一种猪瘟病毒基因重组腺病毒载体疫苗兔体效力检验方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术检测领域，具体涉及一种新型猪瘟病毒基因重组腺病毒载体 疫苗效力检验方法。
【背景技术】
[0002] 猪瘟（CSF)是由黄病毒科瘟病毒属的猪瘟病毒（Classical swine fever virus， CSFV)引起的一种猪的高度接触性传染病，死亡率极高，给世界养猪业造成了巨大的经济损 失。我国面对这样烈性的染病一般都是采用疫苗和疫苗接种来提前预防，降低发病率和死 亡率。猪瘟疫苗的发展经历了早期的灭活疫苗、弱毒疫苗、基因工程疫苗。目前广泛使用 的是弱毒疫苗，我国批准使用的弱毒疫苗是由中国兽医药品监察所研制的猪瘟兔化弱毒疫 苗。长期以来，猪瘟兔化弱毒疫苗的普遍使用，使CSFV野毒株及兔化弱毒抗原发生了变异， 出现了慢性感染、隐性感染等非典型流行形式，很难区分猪群中的疫苗免疫猪和野毒感染 猪，致使疫情难以控制，或造成免疫失败，这不但影响猪群中猪瘟的净化，而且给出口造成 障碍。为此，研制更安全、更高效可以进行鉴别诊断的新型基因工程标记疫苗是全世界养猪 业的迫切要求。
[0003] 本实验室从pMD18-T-E0质粒、pMD18-T-E2质粒中扩增编码E0、E2基因，构建 重组腺病毒穿梭质粒pAd Track-E0、pAd Track-E2。通过PET32a载体将E0和E2基因 串联，形成PET-E0-E2,然后再将E0-E2克隆到腺病毒穿梭载体上得到重组腺病毒穿梭 质粒pAd Track-E0-E2，转化到大肠杆菌BJ5183感受态细胞中，得到重组腺病毒骨架载 体pAd Easy-E0-E2,转染人胚胎肾细胞（HEK293)，获得了含有目的基因的重组腺病毒 (rAd-E0-E2)〇
[0004] 疫苗效力是评价疫苗质量的关键指标。生物制品研发、生产企业由于生产疫苗批 次的不同，常常会导致最小免疫剂量有所差异。因此，对于每一种新研发出的疫苗有必要 建立一种有针对性的配套检测该疫苗最小免疫剂量的方法。rAd-E0-E2作为本实验室最 新研发的基因工程活载体疫苗，鉴于其没有一个更加稳定、简便、节省成本的疫苗效力评价 标准。为此，我们建立了一种用于rAd-E0-E2的兔体效检模型，并确定其评价标准：将SPF 兔接种10倍梯度稀释的rAd-E0-E2,14d后用猪瘟脾淋毒（1头份）攻毒，通过攻毒兔的体 温变化、脾重/体重指数比（％ )、脾脏病理组织变化、RT-PCR和IFA等评价方法共同判断 rAd-E0-E2在兔体的免疫保护效力。该方法用小动物兔子代替了大动物猪，大大节省了生产 检验成本；而且该检验方法使用的兔子均为SPF兔（无外源病毒和抗体干扰），其生产性能 和质量标准较猪更加稳定，可以进行疫苗生产质量评价应用。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供一种新型猪瘟病毒基因重组腺病毒载体疫苗兔体效力检验 的方法，该方法主要按照如下步骤：
[0006] l.rAd-E0-E2冻干疫苗按照不同的稀释梯度（107_°、106_°、10 5_°IFU/ml)免疫兔体后 第14天，用猪瘟脾淋毒（1头份）接种兔的耳缘静脉攻毒，于攻毒后连续3天每6h检测兔 体反应热；
[0007] 2.攻毒后第3天剖杀兔，称兔体重和脾脏重量，计算兔脾脏/体重指数比；
[0008] 3.将兔脾脏放于10%福尔马林固定、做组织切片，显微镜观察兔脾病理学变化；
[0009] 4.将兔脾称取lg提取脾脏总RNA，采用RT-PCR方法检测猪瘟脾淋毒的存留情况；
[0010] 5.将兔脾组织低温下研磨，通过0. 22um滤膜过虑除菌，滤液接种ST细胞，盲传3 代后，进行IFA鉴定是否有猪瘟脾淋毒感染细胞；
[0011] 6.判定方法：当兔体温均<40. 5°C、兔脾脏/体重指数比mean彡0.055%、兔脾 组织显微观察未出现充淤血、RT-PCR均检测不到猪瘟脾淋毒基因存留和IFA病毒分离均为 阴性同时成立时，判为该疫苗保护兔体免受猪瘟脾淋毒的攻击；当其中任何一项检测均不 在此范围内时，判为该疫苗未能保护兔免受猪瘟脾淋毒的攻击。
[0012] 通过此方法来评价该疫苗的保护效力和最小免疫剂量为107_°IFU/ml，建立了 rAd-E0-E2兔体效力检验方法，可以更加稳定、简便、节省成本的评价该疫苗的免疫效力，从 而弥补现有技术的不足。
【附图说明】
[0013] 图1:免疫前、后体温测定及结果图， 图2 :攻毒前、后体温测定及结果图， 图3 :攻毒后脾重/体重指数比图， 图4 :攻毒后脾脏病理变化图。
【具体实施方式】 实施例1 :新型猪瘟病毒基因重组腺病毒载体疫苗兔体效力检验方法的建立
[0014] 1. 1试验用毒、疫苗、试验动物
[0015] 猪瘟重组腺病毒疫苗（rAd-E0-E2,彡2X 107_°IFU/瓶，测定方法详见专利：张恒， 范根成，杜元钊，等.一种猪瘟病毒基因重组腺病毒载体疫苗病毒含量测定方法[P].中华 人民共和国国家知识产权局.CN 104535764 A，2015. 04. 22)，由青岛易邦生物工程有限公 司技术中心冻干保存；猪瘟活疫苗（兔源）简称猪瘟脾淋毒，批号201401，20头份/瓶，由 本公司冻干苗车间生产；1. 5~3kg健康易感家兔购自青岛康大。
[0016] 1. 2免疫方法及免疫前、后体温测定及结果
[0017] 体重为1. 5~3kg健康易感家兔28只，购回后第3d上下午，各测温1次，连续测 3d，从28只兔子中挑选体温波动不大的20只，随机分成5组，每组4只，采用猪瘟脾淋毒作 为阳性对照组和生理盐水作为阴性对照组，按照下表1进行免疫接种；同时上下午各测体 温1次，连续测3d，测温结果详见图1。
[0018] 表1免疫接种
[0019]
[0020] 1. 3攻毒前、后体温测定及结果
[0021] 免疫后第14d攻毒，用无菌生理盐水将每头份猪瘟脾淋毒稀释150倍，通过耳静脉 注射给每组家兔，攻毒剂量为lml/只，攻毒前2天和攻毒当天上下午各测体温1次，24小时 后，每隔6h测体温1次，连续测3d至体温恢复正常。结果详见图2。
[0022] 1.4攻毒后脾重/体重指数比
[0023] 将攻毒后体温恢复正常的家兔称重、剖杀取脾脏称重，计算脾重/体重百分比 (% )，通过说明不同稀释度的rAd-E0-E2和猪瘟脾淋毒免疫保护组与未保护对照组组的差 异是否显著（P < 0. 05);经脾重/体重指数比分析发现，107_°IFU组与105_°IFU组、107_°IFU 组与对照组差异显著（P〈〇.〇5);猪瘟脾淋苗组与105_°IFU组、猪瘟脾淋苗组与对照组异 显著（P〈0. 05);然而，107_°IFU组与106_°IFU组、107_°IFU组与猪瘟脾淋苗组、10 6_°IFU组与 105_ °IFU组、106_ °IFU组与猪瘟脾淋苗组、106_°IFU组与对照组、105_°IFU组与对照组差异不显 著（P>0.05)。（详见图 3)。
[0024] 1. 5攻毒后脾脏病理变化
[0025] 将脾脏做病理组织切片，观察脾脏的病理变化。将攻毒后体温趋于正常的兔子解 剖，取脾脏做石蜡切片，显微镜下观看脾脏病理组织变化（图4A-F)。10 7_°IFU组（图4-A) 攻毒后脾组织切片未见充血、淤血；l〇6_°IFU组（图4-B)攻毒后脾组织切片未见充血、淤血， 而10 6