专利名称：肿瘤靶向性腺相关病毒载体的构建和应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术和基因治疗领域，具体地说，是涉及一种特异性在肿瘤细胞内表 达的靶向性腺相关病毒载体rAAV-hTERT-hTRAIL及其构建方法和应用。
背景技术：
对于大多数种类的癌症，目前仍然采用的是传统疗法如外科手术、放疗、化疗等，而 面对很多中晚期恶性肿瘤，传统疗法显得束手无策，主要表现在治愈率低、复发率及死亡 率高、预后较差。基因治疗是通过改造基因来治疗疾病的一种生物高技术方案，人们对肿 瘤的基因治疗寄寓极高的热情，66%的基因治疗临床试验均用于肿瘤治疗。到目前为止， 肿瘤的基因治疗研究己取得了重要进展；对于恶性肿瘤，基因治疗可利用肿瘤细胞与正常
细胞间分子水平的差异，显著拓宽肿瘤的"治疗窗"，能高效地、选择性地杀伤肿瘤细胞或 阻止肿瘤细胞生长以及防止肿瘤的转移。
然而经过十多年600多个临床试验方案发现，尽管基因治疗是非常安全的，但其抗肿 瘤效应却非常低，有的甚至无任何治疗作用，这主要是现阶段基因治疗载体的问题。目前 的载体系统在人体内既不能特异性地转染所有的肿瘤细胞，也不能使治疗基因在肿瘤内高 效表达，而且肿瘤的发生是包含多种基因改变的多步骤过程，通过单一基因的修饰很难彻 底消灭肿瘤。这一系列问题严重阻碍着肿瘤基因治疗的临床疗效。因此研制高效、耙向转 染肿瘤细胞的载体系统对目前肿瘤的基因治疗至关重要。
在目前被广泛应用的基因治疗载体中，病毒载体包括腺病毒(adenovirus， Ad)、腺相关 病毒(adeno-associated virus,AAV)、逆转录病毒(retrovirus)和慢病毒(lentivirus)等最为常用。 AAV由于具备以下特性而引人注目。第一，AAV引起的免疫反应轻微，病源性低，至今 未有报道其引起人类任何疾病；第二，作为一种缺陷型病毒，在无辅助病毒感染时，只能 整合在宿主细胞DNA中，呈"潜伏"感染状态；第三，可定点整合，AAV是唯一一种以位 点特异性方式整合在人19号染色体上的真核病毒，从而避免随机整合而导致宿主细胞突 变的潜在危险性；第四，宿主范围广，包括分裂期细胞和非分裂期细胞；第五，携带的外 源基因可长期、稳定表达。因此，AAV成为目前基因转移最为理想的载体之一。然而，由
于AAV2广泛的宿主范围和组织或细胞特异性的缺乏，使得其作为载体用于临床前和临床 治疗试验时依然存在安全性、靶向性和转染效率低的弊端。因此，在AAV2成功用于肿瘤 治疗的研究中，为了达到最大肿瘤杀伤效率和最小的细胞毒性，必须尽力克服这些问题， 寻求AAV2载体介导肿瘤治疗的最佳靶向策略。
近来，以病毒治疗恶性肿瘤成了科学研究的热点，且取得了新的突破。最近临床实验 使用的几种病毒，如腺病毒ONYX-015、 CV706，单纯疱疹病毒G207和G1716以及逆转 录病毒和腺相关病毒等，治疗效果令人鼓舞。这些病毒有的能够选择性的在肿瘤细胞中复 制、增殖，杀死肿瘤细胞，释放出来的子代病毒扩散到临近的肿瘤细胞，在肿瘤组织内引 起一种链式反应，最终消灭全部肿瘤，而在正常细胞中不复制；有的进入体内后能够使介 导的治疗基因特异性的在肿瘤细胞内表达，而在正常细胞中不表达；还有的病毒自身蛋白 具有阻止肿瘤细胞周期进行、抑制肿瘤细胞增殖及防止肿瘤发生的作用。
实施肿瘤的靶向性基因治疗，首先要构建能够介导治疗基因特异性的在肿瘤细胞中表 达、而对正常细胞无损害的病毒。因此，需要对腺相关病毒载体进行改造，利用肿瘤特异 性启动子控制病毒所携带的治疗基因，从而使治疗基因只在肿瘤细胞内特异性表达，而对 正常细胞无损害；从而提高基因治疗的靶向性和疗效，使腺相关病毒载体能更有效安全的 应用于临床。
利用肿瘤特异性启动子控制病毒所携带的治疗基因是构建肿瘤靶向性腺相关病毒的 方法之一，其能使治疗基因只能在肿瘤细胞内表达，而在正常细胞中不表达，从而大大降 低了肿瘤基因治疗的副反应而增强了其靶向性和疗效。近年研究表明，端粒酶可能是迄今 发现的一个最为广泛的肿瘤新标志物，在细胞永生化和肿瘤发生发展过程中起重要作用。 在生理条件下，正常细胞大都没有端粒酶活性；而在85-90%左右的肿瘤细胞中端粒酶活性 高。并且其活性高低与肿瘤的恶性程度相关，提示端粒酶可以作为肿瘤治疗的很好的耙点。 端粒酶逆转录酶，即hTERT(human telomerase reverse transcriptase),是端粒酶复合物的核 心成分，其表达状态与端粒酶活性显著相关，是细胞调控端粒酶活性的关键环节。hTERT 基因的表达主要是从转录水平上调节，在90%左右的肿瘤细胞中转录上调，而在静息期细 胞中不转录。因此，hTERT启动子被用来控制外源基因的表达，可望提高肿瘤基因治疗的 靶向性。
人类肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体(human TNF-related ap叩tosis-inducing ligand, hTRAIL)是新近发现的肿瘤坏死因子(Tumor necrosis factor, TNF)家族成员。TRAIL通过特
异性受体途径发挥作用，能够选择性地诱导多种肿瘤细胞凋亡，但不影响正常体细胞的生 长分化。其受体的表达及分布特征决定了它对肿瘤细胞具有选择性杀伤作用。与TNF家族 其他成员相比，TRAIL在体内仅以膜结合型存在。体外实验表明，膜结合型TRAIL,能迅 速诱导表达TRAIL特异受体的细胞发生凋亡。许多动物实验表明，TRAIL对淋巴瘤、乳 腺癌、肝癌和结肠癌等肿瘤模型具有减少肿瘤早期发生率、抑制肿瘤生长和提高存活率作 用，并且与传统的放疗、化疗有协同作用，有可能成为一种新型抗肿瘤药物。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种肿瘤耙向性腺相关病毒载体系统的构建方法和
应用，采用该方法能构建出安全、高效的肿瘤靶向性腺相关病毒。
为了解决上述技术问题，本发明提供一种肿瘤靶向性腺相关病毒载体系统
rAAV-hTERT-gene的构建方法用肿瘤特异性hTERT启动子控制腺相关病毒所携带的外源
基因表达，构建成具有肿瘤靶向性、且可任意插入一种具有抗癌作用治疗基因的腺相关病
毒载体系统rAAV-hTERT-gene 。
作为本发明的上述构建方法的改进，该方法包括以下步骤
1) 、设计hTERT启动子两端特异性引物，用PCR方法，以人肝癌细胞株SMMC-7721 的DNA基因组为模板，所得的PCR产物为hTERT启动子一378 + 78nt序歹ij;如SEQ ID NO: l所示；
2) 、用限制性内切酶将腺相关病毒载体pAAV-MCS的启动子CMV去掉，并替换成 上述hTERT启动子，得到肿瘤靶向性腺相关病毒载体pAAV-hTERT-gene;
3) 、利用腺相关病毒重组系统，pAAV-hTERT-gene、 pAAV-RC和pHelper三质粒共转 染AAV293细胞，得到肿瘤靶向性腺相关病毒载体系统rAAV-hTERT-gene。
本发明还提供了按照上述方法构建的肿瘤靶向性腺相关病毒rAAV-hTERT-hTRAIL，该 病毒为肿瘤靶向性腺相关病毒载体系统rAAV-hTERT-gene携带具有广泛选择性抗肿瘤活性 的hTRAIL基因(即人TRAIL基因)。
本发明还提供了上述肿瘤靶向性腺相关病毒rAAV-hTERT-hTRAIL的构建方法，包括 以下步骤
1 )、设计hTRAIL基因两端特异性引物，在其上设计特异限制性内切酶位点便于克隆， 应用RT-PCR的方法从健康人外周血克隆出全长人hTRAIL基因； '
2)、 将hTRAIL基因克隆入pAAV-hTERT-gene中，得到含hTRAIL基因的载体
pAAV-hTERT-hTRAIL;
3)、 利用腺相关病毒重组系统，pAAV-hTERT-hTRAIL、 pAAV-RC和pHelper三质粒 共转染AAV293细胞，得到肿瘤靶向性重组病毒rAAV-hTERT-hTRAIL。
由于hTERT启动子是一个广泛的肿瘤特异性启动子，能够使外源基因的表达限制在 肿瘤细胞中，因此在本发明中，将hTERT启动子设定为构建肿瘤特异性腺相关病毒的优秀 候选启动子。本发明采用基因克隆的方法改造2型腺相关病毒载体(AAV2)，用hTERT 启动子取代CMV启动子，构建了一个新的肿瘤靶向性腺相关病毒载体系统 rAAV-hTERT-gene，此系统能够介导治疗基因在肿瘤细胞中特异性高效表达，而在正常细 胞中不表达，从而杀伤肿瘤细胞。
本发明利用具有选择性抗肿瘤作用的人TRAIL基因作为治疗基因，在肿瘤靶向载体
系统rAAV-hTERT-gene的携带下，综合两者的优点，构建了重组病毒rAAV-hTERT-hTRAIL。
经研究证实，该方法能很大程度提高腺相关病毒的靶向性，从而提高腺相关病毒载体和基
因治疗的安全性，为能够在临床上安全使用打下基础。
本发明的目的在于将肿瘤特异性hTERT启动子的耙向性和腺相关病毒的高效性两者
的优势结合起来，调控治疗基因的表达，从而提供一种更安全、高效的肿瘤靶向性腺相关
病毒载体系统即rAAV-hTERT-gene系统。本发明的另一个目的在于将肿瘤特异性hTERT
启动子的靶向性和hTRAIL肿瘤治疗的高效性两者优势结合在起来，从而提供一种更安全、
高效的肿瘤耙向性腺相关病毒rAAV-hTERT-hTRAIL用于治疗肿瘤的用途。
本发明的rAAV-hTERT-gene系统可以携带治疗基因，以达到更安全、高效地治疗肿瘤 的目的，因此能作为一种更有效更安全的基因治疗载体平台；本发明的肿瘤靶向性腺相关 病毒rAAV-hTERT-hTRAIL具有肿瘤靶向性和肿瘤治疗作用，能作为一种肿瘤耙向性基因 治疗试剂，可以用于开发有效治疗肿瘤的抗癌新药。
综上所述，本发明具有如下有益效果
1、 本发明有机地结合了肿瘤特异性启动子hTERT的靶向性和治疗基因hTRAIL的高 效性及腺相关病毒载体的特异性，进一步提高了肿瘤基因治疗的靶向性、安全性和高效性， 可以用于治疗多种恶性肿瘤；
2、 本发明提供了一种肿瘤靶向性腺相关病毒基因治疗载体系统rAAV-hTERT-gene 系统，该系统可以携带各种治疗基因，更安全、高效；
3、 本发明提供了 hTRAIL治疗基因在肿瘤靶向性腺相关病毒载体系统的介导下用于 治疗肿瘤的高效性； 4、本发明构建的肿瘤靶向性腺相关病毒rAAV-hTERT-hTRAIL，具有很高的耙向性和 疗效，经细胞实验和动物试验证明能选择性的杀死肿瘤细胞，而对正常细胞几乎没有毒性； 能有效地抑制荷瘤裸鼠的肿瘤生长，为治疗癌症提供了一个优良的新型技术平台和侯选抗 癌新药，为今后的肿瘤基因治疗打下坚实的基础。
下面结合附图对本发明的具体实施方式
作进一步详细说明。
图1为hTERT启动子控制的携带hTRAIL基因的AAV载体及对照病毒载体(即 rAAV-hTERT-hTRAIL和rAAV-hTERT-EGFP)的构造简图；其中hTERT启动子控制治疗基 因的表达；
图2为本发明的肿瘤靶向性腺相关病毒载体rAAV-hTERT-hTRAIL和对照载体 rAAV-hTERT-EGFP的SDS-PAGE电泳鉴定示意图；图中1代表rAAV-hTERT-EGFP, 2 代表rAAV-hTERT-hTRAIL; M代表Protein Marker;
图3为rAAV-hTERT-EGFP感染不同细胞株后荧光显微镜下观察绿色荧光的表达图。 图中a为正常细胞株L02; b、c、d均为肿瘤细胞株，其中b为SMMC-7721 ， c为SGC-7901 ， d为A549;
图4为rAAV-hTERT-hTRAIL体外对肿瘤细胞的特异性杀伤效应图5为细胞凋亡的流式细胞仪检测图。肝癌细胞株SMMC-7721被等量的治疗病毒
rAAV-hTERT-hTRAIL和对照病毒rAAV-hTERT-EGFP感染三天后，PI染色后通过FACS检
测其凋亡的亚二倍体峰；图中a为PBS对照，b为rAAV-hTERT-EGFP感染，c为
rAAV-hTERT-hTRAIL感染；
图6为肿瘤靶向性腺相关病毒rAAV-hTERT-hTRAIL在裸鼠体内治疗肝癌细胞移植瘤
的结果示意图。
具体实施例方式
以下结合具体实施例对本发明作进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明 而不用于限定本发明的范围。
实施例1 、 肿瘤靶向性腺相关病毒rAAV-hTERT-hTRAIL及对照病毒 rAAV-hTERT-EGFP的构造
1、设计引物 hTERT:
sense: 5，- TGGCCCCTCCCTCGGGTTAC -3，
antisense(EcoR I): 5，-CCCGAATTCCGCGGGGGTGGCCGGGGCCA -3' hTRAIL:
sense(EcoR I): 5，- CTCGAATTC ATGGCTATGATGGAGGTCCAG-3' antisense(Hind III): 5'隱CCTAAGCTTCAGGTC AGTTAGCCAACTAA-3'
EGFP:
sense(EcoR I): 5,-CTCGAATTC ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAG-3， antisense(Hind III): 5,-CCTAAGCTTTTATCTAGATCCGGTGGATC-3，
2、相关质粒的构建
一、 pAAV-hTERT-hTRAIL的构建
1) 、利用上述hTERT启动子两端特异性引物5'-GCTCCCAGTGGATTCGCG-3'(sense) 和5，- CCCGAATTCCGCGGGGGTGGCCGGGGCCA -3， (antisense，含EcoR I酶切位点)， 以提取人肝癌细胞株SMMC-7721的总DNA基因组为模板，通过RT-PCR方法扩增hTERT 启动子，PCR条件94。Cxlmin， 55。Cx2min， 72°Cxlmin。所得的PCR产物为hTERT启 动子一378 +78nt序列；该序列具体如SEQ ID NO: 1所示；
2) 、用限制性内切酶SnaB I和EcoR I将腺相关病毒载体pAAV-MCS (可选用本实验 室保存的该载体质粒)的启动子CMV去掉，同时将上述l)所得到的hTERT启动子PCR 产物用EcoRI酶切，将酶切后的两种产物进行连接，即把载体启动子CMV替换成hTERT 启动子，得到肿瘤靶向性腺相关病毒载体pAAV-hTERT-gene;
3) 、利用上述hTRAIL基因两端特异性引物5，- CTCGAATTCATGGCTATGATGGA GGTCCAG-3， (sense,含EcoR I位点)和5， - CCTAAGCTTCAGGTCAGTTAGCCAAC TAA- 3 ， (antisense，含Hind III位点)，以从健康人外周血提取的基因组总DNA为模板， 通过RT-PCR方法进行扩增，PCR条件94。Cxlmin， 55T>lmin， 72°Cxlmin30s。扩增 的产物即为hTRAIL基因；
4) 、将上述2)得到的肿瘤靶向性腺相关病毒载体pAAV-hTERT-gene经EcoR I和Hind III双酶切后，与上述3)PCR产物hTRAIL基因的EcoRI和Hind III双酶切产物进行连接， 得到含hTRAIL基因的载体质粒pAAV-hTERT-hTRAIL。
二、 pAAV-hTERT-EGFP的构建
1)、 利用上述EGFP基因两端特异性引物 5，-CTCGAATTCATGGTGAGCAAGGGCGAGG AG-3'(sense ， 含EcoR I位点)和5，-CCTAAGCTTTTATCTA GATCCGGTGGATC陽3， (antisense，含Hind III位点)，以质粒 pEGFP-Cl(该质粒为本实验室保存)为模板，通过PCR方法进行扩增，PCR条件94'01min， 55'Cxlmin， 72。Cxlmin。扩增的产物即为EGFP基因；
2)、将前面已构建的肿瘤靶向性腺相关病毒载体pAAV-hTERT-gene经EcoR I和Hind III双酶切后，与经EcoR I和Hind III双酶切PCR产物EGFP基因后的片断进行连接，得 到含EGFP基因的载体质粒pAAV-hTERT-EGFP;
3、肿瘤靶向性腺相关病毒载体的构建
腺相关病毒载体的生产按照三质粒共转染方法进行，如下所述。将上述所构建的质粒
载体pAAV-hTERT-EGFP (或pAAV-hTERT-hTRAIL)与pAAV-RC和pHelper(该两种质粒 购自美国stratagene公司)以1: h 1的比例，各取10 |iig，用磷酸钙的方法转染铺于10 cm 培养皿的AAV293细胞，6小时后换液，66-72小时后收集细胞及上清，氯化铯纯化病毒， 得到的纯化病毒液分别为rAAV-hTERT-EGFP和rAAV-hTERT-hTRAIL。如图1所示为结构 图，图2所示为纯化后的病毒的纯度鉴定图。
实施例2、 hTERT启动子介导的报告基因EGFP经腺相关病毒载体携带在肿瘤细胞和 正常细胞内的特异性表达分析
细胞接种6孔板，当细胞长至70%左右时，rAAV-hTERT-EGFP以5><104/细胞感染正 常细胞L02和三种肿瘤细胞SMMC-7721、 SGC7卯1、 A549,培养2天后，在荧光显微镜 下观察绿色荧光的表达(见图3，图3为对照病毒rAAV-hTERT-EGFP转染肿瘤细胞和正 常细胞的EGFP表达量的比较图)。结果显示，rAAV-hTERT-EGFP感染能在肿瘤细胞中耙 向表达EGFP，而在正常细胞中很少有绿色荧光的表达；即hTERT启动子在正常细胞中转 录活性很低，而在肿瘤细胞中介导EGFP基因特异性高表达。
实施例3、肿瘤靶向性腺相关病毒rAAV-hTERT-hTRAIL对肿瘤细胞的杀伤能力检测
细胞经病毒处理后的存活率由MTT法检测(Cancer Research, 1989， 49(17): 4785-90)。 步骤如下将正常细胞L02和三种肿瘤细胞SMMC-7721、 SGC790K A549以每孔5000 个细胞的量分别铺于96孔板中，培养24小时后分别以5><104/细胞加入两种病毒(即 rAAV-hTERT-hTRAIL禾卩rAAV-hTERT-EGFP)感染细胞，1、 2、 3、 4、 5天后分另ij用MTT 测定细胞存活率。具体如下，将含病毒的培养液移去，换成含5mg/mlMTT的正常培养液， 培养4小时后将含MTT的培养液移去，以DMSO裂解，摇匀，然后以655nm处吸光度为 参比测定595mn处吸光度。
细胞存活率(％) =A595 (样品)/A595 (对照)xl00%。
图4显示的是MTT法检测肿瘤细胞和正常细胞经不同病毒处理后5天的存活率。结 果如图4所示，rAAV-hTERT-hTRAIL能特异性杀伤肿瘤细胞，而对正常细胞毒性很小， 具有肿瘤选择性，并且杀伤率和作用时间成正相关。对照病毒rAAV-hTERT-EGFP对正常 细胞和肿瘤细胞都没有影响。
实施例4、流式细胞仪检测肿瘤耙向性腺相关病毒rAAV-hTERT-hTRAIL感染肿瘤细 胞后的凋亡率
治疗病毒rAAV-hTERT-hTRAIL和对照病毒rAAV-hTERT-EGFP分别以1 x 104/细胞的剂 量感染SMMC-7721肿瘤细胞后，收集细胞，PBS洗一次，70%乙醇4'C固定不少于30min。 离心去乙醇，PBS洗一次，用100 |il 0.5 g/L的RNaseA37。C消化30 min。加入400 ^碘化 丙啶(PI)染液(100pg/ml碘化丙啶，1% Triton X-IOO， 150 mmol/LNaCl)作用30min， 用流式细胞仪检测细胞的凋亡百分率。
结果如图5显示，rAAV-hTERT-hTRAIL感染导致SMMC-7721产生显著的凋亡亚二倍 体峰，而对照病毒rAAV-hTERT-EGFP和PBS则很少，说明rAAV-hTERT-hTRAIL能通过 诱导肿瘤细胞特异性的凋亡途径来杀死肿瘤细胞。
实施例5、肿瘤耙向性腺相关病毒rAAV-hTERT-hTRAIL在裸鼠体内治疗肿瘤细胞移 植瘤
将4-5周龄的雌性裸鼠皮下接种肝癌细胞株SMMC7721，每只老鼠为5xl()S细胞，12天 后当肿瘤达到100 150mm3进行动物分组。治疗组给予5xl01Q v.g/mice的 rAAV-hTERT-hTRAIL进行治疗，对照组分两组，第1组是磷酸缓冲液(PBS)处理组，第 2组用相同剂量的rAAV-hTERT-EGFP进行治疗，试验结果如图6所示。
由图6的结果可见，rAAV-hTERT-hTRAIL较rAAV-hTERT-EGFP能显著抑制肿瘤的生 长，并延长荷瘤裸鼠生命周期。
最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明 不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直 接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
序列表
SEQIDNO: 1tggcccctcc ctcgggttac cccacagcct aggccgattc gacctctctc cgctggggcc 60
ctcgctggcg tccctgcacc ctggggggag cgcgagcggc gcgcgggcgg ggaagcgcgg 120
cccagacccc cgggtccgcc cggagcagct gcgctgtcgg ggccaggccg ggctcccagt 180
ggattcgcgg gcacagacgc ccaggaccgc gctccccacg tggcggaggg actggggacc 240
cgggcacccg tcctgcccct tcaccttcca gctccgcctc ctccgcgcgg accccgcccc 300 gtcccgaccc ctcccggtcc ccgcccagcc ccctccggcc ctcccagccc ctccccttcc 360 tttccgcggc cccgccctct cctcgcggcg gcatttcagg cagccgtgcg tcctgctgcc 420
gacgtgggaa gccctggccc cggcaccccc gcgatg 45权利要求
l、一种肿瘤靶向性腺相关病毒载体系统rAAV-hTERT-gene的构建方法，其特征在于用肿瘤特异性hTERT启动子控制腺相关病毒所携带的外源基因表达，构建成具有肿瘤靶向性、且可任意插入一种具有抗癌作用治疗基因的腺相关病毒载体系统rAAV-hTERT-gene。
2、 根据权利要求l所述的肿瘤耙向性腺相关病毒载体系统rAAV-hTERT-gene的构建方法， 其特征在于包括以下步骤1) 、设计hTERT启动子两端特异性引物，用PCR方法，以人肝癌细胞株SMMC-7721的 DNA基因组为模板，所得到的PCR产物为hTERT启动子—378 +78nt序列；2) 、用限制性内切酶将腺相关病毒载体pAAV-MCS的启动子CMV去掉，并替换成上述 hTERT启动子，得到肿瘤耙向性腺相关病毒载体pAAV-hTERT-gene;3) 、 利用腺相关病毒重组系统，pAAV-hTERT-gene、 pAAV-RC和pHelper三质粒共转染 AAV293细胞，得到肿瘤靶向性腺相关病毒载体系统rAAV-hTERT-gene。
3、 按照权利要求1或2所述方法构建的肿瘤耙向性腺相关病毒rAAV-hTERT-hTRAIL,其 特征在于该病毒为肿瘤靶向性腺相关病毒载体系统rAAV-hTERT-gene携带具有广泛选择性 抗肿瘤活性的hTRAIL基因。
4、 如权利要求3所述的肿瘤靶向性腺相关病毒rAAV-hTERT-hTRAIL的构建方法，其特 征在于包括以下步骤1) 、设计hTRAIL基因两端特异性引物，在其上设计特异限制性内切酶位点便于克隆， 应用RT-PCR的方法从健康人外周血克隆出全长人hTRAIL基因；2) 、 将hTRAIL基因克隆入pAAV-hTERT-gene中，得到含hTRAIL基因的载体 pAAV-hTERT-hTRAIL;3) 、 利用腺相关病毒重组系统，pAAV-hTERT-hTRAIL、 pAAV-RC和pHelper三质粒共 转染AAV293细胞，得到肿瘤靶向性重组病毒rAAV-hTERT-hTRAIL。
全文摘要
本发明公开了一种肿瘤靶向性腺相关病毒载体系统rAAV-hTERT-gene的构建方法用肿瘤特异性hTERT启动子控制腺相关病毒所携带的外源基因表达，构建成具有肿瘤靶向性、且可任意插入一种具有抗癌作用治疗基因的腺相关病毒载体系统rAAV-hTERT-gene。本发明还公开了按照上述方法构建的肿瘤靶向性腺相关病毒rAAV-hTERT-hTRAIL该病毒为肿瘤靶向性腺相关病毒载体系统rAAV-hTERT-gene携带具有广泛选择性抗肿瘤活性的hTRAIL基因。采用本发明方法能构建出安全、高效的肿瘤靶向性腺相关病毒。
文档编号C12N15/86GK101173299SQ200710071560
公开日2008年5月7日 申请日期2007年10月9日 优先权日2007年10月9日
发明者刘新垣, 姜永厚, 张义玲, 王毅刚, 程 钱, 芳 黄 申请人:浙江理工大学