为油酸或聚丙二醇。本发明把2-苯乙醇的转化合成和萃取分离耦合起来，可大规模工业化应用，生产的2-苯乙醇气味纯正，属天然产品，生产过程具有周期短，转化率高，环境污染小等优点。
文档编号C12P7/22GK101157940SQ20071007151
公开日2008年4月9日 申请日期2007年9月21日 优先权日2007年9月21日
发明者应国清, 喻 易, 梅建凤, 鸿 王, 虹 陈, 陈建澍 申请人:浙江工业大学